Lisado Plasmático Rico em Plaquetas para Tratamento de Doenças da Superfície Ocular

Resumo

Os lisados plaquetários representam uma ferramenta emergente para o tratamento de doenças da superfície ocular. Aqui, propomos um método para o preparo, dispensação, armazenamento e caracterização do lisado plaquetário coletado de doadores de plaquetas.

Resumo

Várias doenças da superfície ocular são tratadas com colírios derivados do sangue. Seu uso foi introduzido na prática clínica por causa de seu conteúdo de metabólito e fator de crescimento, o que promove a regeneração da superfície ocular. Os colírios à base de sangue podem ser preparados a partir de diferentes fontes (ou seja, doação de sangue total ou aférese plaquetária), bem como com diferentes protocolos (por exemplo, diferentes diluições e ciclos de congelamento/descongelamento). Essa variabilidade dificulta a padronização dos protocolos clínicos e, consequentemente, a avaliação de sua eficácia clínica. O pormenor e a partilha dos procedimentos metodológicos podem contribuir para a definição de orientações comuns. Nos últimos anos, os produtos alogênicos vêm se difundindo como alternativa aos tratamentos autólogos, uma vez que garantem maiores padrões de eficácia; entre eles, os colírios de lisado plasmático rico em plaquetas (PRP-L) são preparados com procedimentos de fabricação simples. Na unidade de medicina transfusional da AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Itália, o PRP-L é obtido a partir da doação de aférese plaquetária. Este produto é inicialmente diluído a 0,3 x 10 9 plaquetas/mL (a partir de uma concentração média de 1 x 10 9 plaquetas/mL) em NaCl a^0,9%. As plaquetas diluídas são congeladas/descongeladas e, posteriormente, centrifugadas para eliminar detritos. O volume final é dividido em alíquotas de 1,45 mL e armazenado a -80 °C. Antes de serem dispensados aos pacientes, os colírios são testados quanto à esterilidade. Os pacientes podem armazenar lisados plaquetários a -15 °C por até 1 mês. A composição do fator de crescimento também é avaliada a partir de alíquotas selecionadas aleatoriamente, e os valores médios são relatados aqui.

Introdução

Os produtos derivados do sangue são amplamente utilizados no cuidado de feridas¹, cirurgia maxilofacial e ortopédica e para o tratamento de diferentes doenças da superfície ocular², como a doença do olho seco (DED)³. Na DED, a homeostase do filme lacrimal é prejudicada como consequência do funcionamento anormal de diferentes fatores envolvidos na produção de lágrimas e na integridade da superfície ocular ^4,5.

A DED é caracterizada por heterogeneidade de causas e gravidade ^6,7,8 e pode ser consequência de diferentes fatores como envelhecimento, sexo⁹, lentes de contato^, medicamentos tópicos ou sistêmicos 10 ou condições pré-existentes como a síndrome de Sjögren ¹⁰. Apesar de apresentar sintomas leves, a DED acomete milhões de pessoas em todo o mundo, impactando sua qualidade de vida e também o sistema de saúde⁶.

Muitos tratamentos têm sido relatados para essa patologia, mas ainda não há consenso sobre a solução mais eficaz¹². Até o momento, as lágrimas artificiais são a primeira linha de terapia voltada para restaurar a composição aquosa do filme lacrimal, embora esses substitutos não contenham os principais solutos biologicamente ativos das lágrimas naturais ^6,11. Os produtos à base de plaquetas são considerados uma alternativa válida^12,13 às lágrimas artificiais, embora sua eficácia clínica^, recomendações de uso e métodos de preparação ainda sejam motivo de debate³.

Os produtos à base de sangue compartilham com as lágrimas uma composição semelhante em termos de metabólitos¹⁴, proteínas, lipídios, vitaminas, íons, fatores de crescimento (GFs), compostos antioxidantes 11 e osmolaridade (300 mOsm/L)¹¹. Por meio da atividade sinérgica de seus componentes, promovem a regeneração do epitélio corneano, inibem a liberação de citocinas inflamatórias e aumentam o número de células caliciformes e a expressão de mucinas na conjuntiva ^2,3.

Até o momento, a heterogeneidade em produtos oftálmicos à base de sangue tem sido documentada na literatura; esses produtos podem ser classificados de acordo com a origem do doador de sangue, ou seja, autólogo ou alogênico, bem como a fonte sanguínea, ou seja, sangue periférico, sangue do cordão umbilical, soro ou plaquetas.

Embora os produtos autólogos tenham sido os mais difundidos³, os alogênicos estão se tornando a escolha preferida, uma vez que garantem maiores padrões de eficácia e segurança 15, juntamente com uma redução significativa nos custos^16,17. Estudos prévios, de fato, comprovaram que produtos à base de sangue obtidos de pacientes com doenças autoimunes e/ou sistêmicas podem apresentar qualidade e funcionalidade alteradas 6,16,17. Apesar de os colírios à base de soro serem os mais difundidos, os produtos à base de plaquetas estão se firmando recentemente como uma alternativa válida, pois podem ser facilmente preparados mantendo níveis significativos de eficácia ^3,11. Os produtos à base de plaquetas atualmente disponíveis podem ser divididos em plasma rico em plaquetas (PRP), lisado plasmático rico em plaquetas (PRP-L) e plasma rico em fatores de crescimento (PRGF)³.

Entre eles, o PRP-L tem a vantagem de ser um produto congelado de longa duração. O PRP-L pode ser preparado a partir de aférese, buffy-coats, ou mesmo de plaquetas expirantes (PLTs)^18,19, reduzindo preciosamente seu desperdício. As alíquotas podem ser armazenadas por meses nos centros de transfusões de sangue a -80 °C ou mesmo nas casas dos pacientes a -15 °C por períodos mais curtos.

Os PRP-L são altamente enriquecidos em FGs, que comprovadamente estimulam a regeneração da superfície ocular ^12,20,21. No entanto, são poucos os estudos clínicos relatados nessa área, e todos utilizaram fontes autólogas ^3,22. O PRP-L ainda necessita de validação e caracterização adicionais antes de poder ser utilizado rotineiramente para o tratamento de doenças da superfície ocular, uma vez que não existem diretrizes padronizadas para sua preparação, dispensação e armazenamento³.

Neste documento, um protocolo detalhado é compartilhado para a produção de PRP-L usado na Unidade de Medicina Transfusional em AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Itália, e dispensação a pacientes com DED. Nosso objetivo é ajudar a comunidade científica a desenvolver métodos padrão de preparação, que possam aumentar a homogeneidade e a consistência em estudos e abordagens clínicas em todo o mundo.

Protocolo

O PRP-L utilizado para a avaliação quantitativa dos fatores de crescimento foi coletado dentro de um estudo mais amplo sobre a caracterização de produtos PRP para fins regenerativos, realizado na AUSL-IRCCS di Reggio Emilia e aprovado pelo Comitê de Ética da Área Vasta Emilia Nord em 10 de janeiro de 2019 (número de protocolo 2019/0003319). Os doadores deram o seu consentimento esclarecido de acordo com a Declaração de Helsínquia. Nenhuma aprovação ética foi necessária para coletar os dados agregados e anônimos do questionário Ocular Surface Disease Index (OSDI), que é rotineiramente usado por médicos para monitorar os sintomas da síndrome do olho seco. A Figura 1A mostra um esboço do protocolo seguido, enquanto as figuras da Figura 1B retratam as principais etapas do procedimento.

1. Coleta de plasma rico em plaquetas (PRP)

1. Aférese do PRP
   1. Para este protocolo, selecione doadores de plaquetas de acordo com as leis italianas: os doadores de plaquetas devem ter entre 18 e 65 anos de idade, com parâmetros normais de pressão e hemograma e uma contagem plaquetária não inferior a 180 x 10⁹ plaquetas / L²³. Os doadores elegíveis não podem tomar medicamentos antiplaquetários ou anticoagulantes dentro de 1 semana antes da doação.
   2. Realizar plasma-plaquetas-aférese utilizando um sistema automatizado de coleta de sangue, de acordo com as instruções do fabricante e as legislações nacionais²³, para obter 1 unidade de plasma rico em plaquetas (PRP) de doador único. Recolher PRP em solução anticoagulante de citrato de adenina dextrose A (ACD-A).
      NOTA: A aférese plaquetária é realizada com um procedimento contínuo; o tempo de coleta está em um intervalo entre 40 min e 90 min. A quantidade de DAC entregue aos doadores e o tempo dos procedimentos dependem das características do doador, por exemplo, hematócrito e agulha.
2. Características das unidades PRP
   NOTA: A etapa a seguir geralmente é executada automaticamente pelo sistema automatizado de coleta de sangue durante o procedimento de plasma-plaquetas-aférese. Por favor, verifique o manual de instruções do fabricante.
   1. Ressuspender as unidades de PRP coletadas por aférese em quantidade adequada de solução conservante com a quantidade mínima de plasma residual, necessária para manter o pH > 6,4 durante todo o tempo de armazenamento, até um volume final médio de 180 mL líquidos da solução anticoagulante (em torno de 40 mL).
      NOTA: De acordo com a legislação italiana, os controlos de qualidade têm de avaliar que a contagem de plaquetas (PLTs) é de pelo menos 2,0 x^{10 11} PLTs/unidade, enquanto os leucócitos residuais têm de ser inferiores a 1 x 10⁶ células/unidade.
   2. Conservar o PRP leucodepletado e irradiado durante um período máximo de 5 dias a 22 °C ± 2 °C num agitador de plaquetas antes de nova manipulação²³.
3. Diluição do PRP
   1. Imediatamente antes de iniciar a diluição do PRP, realize uma contagem de PLT com um hemocitômetro usando a amostra coletada da bolsa principal através de um espigão perfurante.
      NOTA: Execute as próximas etapas na esterilidade sob um exaustor de risco biológico de classe II. Use equipamentos de proteção individual (jaleco, luvas e óculos) durante o procedimento.
   2. Diluir o PRP com uma quantidade adequada de NaCl estéril a 0,9% até uma concentração final de 0,32 x 10 9 ± 0,03 x 10⁹ PLTs/mL, que simula a concentração média de PLT no sangue periférico.
   3. Aproveitando um pico penetrante para bolsas de sangue, divida o PRP diluído em bolsas de coleta vazias de 300 mL para atingir um volume líquido de 190 mL/bolsa.
   4. Use uma alíquota de PRP diluído residual (geralmente 1 mL) para realizar controles de qualidade avaliando possíveis contaminações microbianas. Realize um ensaio de esterilidade seguindo as instruções do fabricante em um laboratório de microbiologia (consulte Tabela de Materiais).
      NOTA: Utilizar frascos de cultura específicos para hemoculturas aeróbias, que são capazes de realizar a cultura qualitativa e recuperação de microrganismos aeróbios (principalmente bactérias e leveduras) a partir de amostras de sangue de pequeno volume.
   5. Conservar os sacos de PRP diluídos a -80 °C durante um máximo de 2 meses antes do descongelamento.

2. Preparação de lisado plasmático rico em plaquetas (PRP-L)

1. Descongelar
   1. Antes de iniciar o processo de descongelamento, certifique-se de que um banho quente está regulado a 37 °C. Coloque os sacos PRP no banho quente e espere até descongelar completamente.
2. Coleção PRP-L
   1. Centrifugar os sacos PRP a 3000 x g durante 30 min à temperatura ambiente.
      NOTA: Os próximos passos devem ser realizados em esterilidade sob um exaustor de risco biológico de classe II.
   2. Explorando o pico perfurante do saco de transferência, conecte o saco centrifugado com um saco de transferência estéril vazio de 300 mL. Com cuidado, transfira o sobrenadante PRP-L, evitando detritos, para o novo saco. Quando possível, use uma prensa de bolsas.
   3. Sele o tubo de conexão da unidade PRP-L com um selador de saco.
3. Alíquota PRP-L
   NOTA: Uma unidade de partida contendo 190 ml de PRP (ver passo 1.3.3.) é suficiente para preencher dois kits de colírios (para obter detalhes sobre os dispositivos médicos específicos utilizados para a aplicação e preservação de colírios de componentes sanguíneos, consulte a Tabela de Materiais). Os kits de colírios devem ser abertos sob um exaustor de classe II com os frascos para injetáveis de corda inteiros posicionados acima da seringa pré-ligada e a seta central da torneira apontando para a esquerda para excluir o filtro antibacteriano.
   1. Recolher 30-60 ml de PRP-L com uma seringa estéril e ligar a seringa à ligação Luer/bloqueio na linha de enchimento.
   2. De acordo com as instruções do fabricante, gire a torneira pela metade de uma volta para abrir a linha entre a seringa contendo PRP-L e a seringa pré-conectada. Encha a seringa pré-ligada com PRP-L.
   3. Desligue a seringa PRP-L, feche a tampa do tubo da ligação luer/lock e rode a torneira para a posição original. Use a seringa do kit de colírios para encher os frascos para injetáveis com PRP-L.
   4. Repita o procedimento das etapas 2.3.1.-2.3.3. até que todos os frascos para injetáveis aplicadores estejam cheios. Certifique-se de que cada aplicador esteja devidamente preenchido e, em seguida, selá-los individualmente com um selador de sacos.
   5. Repita o procedimento com um novo kit de colírios.
   6. Utilizar uma pequena alíquota de PRP-L diluído residual para avaliar uma possível contaminação microbiana (ver passo 1.3.4.).
      NOTA: Se o líquido atingir acidentalmente o filtro antibacteriano no final da corda, a seringa de sucção pode opor-se à resistência, dificultando o enchimento. Para continuar o ciclo de enchimento, levante a seção final da corda por cerca de 5/6 alíquotas do filtro hidrofóbico antibacteriano no final da corda. Nesta posição, utilize uma nova seringa estéril (de 30 ml de volume) que já tenha sido preenchida com ar. Ligue a luer/trava feminina do filtro antibacteriano e pressione com força e repetidamente o êmbolo da seringa para remover todos os resíduos de componentes sanguíneos e tornar a membrana do filtro antibacteriano livre do líquido. Retire a seringa e encha os restantes frascos para injetáveis.
4. Armazenamento PRP-L
   1. Rotule corretamente cada aplicador e coloque-os em um saco plástico. Rotule o saco plástico também, tomando o cuidado de destacar o grupo sanguíneo do doador.
   2. Armazenar a -80 °C por um período máximo de 24 meses antes da designação do paciente, de acordo com a lei italiana²³ e as diretrizes²⁴.

3. Dispensação de PRP-L

1. Realizar a designação do paciente de preferência combinando o grupo sanguíneo PRP-L. Entregue frascos para injetáveis aplicadores de PRP-L utilizando uma caixa fria e certifique-se de que cada frasco para injetáveis aplicador contém 1,45 ml de PRP-L, o que corresponde a aproximadamente 45 gotas. Instrua o paciente de que os frascos para injetáveis aplicadores podem ser armazenados nas casas dos pacientes por até 1 mês a -15 °C.

Resultados

A justificativa para o uso de colírios derivados do soro (que é o produto à base de sangue mais frequentemente usado para o tratamento de doenças da superfície ocular) reside em seu conteúdo de GFs, que são quase completamente derivados de plaquetas circulantes. O PRP contém um número significativamente maior de plaquetas (e, consequentemente, de GFs derivados de plaquetas) em comparação com o soro do sangue periférico, variando entre 0,15 x 10 9-0,45 x 10⁹ PLTs/mL. De acordo com as leis...

Discussão

Nos últimos anos, o uso clínico de produtos à base de plaquetas para patologias da superfície ocular tem aumentado, mas sua difusão é dificultada pela falta de robustez científica. Isso é causado principalmente pela ampla heterogeneidade nas fontes de doadores e nos protocolos de preparação, que muitas vezes não são totalmente divulgados ou não são projetados especificamente para o propósito para o qual são dispensados. Particularmente, ainda faltam informações sobre produtos à base de plaquetas coleta...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
CompoSeal Mobilea II	Fresenius Kabi, Germany		bag sealer
HeraSafe hood	Heraeus Instruments, Germany		Class II biohazard hood
MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System	Haemonetics, Italy		automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components
Platelet shaker, PF396i	Helmer, USA		Platelet shaker
Raycell X-ray Blood Irradiator	MDS Nordion, Canada		X-ray Blood Irradiator
ROTIXA 50RS	Hettich Zentrifugen, Germany		High speed entrifuge
Sysmex XS-1000i	Sysmex Europe GMBH, Germany		haemocytometer for platelet count
Warm bath, WB-M15	Falc Instruments, Italy		Warm bath
Materials
ACD-A anticoagulant solution A	Fenwal Inc., USA	DIN 00788139	anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml)
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	BD 442020	Sterility assay
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	442020	At least 2 vials for sterility assay
BD Luer Lok Syringe	BD Plastipack, USA	300865	At least 4 sterile syringes (50 ml)
Bio-Plex Human Cancer Panel 1	BioRad Laboratories, USA	171AC500M	Standard panel for PDGF isoforms assessment
Bio-Plex Human Cancer Panel 2	BioRad Laboratories, USA	171AC600M	Standard panel for EGF assessment
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader	BioRad Laboratories, USA	Magpix	This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads.
Bio-Plex Pro TGF-b Assay	BioRad Laboratories, USA	10024984	Set and standards for TGFb isoforms assessment
BioRet	ARIES s.r.l., Italy	A2DH0020	At least 4 piercing spike for blood bags
Blood collection tube	BD Vacutainer, USA	367835	1 tube, necessary to perform platelet counts
Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents	Biomed Device s.r.l., Italy	COLC50	Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected
Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC511	Set for PDGF isoforms assessment
Human Cancer2 EGF Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC603M	Set for EGF assessment
NaCl 0.9% sterile solution	Baxter S.p.A., Italy	B05BB01	1000 ml
OSDI Questionnaire	Allergan Inc., USA	OSDI	Ocular Surface Disease Index Questionnaire
Piercing spike	BioRet ARIES s.r.l., Italy	BS051004	Spike
Platelet Additive Solution A+ T-PAS+	TERUMO BCT Inc., Italy	40842	preservative solution for platelet concentrates (1000 ml)
Software Excel	Microsoft, USA	Excel	Data analysis software
Teruflex Transfer bag 1000 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*T100BM	1 for PRP dilution
Teruflex Transfer bag 300 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*030CM	At least 6 for each PRP unit collected