鉴定甲型流感病毒感染期间切割蛋白质的半胱天冬酶及其基序

摘要

甲型流感病毒（IAV）感染激活半胱天冬酶，切割宿主和病毒蛋白，而宿主和病毒蛋白又具有促病毒和抗病毒功能。通过使用抑制剂、RNA干扰、定点诱变以及蛋白质印迹和RT-qPCR技术，鉴定了受感染哺乳动物细胞中切割宿主皮质肌动蛋白和组蛋白脱乙酰酶的半胱天冬酶。

摘要

半胱天冬酶是半胱氨酸蛋白酶家族，协调程序性细胞死亡以响应各种刺激，包括微生物感染。最初描述为由细胞凋亡发生，现在已知程序性细胞死亡包括三种相互关联的途径:焦亡，细胞凋亡和坏死性凋亡，共同创造为一个过程，即PANoptosis。影响 病毒（IAV）感染通过诱导不同半胱天冬酶的激活来诱导哺乳动物细胞中的PANoptosis，而半胱天冬酶又会切割各种宿主和病毒蛋白，从而导致宿主先天抗病毒反应的激活或拮抗宿主蛋白的降解等过程。在这方面，在动物和人类上皮细胞中发现了半胱天冬酶 3 介导的宿主皮质素、组蛋白脱乙酰酶 4 （HDAC4） 和组蛋白脱乙酰化酶 6 （HDAC6） 的切割，以响应 IAV 感染。为了证明这一点，采用了抑制剂、RNA干扰和定点诱变，随后通过蛋白质印迹测量了皮质素、HDAC4和HDAC6多肽的切割或抗性以及皮质素、HDAC4和HDAC6多肽的回收率。这些方法与RT-qPCR相结合，形成了一种简单而有效的策略，用于鉴定宿主以及在IAV或其他人类和动物病毒感染期间经历半胱天冬酶介导的切割的病毒蛋白。本议定书阐述了该战略的代表性结果，并讨论了使其更有效的方法。

引言

甲型流感病毒（IAV）是 正粘病毒科 的原型成员，已知会引起全球流行病和不可预测的大流行。IAV引起人类呼吸道疾病，流感，俗称"流感"。流感是一种急性疾病，可导致宿主促炎和抗炎先天免疫反应的诱导以及人类呼吸道中上皮细胞的死亡。这两个过程都受到一种称为程序性细胞死亡¹的现象的支配。一旦各种病原体识别受体感知宿主细胞中传入的病毒颗粒，就会诱导程序性细胞死亡的信号传导。这导致通过三种相互关联的途径（称为焦亡，凋亡和坏死性凋亡）对感染细胞的死亡进行编程，并向邻近的健康细胞发出信号 - 最近被创造为一个过程，PANoptosis¹。

全细胞凋亡涉及许多宿主和病毒蛋白从诱导到执行的蛋白水解加工。蛋白质的这种加工主要由称为半胱天冬酶^1，2的半胱氨酸蛋白酶家族带头。^已知多达18种半胱天冬酶（从半胱天冬酶1到半胱天冬酶18）3。大多数半胱天冬酶表达为半胱天冬酶原，并通过自催化或其他半胱天冬酶⁴进行自身的蛋白水解处理来激活，以响应病毒感染等刺激。IAV感染细胞的PANoptosis被认为是宿主防御机制，但IAV已经进化出逃避和利用它以促进其复制的方法¹，²，^5，6。其中之一是通过半胱天冬酶介导的裂解或降解来拮抗宿主因子，这些切割或降解要么具有固有的抗病毒作用，要么干扰IAV生命周期的一个步骤。为此，已发现宿主因子皮质素、HDAC4 和 HDAC6 在 IAV 感染的上皮细胞中经历半胱天冬酶介导的切割或降解⁷，^8，9。HDAC4 和 HDAC6 是抗 IAV 因子⁸，^10，皮质肌动蛋白在感染后期干扰 IAV 复制，可能在病毒组装和出芽期间干扰^{IAV 复制 11}。

此外，各种半胱天冬酶也被激活，反过来，它们又切割多种蛋白质以激活IAV感染期间的宿主炎症反应^1，2。此外，核蛋白（NP）、IAV 12，^13，14的离子通道^M2蛋白和其他病毒³，¹⁵，¹⁶的各种蛋白质在感染过程中也经历半胱天冬酶介导的切割^，这会影响病毒发病机制。因此，需要持续研究半胱天冬酶介导的IAV和其他病毒感染过程中宿主和病毒蛋白的切割或降解，以了解病毒发病机制的分子基础。本文介绍了以下方法:（1）评估半胱天冬酶对这些蛋白质的切割或降解，（2）鉴定这些半胱天冬酶，以及（3）定位切割位点。

研究方案

奥塔哥大学机构生物安全委员会获得了监管部门的批准，与IAV和哺乳动物细胞合作。本研究使用Madin-Darby犬肾（MDCK）或人肺泡上皮A549细胞和IAV H1N1亚型。IAV是在鸡蛋中生长的，如其他地方所述¹⁷。无菌和无菌条件用于处理哺乳动物细胞，生物安全2级（或物理遏制2）设施和II类生物安全柜用于处理IAV亚型。

1. 评估半胱天冬酶对IAV感染细胞中蛋白质的切割或降解

1. 在 12 孔细胞培养板中每孔接种 3 x 10⁵ 个 MDCK 或 A549 细胞。
   注意:如果使用MDCK细胞，请确保针对目标蛋白的抗体识别其犬种。
2. 成对播种孔，即对照对 - 一个用于未感染的模拟样品，一个用于感染的模拟样品 - 以及一个测试对 - 一个用于未感染的抑制剂A样品和一个用于感染的抑制剂A样品。增加每个附加抑制剂的对数（参见参考文献^7，8）。
3. 将细胞在37°C的5%CO₂ 气氛下孵育过夜。
4. 第二天，用IAV（H1N1亚型或其他亚型）感染细胞。
   1. 为此，通过将病毒原液稀释在 400 μL 无血清最低必需培养基 （MEM）（参见 材料表）中，以 0.5-3.0 斑块形成单位 （pfu）/细胞^7，11 的感染倍数 （MOI）（计算 MOI 时细胞数加倍的因素）稀释病毒接种物。
      注意:为了感染MDCK细胞，用终浓度为1μg/ mL的甲苯丙酰氯甲基酮（TPCK）-胰蛋白酶补充病毒接种物。
5. 从细胞中取出旧培养基（步骤1.3），并用1 mL /孔的无血清MEM 2x洗涤细胞。
6. 向细胞中加入400μL病毒接种物（步骤1.4.1），并在5%CO₂ 气氛下于35°C孵育1小时。
7. 同时，在无血清MEM⁷中分别以40μM，20mM或10μM的终浓度稀释半胱天冬酶抑制剂（例如Z-DEVD-FMK），溶酶体抑制剂（例如NH₄Cl）或蛋白酶体抑制剂（例如MG132）（参见材料表）。后两种抑制剂用作对照。稀释等体积的溶剂（如果不是水），用于在无血清培养基中重建其中一种抑制剂作为模拟。
8. 取出病毒接种物并按照步骤1.5（1x）洗涤细胞。
9. 将无血清MEM，1mL /孔，模拟或补充抑制剂，添加到细胞中，如步骤1.6所示孵育细胞。该时间点被视为0小时感染。
10. 24小时后，通过用1mL注射器柱塞（橡胶侧）刮取细胞并将其转移到1.5mL聚丙烯管中来收获细胞。
11. 在室温下以12，000× g 离心管1-2分钟。使用移液管收集上清液。
    注意:该上清液可以丢弃或用于斑块测定⁸ ，以测量释放的病毒后代的滴度。
12. 用 250 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞沉淀，如步骤 1.11 中所示。
13. 除去上清液并通过加入 80-100 μL 细胞裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4、150 mM NaCl、0.5% 十二烷基硫酸钠 （SDS）、0.5% 脱氧胆酸钠、1% Triton X-100 和 1x 蛋白酶抑制剂混合物，参见 材料表）和涡旋来裂解细胞。
14. 将管在98°C下加热10分钟以完全裂解并制备总细胞裂解物。将裂解物储存在4°C，以便在第二天执行步骤1.15-1.17，但为了获得最佳结果，请在同一天完成这些步骤。
15. 使用BCA检测试剂盒估计每个样品中的蛋白质量（参见 材料表）。
16. 通过标准 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）11 以及分子量标记物¹¹ 分离未感染和感染样品中等量的蛋白质。
17. 将蛋白质转移到硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（见 材料表）。
    注意:PVDF膜在某些蛋白质印迹成像仪中可能会产生高背景;检查兼容性。
18. 使用其他地方描述的方法进行蛋白质免疫印迹以检测目标蛋白¹¹。
19. 比较模拟处理和抑制剂处理的感染样品泳道中的蛋白质水平。
    注意:如果蛋白质水平在半胱天冬酶抑制剂处理的感染样品泳道中恢复，则蛋白质被半胱天冬酶切割或降解。否则，它被溶酶体或蛋白酶体降解。
20. 通过测量同一实验至少三次重复的每个泳道中的条带强度并用相应的上样对照条带对其进行归一化来量化蛋白质回收率。
21. 使用任何现代成像仪和相关软件（参见 材料表）对蛋白质印迹进行成像并量化蛋白质回收率。

2. 通过RNA干扰确认半胱天冬酶介导的切割或IAV感染细胞中蛋白质的降解

1. 设计或获得预先设计的针对犬或人半胱天冬酶3、半胱天冬酶6和半胱天冬酶7（刽子手半胱天冬酶¹）的小干扰RNA（siRNA）和非靶向对照siRNA（参见 材料表）。
2. 通过反向转染将每个siRNA递送到MDCK或A549细胞8^，11。
3. 为此，在单独的管中稀释100nM的对照siRNA或半胱天冬酶siRNA或推荐体积的转染试剂（参见材料表）在100μL适当的培养基（如OptiMEM，参见材料表），并在室温下孵育5分钟。
4. 准备每个稀释液一式两份。
   注意:该副本包括一个重复，用于分析通过RT-qPCR或蛋白质印迹敲低半胱天冬酶表达（如果有半胱天冬酶抗体），另一个用于评估通过蛋白质印迹评估目标蛋白的回收率。
5. 将 100 μL 每种 siRNA 溶液与 100 μL 转染试剂溶液（步骤 2.3）混合，并在室温下孵育 20-45 分钟以形成 siRNA-转染试剂复合物。
6. 同时，在 800 μL 的完整生长培养基中拆分并加入 1 x 10 5 MDCK 或 A549 细胞，与 200 μL siRNA 转染试剂复合物混合（步骤^2.5 ），并将 1 mL 悬浮液加入 12 孔培养板的孔中。这种稀释使对照siRNA或半胱天冬酶siRNA的最终浓度达到10nM。
7. 将细胞在37°C下在5%CO₂ 气氛下孵育72小时。
8. 如步骤1.10所示从一个重复中收获细胞，并分别使用标准方法和方案⁸，¹¹通过RT-qPCR或蛋白质印迹验证或确认半胱天冬酶3^，半胱天冬酶6和半胱天冬酶7的表达。
9. 如步骤1.4-1.9（无抑制剂）中所述，用IAV感染另一个重复中的细胞。
10. 24小时后，通过蛋白质印迹收获，处理和分析细胞，并如步骤1.10-1.20所述测量和定量蛋白质回收率。

3. 用于定位多肽中半胱天冬酶裂解位点的定点诱变

1. 克隆哺乳动物表达质粒¹¹ 中感兴趣的基因编码蛋白，或从研究实验室或商业来源获得（见 材料表）。
   注意:如果用表位标签克隆基因或作为GFP融合，则首选基因以区分异位表达的多肽和蛋白质印迹过程中内源表达的多肽。
2. 使用半胱天冬酶底物数据库⁴或蛋白质比对工具，在多肽上找到共识半胱天冬酶切割基序XXXD和DXXD。几乎所有半胱天冬酶裂解基序在裂解位点（P1^）处都具有天冬氨酸3^，4。
3. 通过定点诱变将假定的P1天冬氨酸突变为谷氨酸或非极性氨基酸（丙氨酸，缬氨酸），然后使用标准方法和协议进行DNA测序¹¹ 。
4. 通过反向转染将野生型 （WT） 和突变质粒 DNA 递送至 MDCK 或 A549 细胞¹¹。
   1. 为此，在单独的管中将2μg质粒DNA或推荐体积的转染试剂稀释在100μL适当的培养基（参见步骤2.3和 材料表）中，并在室温下孵育5分钟。
   2. 将 100 μL 每种质粒 DNA 溶液与 100 μL 转染试剂溶液混合，并在室温下孵育 20-45 分钟以形成 DNA-转染试剂复合物。
5. 同时，将 3 x 10⁵ MDCK 或 A549 细胞拆分并加入到 800 μL 的完整生长培养基中，与 200 μL DNA 转染试剂复合物混合，并将 1 mL 悬浮液加入 12 孔培养板的孔中。
6. 将细胞在37°C的5%CO₂ 气氛下孵育。
7. 48小时后，如步骤1.4-1.9中所述用IAV感染细胞（不添加抑制剂）。
8. 24小时后，通过蛋白质印迹（如果适用，使用抗表位标签或GFP）收获，处理和分析细胞。然后，如步骤1.10-1.20中所述测量和定量蛋白质回收率。

结果

用半胱天冬酶3抑制剂治疗
已经发现宿主皮质素，HDAC4和HDAC6多肽在犬（MDCK）和人（A549，NHBE^）细胞中响应IAV感染而降解7，^8，9。通过使用上述方法，发现IAV诱导的宿主半胱天冬酶，特别是半胱天冬酶3，导致其降解⁷，^8，9。皮质肌动蛋白以感?...

讨论

已经确定，病毒会根据宿主因素和途径进行调整。反过来，宿主细胞通过采用各种策略来抵抗它。其中一种策略是PANoptosis，宿主细胞将其用作对抗病毒感染的抗病毒策略。然而，像IAV这样的病毒已经进化出自己的策略来对抗PANoptosis并利用它来发挥自己的优势¹，^3，6。这种相互作用涉及半胱天冬酶切割各种宿主和病毒蛋白。鉴?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
A549 cells	ATCC	CRM-CCL-185	Human, epithelial, lung
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Caspase 3 Inhibitor	Sigma-Aldrich	264156-M	Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Goat anti-NP antibody			Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	13778150
MDCK cells	ATCC	CCL-34	Dog, epithelial, kidney
MG132	Sigma-Aldrich	M7449
Minimum Essential Medium (MEM)	ThermoFisher Scientific	11095080	Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2	LI-COR		Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion	Addgene	50728	Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3	Sigma-Aldrich	NM_004346	siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6	Sigma-Aldrich	NM_001226	siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7	Sigma-Aldrich	NM_001227	siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs	Sigma-Aldrich	KSPQ12012	Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membrane	Cytiva (Fomerly GE Healthcare)	10600003
Rabbit anti-actin antibody	Abcam	ab8227
Rabbit anti-cortactin antibody	Cell Signaling	3502
Rabbit anti-GFP antibody	Takara	632592
SeeBlue Pre-stained Protein Standard	ThermoFisher Scientific	LC5625
Transfection medium, Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100	Merck
Trypsin, TPCK-Treated	Sigma-Aldrich	4370285