Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, kistik fibroz (KF) için yeni bir tanısal test olan rektal organoid morfoloji analizini (ROMA) tanımlamaktadır. Morfolojik özellikler, yani yuvarlaklık (dairesellik indeksi, CI) ve bir lümenin varlığı (yoğunluk oranı, IR), CFTR fonksiyonunun bir ölçüsüdür. 189 deneğin analizi, CF ve CF olmayan arasında mükemmel bir ayrım olduğunu göstermiştir.

Özet

Kistik fibrozis (KF) tanısı her zaman kolay değildir, özellikle ter klorür konsantrasyonu orta ve / veya ikiden az hastalığa neden olan CFTR mutasyonları tanımlanabilir. Fizyolojik CFTR testleri (nazal potansiyel fark, bağırsak akımı ölçümü) tanı algoritmasına dahil edilmiştir, ancak her zaman hazır veya uygulanabilir değildir (örneğin, bebeklerde). Rektal organoidler, belirli koşullar altında kültürlendiğinde rektal biyopsi kriptlerinden izole edilen kök hücrelerden büyüyen 3D yapılardır. CF olmayan deneklerden gelen organoidler yuvarlak bir şekle ve sıvı dolu bir lümene sahiptir, çünkü CFTR aracılı klorür taşınması suyu lümene yönlendirir. Kusurlu CFTR fonksiyonuna sahip organoidler şişmez, düzensiz bir şekil alır ve görünür lümeni yoktur. KF ve KF olmayan organoidler arasındaki morfolojideki farklılıklar, yeni bir CFTR fizyolojik testi olarak 'Rektal Organoid Morfoloji Analizi'nde (ROMA) ölçülmüştür. ROMA testi için, organoidler 96 delikli plakalar halinde kaplanır, kalsein ile boyanır ve konfokal mikroskopta görüntülenir. Morfolojik farklılıklar iki indeks kullanılarak ölçülür: Dairesellik indeksi (CI) organoidlerin yuvarlaklığını ölçer ve yoğunluk oranı (IR) merkezi bir lümenin varlığının bir ölçüsüdür. CF olmayan organoidler, CF organoidlerine kıyasla yüksek CI ve düşük IR'ye sahiptir. ROMA indeksleri, CF'siz 22 denekten KF'li 167 deneği mükemmel bir şekilde ayırt etti ve ROMA'yı KF tanısına yardımcı olmak için çekici bir fizyolojik CFTR testi haline getirdi. Rektal biyopsiler çoğu hastanede her yaşta rutin olarak yapılabilir ve doku organoid kültür ve ROMA için merkezi bir laboratuvara gönderilebilir. Gelecekte, ROMA in vitro CFTR modülatörlerinin etkinliğini test etmek için de uygulanabilir. Bu raporun amacı, ROMA için kullanılan yöntemleri tam olarak açıklamak ve diğer laboratuvarlarda replikasyona izin vermektir.

Giriş

Kistik fibroz (KF), KF transmembran iletkenlik regülatörü (KFTR) genindeki mutasyonların neden olduğu otozomal resesif geçişli bir hastalıktır. CFTR proteini, birkaç epitel1'in hidrasyonunu sağlayan bir klorür ve bikarbonat kanalıdır. KF, öncelikle solunum yolu hastalığı olarak kendini gösteren, aynı zamanda gastrointestinal sistemi, pankreası, karaciğeri ve üreme sistemini de etkileyen, yüksek yüklü, yaşamı kısaltan, çok sistemli bir hastalıktır2.

Hastalığa neden olan CFTR mutasyonları, CFTR'nin miktarında veya fonksiyonunda bir azalmaya yol açar ve bu da mukus dehidrasyonun....

Protokol

İnsan dokusunu içeren tüm prosedürler için Etik Kurul Araştırma UZ/KU Leuven (EC araştırması) tarafından onay alınmıştır. Tüm araştırmalar bilgilendirilmiş onam ve / veya ebeveynlerin, temsilcilerin ve / veya hastaların onayı ile gerçekleştirilmiştir.

NOT: Rektal biyopsileri ve organoidleri içeren tüm prosedürler, araştırmacıyı herhangi bir biyolojik tehlikeden korumak ve kültürlerin kontaminasyon riskini en aza indirmek için laminer bir akışta yapılmalıdır. Herhangi bir laboratuvar prosedürüne gelince, araştırmacılar numuneleri manipüle etmek için her zaman laboratuvar önlüğü, eldiven ve güvenlik gözlüğü giymelidir.

Sonuçlar

Rutin klinik ziyaretler sırasında 212 denekten organoidler toplandı. Rektal biyopsi prosedürü sırasında veya sonrasında herhangi bir yan etki meydana gelmedi. Organoidler, genotip ve klinik bilgi gibi özne özelliklerine kör olan bir araştırmacı tarafından görüntülendi. Düşük kaliteli görüntüler nedeniyle, 23 denek hariç tutuldu. Başarılı ve başarısız organoid kültürlere ve görüntü edinimine örnekler Şekil 2'de görülebilir.

K.......

Tartışmalar

Rektal organoid morfoloji analizi (ROMA) için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. ROMA, IR ve CI ile hesaplanan iki indeks, organoidleri CF'li deneklerden CF'siz olanlardan mükemmel doğrulukla ayırdı. ROMA böylece SCC'yi ve şu anda mevcut olan diğer testleri 13,14,15'i tamamlayan yeni bir fizyolojik CFTR testi olarak işlev görebilir.

Protokol, CFTR işlevsel olduğunda yuvarlak bir şekle v.......

Açıklamalar

Bu çalışma, Belçika KF hastaları derneği "Mucovereniging / Association Muco", Belçika Pediatri Derneği BVK-SBP 2019 Araştırma Bursu ve UZ Leuven Translasyonel Biyomedikal Araştırma Fonu'ndan bir hibe tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışmaya katılan hasta ve velilere teşekkür ederiz. Abida Bibi'ye organoidlerle yaptığı tüm kültür çalışmaları için teşekkür ederiz. Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz ve Bernard Wenderickx'e lojistik destek için teşekkür ederiz. Ayrıca Mucovereniging/Association Muco'ya ve özellikle Stefan Joris ve Dr. Jan Vanleeuwe'ye destekleri ve finans....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubesSorenson17040
15 mL conical tubesVWR525-0605
24 well platesCorning3526
96 well platesGreiner655101
Brightfield microscopeZeissAxiovert 40C
CentrifugeEppendorf5702
CO2 incubatorBinderCB160
ComputerHewlett-PackardZ240
Confocal microscope ZeissLSM 800
Laminar flow hoodThermo Fisher51025413
Material for organoid culture as detailed in previous protocol10
Micropipettes (20, 200, and 1000 µL)Eppendorf3123000039, 3123000055, 3123000063
Microsoft ExcelMicrosoftMicrosoft Excel 2019 MSO 64-bitSpreadsheet software
NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software Nikonv.5.02.00Imaging software
Pipette tips (20, 200, and 1000 µL)Greiner774288, 775353, 750288
Zeiss Zen Blue software Zeissv2.6Imaging software

Referanslar

  1. Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).
  2. Castellani, C., et al. ECFS best practice guidelines:....

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Araştırma

Eğitim

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır