直肠类器官形态学分析（ROMA）:囊性纤维化的诊断测定

摘要

该协议描述了直肠类器官形态学分析（ROMA），这是一种囊性纤维化（CF）的新型诊断测定。形态特征，即圆度（圆度指数，CI）和流明的存在（强度比，IR），是CFTR功能的量度。对189名受试者的分析表明，CF和非CF之间的区别非常明显。

摘要

囊性纤维化 （CF） 的诊断并不总是那么简单，尤其是当汗液氯化物浓度中等和/或可以识别出少于两个致病的 CFTR 突变时。生理CFTR测定（鼻电位差，肠电流测量）已包含在诊断流程中，但并不总是容易获得或可行（例如，在婴儿中）。直肠类器官是从直肠活检隐窝分离的干细胞生长的3D结构，在特定条件下培养。来自非CF受试者的类器官具有圆形和充满液体的腔，因为CFTR介导的氯化物运输将水驱动到腔中。具有CFTR功能缺陷的类器官不会肿胀，保持不规则形状并且没有可见的管腔。CF和非CF类器官之间的形态差异在"直肠类器官形态学分析"（ROMA）中量化，作为一种新型CFTR生理测定。对于ROMA测定，将类器官接种在96孔板中，用钙黄绿素染色，并在共聚焦显微镜中成像。形态差异使用两个指标进行量化:圆度指数（CI）量化类器官的圆度，强度比（IR）是中央管腔存在的量度。与CF类器官相比，非CF类器官具有高CI和低IR。ROMA指数完美地区分了167名患有CF的受试者和22名没有CF的受试者，使ROMA成为一种有吸引力的生理CFTR测定，以帮助CF诊断。大多数医院的所有年龄段都可以常规进行直肠活检，组织可以送到中心实验室进行类器官培养和ROMA治疗。将来，ROMA也可能用于体 外测试CFTR调节剂的功效。本报告的目的是充分解释用于ROMA的方法，以便在其他实验室中复制。

引言

囊性纤维化（CF）是一种常染色体隐性遗传疾病，由CF跨膜电导调节因子（CFTR）基因突变引起。CFTR蛋白是氯化物和碳酸氢盐通道，确保几个上皮的水合作^用1。CF是一种高负担、缩短寿命的多系统疾病，主要表现为呼吸系统疾病，但也影响胃肠道、胰腺、肝脏和生殖道²。

致病的 CFTR 突变导致CFTR的数量或功能下降，进而导致粘液脱水。已经描述了 CFTR 基因中的2，000多个变异³，其中只有466个被^{彻底表征4}。

当汗液氯化物浓度 （SCC） 高于 60 mmol/L 的阈值或确定出两个致病 CFTR 突变（根据 CFTR2 数据库）时，可以诊断出 CF 4^，5。在仅中度升高（30-60 mmol/L）鳞状细胞癌（发生在约4%-5%的汗液试验中）的受试者中6，以及不同或未知临床后果的CFTR突变，即使他们有CF兼容症状或新生儿^{筛查试验阳性}，也无法确诊或排除诊断。对于这些病例，二线生理CFTR测定（鼻电位差（NPD）和肠电流测量（ICM））已被纳入诊断流程。这些测试在大多数中心并不容易获得，也不是在所有年龄段都可行，尤其是在^{婴儿中 5}.

直肠类器官是从通过直肠活检获得的肠隐窝中的Lgr5（+）成人肠道干细胞生长的3D^结构7。类器官越来越多地用于生物医学研究，例如在CF⁸中测试调节剂治疗。可行的活检可以通过抽吸或镊子活检获得，这种手术仅引起最小的不适，即使在婴儿中也是安全的，^{并发症发生率低}9。从直肠活检中分离的隐窝富含干细胞，并且在特定的培养条件下，这些干细胞自组织成直肠类器官。这些类器官的形态由位于上皮细胞顶膜的CFTR的表达和功能决定。功能性CFTR允许氯化物和水进入类器官腔，从而诱导非CF类器官的肿胀。CF类器官不会膨胀，也没有可见的管腔^10，11。

直肠类器官形态分析（ROMA）允许根据类器官形态的这些差异来区分CF和非CF类器官。非CF类器官更圆，具有可见的管腔，而CF类器官则相反。对于该测定，将患者特异性类器官接种在96孔板的32孔中。生长1天后，将类器官用钙黄绿染色并在共聚焦显微镜中成像。非CF类器官显示出更圆形的形状和较少的荧光中央部分，因为管腔含有液体，而钙黄绿素仅对细胞进行染色。这些形态差异使用两个ROMA指数进行量化:圆形指数（CI）量化类器官的圆度，而强度比（IR）是中央管腔存在与否的量度。在本报告中，我们详细描述了获得这些判别性指标的协议，以允许复制该技术。

研究方案

对于所有涉及人体组织的程序，都获得了伦理委员会研究UZ / KU Leuven（EC研究）的批准。所有研究均在父母、代表和/或患者的知情同意和/或同意下进行。

注意:所有涉及直肠活检和类器官的程序都应在层流中进行，以保护研究人员免受任何生物危害，并将培养物污染的风险降至最低。对于任何实验室程序，研究人员应始终穿着实验室外套，手套和安全护目镜来操作样品。

1.直肠活检、从隐窝分离成体干细胞和类器官培养

1. 对于协议的初始部分，包括培养基生产和使用，类器官培养，生物样本库的分裂，扩增和冷冻，请遵循之前发布的两个协议^8，12。
2. 简而言之，必须采取以下步骤:
   1. 用镊子或抽吸装置进行三到四次直肠活检，并按照上述方案所述，用Ad-DF+++培养基收集在无菌容器（例如1.5mL微量离心管）中。
   2. 将活检运送到冰上或4°C的中心实验室。 可以运输到其他中心，即使运输时间长达48小时，质量也不会受到显着影响。如果预计运输需要6小时以上，请使用15 mL锥形管和6 mL Ad-DF + ++培养基，而不是1.5 mL微量离心管。
   3. 在冷PBS中洗涤活检，直到上清液清除碎片和非上皮组织，例如脂肪组织。
   4. 用EDTA（终浓度10mM）孵育活检以分离隐窝。将隐窝铺在基底膜基质中。在培养的第一周向培养基中添加广谱抗生素（庆大霉素 50 μg/mL 和万古霉素 50 μg/mL），以防止细菌污染。
   5. 当隐窝萌芽并闭合和增殖时，通常在 7 天后进行机械分裂。
   6. 大约每 7 天拆分一次所得类器官。这样，可以扩展培养物，在生物库中冷冻备份样品，或使用类器官进行测定。

2. 罗马类器官电镀（第1天）

1. 机械分割类器官进行电镀
   1. 用冷Ad-DF + ++培养基洗涤两次，从24孔板的三个生长良好的孔中收集类器官，将它们收集在1.5 mL微量离心管中，并在显微镜下评估它们¹²。
   2. 确保类器官是可行的和高质量的，这通常可以在先前分裂后5-7天的生长后实现（图1）。
   3. 根据上述方案^8，12机械地分裂类器官。重复直到使用明场显微镜评估的大多数类器官与初始观察相比足够小。
   4. 收集较小的类器官，通常对应于在新的微量离心管中收集约4/5的类器官介质溶液，因为大的类器官由于重力而沉入管的底部，而小类器官保持悬浮在培养基柱的上部。
   5. 将较小类器官的样品以0.3 x 1000g离心2分钟，然后弃去培养基。
   6. 在 130 μL 40%-50% 基底膜基质（用 Ad-DF+++ 培养基¹² 稀释）中稀释较小类器官的沉淀。
   7. 使用 200 μL 微量移液器重悬良好。
2. 将类器官铺在 96 孔板中
   1. 使用 20 μL 移液器，将类器官接种在预热的 96 孔板的 32 孔中。确保每个孔含有一滴4 μL上一步产生的类器官基质溶液。
   2. 由于重力依赖性的向下位移，溶液中的类器官倾向于在管底部形成颗粒。为防止这种情况并确保均匀电镀，请使用 200 μL 微量移液器定期重悬类物质基质溶液（例如，每次接种 4 至 8 孔后）。
   3. 将每个液滴铺在孔的中心，以防止液滴流向井的边缘，这会降低以后的图像质量。
   4. 目标是每孔约30个类器官（最少15个，最多90个），没有重叠的类器官。
   5. 请记住，这些类器官必须孵育过夜，并且在此期间会略微生长，如果电镀密度过高，可能会开始重叠。
   6. 电镀前一个或两个孔后，使用具有5倍放大镜的明场显微镜检查电镀密度。
   7. 如果电镀密度太高，则通过添加基底膜基质逐步稀释类器官基质溶液，直到达到所需的电镀密度（图2）。
   8. 电镀后，在平坦的表面上轻轻敲击板，以确保大多数类器官位于同一焦平面上。
3. 孵育板
   1. 将96孔板在37°C和5%CO₂ 下孵育8-10分钟，以使基底膜基质凝胶化。
   2. 在每个孔中加入 50 μL 人结肠类器官培养基 +/+¹² ，孵育过夜 16-24 小时。
   3. 不添加毛喉素或CFTR调节剂，因此类器官在基础条件下生长。

3. 使用共聚焦显微镜进行类器官成像（第 2 天）

1. 用钙黄绿染色类器官
   1. 通过将 50 μL 二甲基亚砜 （DMSO） 添加到一个含有 50 μg 钙黄绿的小瓶中，制备 1 mM 钙黄绿储备溶液。
   2. 通过将 1.2 μL 储备溶液添加到 200 μL Ad-DF+++（浓度 6 μM）中来制备钙黄绿的工作溶液。
   3. 向接种类器官的96孔板的每个孔中加入5μL该钙黄绿素混合物（最终钙黄绿素浓度0.6μM）。执行此步骤时，请勿触摸孔内的基质液滴并使其脱臼。
   4. 旋转并稍微倾斜板，盖上盖子几次，以确保钙黄绿在整个孔中的均匀分布。
   5. 再次将板在37°C和5%CO₂ 下孵育15-30分钟，以确保孔中所有类器官的染色。
2. 将板转移到共聚焦显微镜上
   1. 将板转移到具有自动载物台和集成培养箱的共聚焦显微镜上。确保板很好地固定在板架中。
   2. 鉴于成像过程的持续时间短（约10分钟），在37°C和5%CO₂ 下孵育是可选的，但不是必需的。
3. 专注于类器官（图3）
   1. 使用共聚焦显微镜，手动确定每个孔中类器官的最佳x/y位置和焦点（z位置），并将这些位置保存在成像软件中。
   2. 最佳聚焦意味着类器官的描绘尽可能清晰，并可视化类器官液滴的最大可能部分。如果染色剂的分布不充分，请重复步骤3.1.4和3.1.5（例如，再孵育5-10分钟）。
   3. 使用488 nm发射和515 nm激发（特定于钙黄绿素荧光可视化）和5倍LD放大镜的活细胞成像设置。
4. 使用共聚焦显微镜获取32孔的类器官图像（图3 和 图4）。
   1. 以分辨率为 1024 像素 x 1024 像素（像素大小 2.5 μm x 2.5 μm）和深度为 16 位的单向方式拍摄图像。
   2. 选择激光强度和主增益，以最佳方式可视化 CF 和非 CF 类器官之间的形态差异（例如，区分未染色的充满水的中心腔（如果存在）和染色的细胞边界）。
      注意:当主增益和荧光信号太低时，将无法正确描述类器官;将主增益设置得太高将导致类器官的图像具有均匀的非常高的信号强度，从而阻止对更细微的形态差异进行成像（图2）。
   3. 以显微镜格式为所有32孔的每个孔保存一张图片，并将其导出为TIFF文件。

4. 图像分析（图5）

1. 在图像分析软件中加载TIFF文件。
2. 根据操作员确定的排除标准执行第一次质量检查（图2）:许多分化或死结构或碎片，镀层密度不足，类器官过多（例如重叠）或太少，以及荧光分布不足（类器官未明确描述，背景信号过高）。
   注意:在步骤 3.4 中将图像导出为 TIFF 文件之前，也可以执行此步骤。
3. 准备要分析的图像
   1. 重新校准图像，使 1 个像素对应于 2.5 μm x 2.5 μm。
   2. 创建并打开一个网络数据 （.ND）文件，每个类器官培养物的所有32张图片，可以同时分析每个受试者的所有32张图片。
4. 描绘类器官
   1. 使用强度下限阈值 4，500 和上限阈值 65，535 描绘结构（平滑 和 清洁 功能关闭; 填充孔 功能开启; x3 处的独立 功能）。
      注意:这描绘了荧光结构， 填充孔 包括描绘结构中的腔（如果存在）。
5. 计算类器官
   1. 选择所有结构≥40 μm。
   2. 单击 更新 ND 测量按钮（每次需要测量时）;计数的类器官将被编号。
      注意:这等于32孔中类器官的总数，而小碎片，如死细胞，被排除在外。
6. 测量强度和圆度以计算指标
   1. 选择所有结构≥60 μm并计数。
      注意:这计算了足够大的类器官，以显示CF或非CF的典型形态。类器官>40 μm 和 <60 μm 在非 CF 和 CF 中都体积小且致密。
   2. 删除所有接触图片边框的结构。这样做是为了去除不完全可见的类器官，因为它们的形态无法准确量化。
   3. 从每个 ≥60 μm 结构的边界侵蚀 1 个像素 （= 2.5 μm）。这消除了类器官周围弥漫性钙黄绿素荧光的光晕。
   4. 测量每个结构的平均强度。通过这种方式，可以测量类器官的平均荧光。
   5. 再次选择所有结构≥60 μm，并删除所有接触边界的结构。
   6. 从每个 ≥60 μm 结构的边界侵蚀 10 个像素 （= 25 μm）。
      注意:在非CF类器官中，这会侵蚀细胞边界，只留下管腔。在CF类器官中，这会侵蚀类器官的外部，其荧光与残留的内部部分大致相同。
   7. 测量每个侵蚀结构的平均强度。通过这种方式，可以测量类器官中心部分的平均荧光。
   8. 测量每个结构的循环度。这对应于类器官的平均圆度。
7. 执行第二次质量检查:由软件确定的排除标准。当少于 50% 的类器官（定义为结构 ≥40 μm）≥60 μm 时，排除图片集，因为足够的类器官应该足够大以显示 CF 或非 CF 的典型形态。当 32 个孔中存在 <500 或 >3，000 个类器官（定义为结构 ≥40 μm）时，也排除。

5. 在成像软件中测量指数（图6）

1. 测量循环指数（CI）。
   注意:这对应于步骤4.6中测量的平均圆度，即所有32个孔中所有类器官的平均圆度。CI 量化类器官的圆度，定义为 ，CF 中的圆度低于非 CF 类器官
2. 测量强度比 （IR）
   1. 通过将从每个≥60μm结构的边界侵蚀25μm后的强度测量平均值除以从每个≥60μm结构的边界侵蚀2.5μm后的强度测量平均值来计算IR。
      注意:IR 测量中央管腔的存在与否。CF 中的 IR 等于 ，并且高于非 CF 类器官。
3. 简化分析过程
   1. 使用电子表格软件准备一个标准工作表，以便在复制数据时自动计算这些索引（图 7）。
   2. 要计算 IR:
      1. 从每个≥60μm结构的边界侵蚀2.5μm后进行强度测量。使用均值进行计算（分母）。
      2. 从每个≥60μm结构的边界侵蚀25μm后进行强度测量。使用平均值进行计算（分子）。
   3. 要计算置信区间，请取所有孔中所有类器官的圆度。均值对应于置信区间。
      注意:当需要分析大批量图像时，第4节中所述的图像分析过程可以是半自动化的，从校准的ND文件开始，并运行一个包含所有步骤的宏。

结果

在常规临床访问期间收集了212名受试者的类器官。在直肠活检过程中或之后未发生不良事件。类器官由一名对基因型和临床信息等受试者特征不知情的研究人员进行成像。由于图像质量低下，23名受试者被排除在外。类器官培养和图像采集成功和失败的示例如图 2所示。

分析了 167 名患有 CF 和两种致病 CFTR 突变（由 CFTR2 数据库⁴ ?...

讨论

我们为直肠类器官形态分析（ROMA）提供了详细的方案。用ROMA，IR和CI计算的两个指标将类器官与有CF的受试者与没有CF的受试者区分开来，非常准确。因此^，ROMA可以作为一种新型生理CFTR测定，补充SCC和其他目前可用的测试¹³，^14，15。

该方案依赖于肠道类器官的使用，当CFTR起作用时，肠道类器官具有圆形和...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Sorenson	17040
15 mL conical tubes	VWR	525-0605
24 well plates	Corning	3526
96 well plates	Greiner	655101
Brightfield microscope	Zeiss	Axiovert 40C
Centrifuge	Eppendorf	5702
CO2 incubator	Binder	CB160
Computer	Hewlett-Packard	Z240
Confocal microscope	Zeiss	LSM 800
Laminar flow hood	Thermo Fisher	51025413
Material for organoid culture as detailed in previous protocol10
Micropipettes (20, 200, and 1000 µL)	Eppendorf	3123000039, 3123000055, 3123000063
Microsoft Excel	Microsoft	Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit	Spreadsheet software
NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software	Nikon	v.5.02.00	Imaging software
Pipette tips (20, 200, and 1000 µL)	Greiner	774288, 775353, 750288
Zeiss Zen Blue software	Zeiss	v2.6	Imaging software