Rektal Organoid Morfoloji Analizi (ROMA): Kistik Fibroziste Tanısal Bir Tahlil

Özet

Bu protokol, kistik fibroz (KF) için yeni bir tanısal test olan rektal organoid morfoloji analizini (ROMA) tanımlamaktadır. Morfolojik özellikler, yani yuvarlaklık (dairesellik indeksi, CI) ve bir lümenin varlığı (yoğunluk oranı, IR), CFTR fonksiyonunun bir ölçüsüdür. 189 deneğin analizi, CF ve CF olmayan arasında mükemmel bir ayrım olduğunu göstermiştir.

Özet

Kistik fibrozis (KF) tanısı her zaman kolay değildir, özellikle ter klorür konsantrasyonu orta ve / veya ikiden az hastalığa neden olan CFTR mutasyonları tanımlanabilir. Fizyolojik CFTR testleri (nazal potansiyel fark, bağırsak akımı ölçümü) tanı algoritmasına dahil edilmiştir, ancak her zaman hazır veya uygulanabilir değildir (örneğin, bebeklerde). Rektal organoidler, belirli koşullar altında kültürlendiğinde rektal biyopsi kriptlerinden izole edilen kök hücrelerden büyüyen 3D yapılardır. CF olmayan deneklerden gelen organoidler yuvarlak bir şekle ve sıvı dolu bir lümene sahiptir, çünkü CFTR aracılı klorür taşınması suyu lümene yönlendirir. Kusurlu CFTR fonksiyonuna sahip organoidler şişmez, düzensiz bir şekil alır ve görünür lümeni yoktur. KF ve KF olmayan organoidler arasındaki morfolojideki farklılıklar, yeni bir CFTR fizyolojik testi olarak 'Rektal Organoid Morfoloji Analizi'nde (ROMA) ölçülmüştür. ROMA testi için, organoidler 96 delikli plakalar halinde kaplanır, kalsein ile boyanır ve konfokal mikroskopta görüntülenir. Morfolojik farklılıklar iki indeks kullanılarak ölçülür: Dairesellik indeksi (CI) organoidlerin yuvarlaklığını ölçer ve yoğunluk oranı (IR) merkezi bir lümenin varlığının bir ölçüsüdür. CF olmayan organoidler, CF organoidlerine kıyasla yüksek CI ve düşük IR'ye sahiptir. ROMA indeksleri, CF'siz 22 denekten KF'li 167 deneği mükemmel bir şekilde ayırt etti ve ROMA'yı KF tanısına yardımcı olmak için çekici bir fizyolojik CFTR testi haline getirdi. Rektal biyopsiler çoğu hastanede her yaşta rutin olarak yapılabilir ve doku organoid kültür ve ROMA için merkezi bir laboratuvara gönderilebilir. Gelecekte, ROMA in vitro CFTR modülatörlerinin etkinliğini test etmek için de uygulanabilir. Bu raporun amacı, ROMA için kullanılan yöntemleri tam olarak açıklamak ve diğer laboratuvarlarda replikasyona izin vermektir.

Giriş

Kistik fibroz (KF), KF transmembran iletkenlik regülatörü (KFTR) genindeki mutasyonların neden olduğu otozomal resesif geçişli bir hastalıktır. CFTR proteini, birkaç epitel^1'in hidrasyonunu sağlayan bir klorür ve bikarbonat kanalıdır. KF, öncelikle solunum yolu hastalığı olarak kendini gösteren, aynı zamanda gastrointestinal sistemi, pankreası, karaciğeri ve üreme sistemini de etkileyen, yüksek yüklü, yaşamı kısaltan, çok sistemli bir hastalıktır².

Hastalığa neden olan CFTR mutasyonları, CFTR'nin miktarında veya fonksiyonunda bir azalmaya yol açar ve bu da mukus dehidrasyonun....

Protokol

İnsan dokusunu içeren tüm prosedürler için Etik Kurul Araştırma UZ/KU Leuven (EC araştırması) tarafından onay alınmıştır. Tüm araştırmalar bilgilendirilmiş onam ve / veya ebeveynlerin, temsilcilerin ve / veya hastaların onayı ile gerçekleştirilmiştir.

NOT: Rektal biyopsileri ve organoidleri içeren tüm prosedürler, araştırmacıyı herhangi bir biyolojik tehlikeden korumak ve kültürlerin kontaminasyon riskini en aza indirmek için laminer bir akışta yapılmalıdır. Herhangi bir laboratuvar prosedürüne gelince, araştırmacılar numuneleri manipüle etmek için her zaman laboratuvar önlüğü, eldiven ve güvenlik gözlüğü giymelidir.

Sonuçlar

Rutin klinik ziyaretler sırasında 212 denekten organoidler toplandı. Rektal biyopsi prosedürü sırasında veya sonrasında herhangi bir yan etki meydana gelmedi. Organoidler, genotip ve klinik bilgi gibi özne özelliklerine kör olan bir araştırmacı tarafından görüntülendi. Düşük kaliteli görüntüler nedeniyle, 23 denek hariç tutuldu. Başarılı ve başarısız organoid kültürlere ve görüntü edinimine örnekler Şekil 2'de görülebilir.

K.......

Tartışmalar

Rektal organoid morfoloji analizi (ROMA) için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. ROMA, IR ve CI ile hesaplanan iki indeks, organoidleri CF'li deneklerden CF'siz olanlardan mükemmel doğrulukla ayırdı. ROMA böylece SCC'yi ve şu anda mevcut olan diğer testleri ^13,14,15'i tamamlayan yeni bir fizyolojik CFTR testi olarak işlev görebilir.

Protokol, CFTR işlevsel olduğunda yuvarlak bir şekle v.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Sorenson	17040
15 mL conical tubes	VWR	525-0605
24 well plates	Corning	3526
96 well plates	Greiner	655101
Brightfield microscope	Zeiss	Axiovert 40C
Centrifuge	Eppendorf	5702
CO2 incubator	Binder	CB160
Computer	Hewlett-Packard	Z240
Confocal microscope	Zeiss	LSM 800
Laminar flow hood	Thermo Fisher	51025413
Material for organoid culture as detailed in previous protocol10
Micropipettes (20, 200, and 1000 µL)	Eppendorf	3123000039, 3123000055, 3123000063
Microsoft Excel	Microsoft	Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit	Spreadsheet software
NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software	Nikon	v.5.02.00	Imaging software
Pipette tips (20, 200, and 1000 µL)	Greiner	774288, 775353, 750288
Zeiss Zen Blue software	Zeiss	v2.6	Imaging software