Análise da Morfologia Organoide Retal (ADM): Um Ensaio Diagnóstico na Fibrose Cística

Resumo

Este protocolo descreve a análise da morfologia organoide retal (ADM), um novo ensaio diagnóstico para fibrose cística (FC). As características morfológicas, nomeadamente a arredondamento (índice de circularidade, IC) e a presença de um lúmen (razão de intensidade, RI), são uma medida da função CFTR. A análise de 189 sujeitos mostrou perfeita discriminação entre FC e não FC.

Resumo

O diagnóstico de fibrose cística (FC) nem sempre é simples, especialmente quando a concentração de cloreto no suor é intermediária e/ou inferior a duas mutações da CFTR causadoras da doença podem ser identificadas. Ensaios fisiológicos de CFTR (diferença de potencial nasal, medição da corrente intestinal) foram incluídos no algoritmo de diagnóstico, mas nem sempre estão prontamente disponíveis ou viáveis (por exemplo, em lactentes). Os organoides retais são estruturas 3D que crescem a partir de células-tronco isoladas de criptas de uma biópsia retal quando cultivadas sob condições específicas. Os organoides de indivíduos não-FC têm uma forma redonda e um lúmen cheio de fluido, já que o transporte de cloreto mediado por CFTR leva a água para o lúmen. Organoides com função CFTR defeituosa não incham, mantendo uma forma irregular e não tendo lúmen visível. As diferenças na morfologia entre organoides CF e não-CF são quantificadas na 'Rectal Organoid Morphology Analysis' (ROMA) como um novo ensaio fisiológico CFTR. Para o ensaio de ROMA, os organoides são banhados em placas de 96 poços, corados com calceína e fotografados em microscópio confocal. As diferenças morfológicas são quantificadas usando dois índices: o índice de circularidade (IC) quantifica a arredondamento dos organoides e a razão de intensidade (RI) é uma medida da presença de um lúmen central. Os organoides não-CF têm um IC alto e um IR baixo em comparação com os organoides da FC. Os índices de ROMA discriminaram perfeitamente 167 indivíduos com FC de 22 indivíduos sem FC, tornando a ROMA um ensaio fisiológico atraente de CFTR para auxiliar no diagnóstico de FC. As biópsias retais podem ser realizadas rotineiramente em todas as idades na maioria dos hospitais e o tecido pode ser enviado para um laboratório central para cultura de organoides e ROMA. No futuro, a ROMA também pode ser aplicada para testar a eficácia dos moduladores CFTR in vitro. O objetivo do presente relatório é explicar completamente os métodos utilizados para ROMA, para permitir a replicação em outros laboratórios.

Introdução

A fibrose cística (FC) é uma doença autossômica recessiva causada por mutações no gene do regulador de condutância transmembrana da FC (CFTR). A proteína CFTR é um canal de cloreto e bicarbonato, garantindo a hidratação de vários epitélios¹. A FC é uma doença multissistêmica de alta carga, que encurta a vida, manifestando-se principalmente como uma doença respiratória, mas também afetando o trato gastrointestinal, pâncreas, fígado e trato reprodutivo².

As mutações do CFTR causadoras de doenças levam a uma diminuição na quantidade ou função do CFTR , por sua vez, causando desi....

Protocolo

Para todos os procedimentos que envolvam tecidos humanos, foi obtida a aprovação pelo Comité de Ética em Investigação UZ/KU Leuven (investigação CE). Todas as pesquisas foram realizadas com consentimento informado e/ou consentimento dos pais, representantes e/ou pacientes.

NOTA: Todos os procedimentos envolvendo biópsias retais e organoides devem ser realizados em fluxo laminar para proteger o pesquisador de qualquer risco biológico e minimizar o risco de contaminação das culturas. Como para qualquer procedimento de laboratório, os pesquisadores devem sempre usar jalecos, luvas e óculos de segurança para manipular amostras.

Resultados

Organoides de 212 indivíduos foram coletados durante as visitas clínicas de rotina. Nenhum evento adverso ocorreu durante ou após o procedimento de biópsia retal. Os organoides foram fotografados por um pesquisador cego para as características do sujeito, como genótipo e informações clínicas. Devido à baixa qualidade das imagens, 23 sujeitos foram excluídos. Exemplos de culturas organoides bem-sucedidas e fracassadas e aquisição de imagens podem ser vistos na Figura 2.

Discussão

Fornecemos um protocolo detalhado para análise da morfologia organológica retal (ADM). Os dois índices calculados com ROMA, RI e IC distinguiram organoides de indivíduos com FC daqueles sem FC com perfeita acurácia. A ROMA poderia, assim, funcionar como um novo ensaio fisiológico de CFTR complementar ao CEC e a outros testes atualmente disponíveis^13,14,15.

O protocolo é dependente do uso de or.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Sorenson	17040
15 mL conical tubes	VWR	525-0605
24 well plates	Corning	3526
96 well plates	Greiner	655101
Brightfield microscope	Zeiss	Axiovert 40C
Centrifuge	Eppendorf	5702
CO2 incubator	Binder	CB160
Computer	Hewlett-Packard	Z240
Confocal microscope	Zeiss	LSM 800
Laminar flow hood	Thermo Fisher	51025413
Material for organoid culture as detailed in previous protocol10
Micropipettes (20, 200, and 1000 µL)	Eppendorf	3123000039, 3123000055, 3123000063
Microsoft Excel	Microsoft	Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit	Spreadsheet software
NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software	Nikon	v.5.02.00	Imaging software
Pipette tips (20, 200, and 1000 µL)	Greiner	774288, 775353, 750288
Zeiss Zen Blue software	Zeiss	v2.6	Imaging software