Identificación de caspasas y sus motivos que escinden proteínas durante la infección por el virus de la influenza A

Resumen

La infección por el virus de la influenza A (IAV) activa las caspasas que escinden las proteínas del huésped y virales, que, a su vez, tienen funciones pro y antivirales. Mediante el empleo de inhibidores, interferencia de ARN, mutagénesis dirigida al sitio y técnicas de Western blotting y RT-qPCR, se identificaron caspasas en células de mamíferos infectadas que escinden cortactina del huésped e histonas desacetilasas.

Resumen

Las caspasas, una familia de proteasas de cisteína, orquestan la muerte celular programada en respuesta a diversos estímulos, incluidas las infecciones microbianas. Inicialmente descrito como que ocurre por apoptosis, ahora se sabe que la muerte celular programada abarca tres vías interconectadas: piroptosis, apoptosis y necroptosis, acuñadas juntas como un proceso, PANoptosis. La infección por el virus Influence A (IAV) induce PANoptosis en células de mamíferos al inducir la activación de diferentes caspasas, que, a su vez, escinden varias proteínas del huésped y virales, lo que lleva a procesos como la activación de la respuesta antiviral innata del huésped o la degradación de proteínas antagónicas del huésped. En este sentido, se ha descubierto escisión mediada por caspasa 3 de la cortactina del huésped, la histona desacetilasa 4 (HDAC4) y la histona desacetilasa 6 (HDAC6) en células epiteliales animales y humanas en respuesta a la infección por IAV. Para demostrarlo, se emplearon inhibidores, interferencia de ARN y mutagénesis dirigida al sitio y, posteriormente, se midió la escisión o resistencia a la escisión y la recuperación de los polipéptidos cortactina, HDAC4 y HDAC6 mediante western blotting. Estos métodos, junto con RT-qPCR, forman una estrategia simple pero efectiva para identificar el huésped, así como las proteínas virales que experimentan escisión mediada por caspasa durante una infección de IAV u otros virus humanos y animales. En el presente protocolo se elaboran los resultados representativos de esta estrategia, y también se examinan las formas de hacerla más eficaz.

Introducción

El virus de la influenza A (IAV) es el miembro prototípico de la familia Orthomyxoviridae y se sabe que causa epidemias globales y pandemias impredecibles. IAV causa enfermedad respiratoria humana, gripe, comúnmente conocida como "gripe". La gripe es una enfermedad aguda que resulta en la inducción de respuestas inmunes innatas pro y antiinflamatorias del huésped y la muerte de las células epiteliales en el tracto respiratorio humano. Ambos procesos están gobernados por un fenómeno llamado muerte celular programada¹. La señalización para la muerte celular programada se induce tan pronto como varios receptores de reconocimiento de patógenos detectan las partículas de virus entrantes en las células huésped. Esto conduce a la programación de la muerte de las células infectadas y la señalización a las células sanas vecinas por tres vías interconectadas llamadas piroptosis, apoptosis y necroptosis, recientemente acuñadas como un proceso, PANoptosis¹.

La PANoptosis implica el procesamiento proteolítico de muchas proteínas del huésped y virales desde la inducción hasta la ejecución. Tal procesamiento de proteínas está encabezado principalmente por una familia de proteasas de cisteína llamadas caspasas ^1,2. Se conocen hasta 18 caspasas (de caspasa 1 a caspasa 18)³. La mayoría de las caspasas se expresan como pro-caspasas y se activan al someterse a su propio procesamiento proteolítico, ya sea por autocatálisis u otras caspasas⁴ en respuesta a un estímulo como una infección viral. Se pensaba que la PANoptosis de las células infectadas por IAV era un mecanismo de defensa del huésped, pero IAV ha desarrollado formas de evadirlo y explotarlo para facilitar su replicación 1,2,5,6. Uno de ellos es antagonizar los factores del huésped a través de la escisión o degradación mediada por caspasa que son inherentemente antivirales o interfieren con uno de los pasos del ciclo de vida del IAV. Con este fin, se ha descubierto que los factores del huésped, cortactina, HDAC4 y HDAC6 sufren escisión o degradación mediada por caspasa en células epiteliales infectadas por IAV ^7,8,9. El HDAC4 y el HDAC6 son factores anti-IAV ^8,10, y la cortactina interfiere con la replicación del IAV en una etapa posterior de la infección, potencialmente durante el ensamblaje viral y la gemación¹¹.

Además, también se activan varias caspasas, que, a su vez, escinden múltiples proteínas para activar la respuesta inflamatoria del huésped durante la infección por IAV ^1,2. Además, la nucleoproteína (NP), la proteína M2 del canal iónico de IAV 12,13,14 y varias proteínas de otros virus 3,15,16 también sufren escisión mediada por caspasa durante la infección^, lo que influye en la patogénesis viral. Por lo tanto, existe una necesidad continua de estudiar la escisión mediada por caspasa o la degradación de las proteínas del huésped y virales durante el IAV y otras infecciones virales para comprender las bases moleculares de la patogénesis viral. En este documento, los métodos se presentan para (1) evaluar la escisión o degradación de dichas proteínas por caspasas, (2) identificar esas caspasas, y (3) localizar los sitios de escisión.

Protocolo

Se obtuvieron aprobaciones regulatorias del Comité Institucional de Seguridad Biológica de la Universidad de Otago para trabajar con el IAV y las células de mamíferos. Para el presente estudio se utilizó el riñón canino Madin-Darby (MDCK) o células epiteliales a549 alveolares de pulmón humano y subtipos IAV H1N1. El IAV se cultivó en huevos de gallina, como se describe en otra parte¹⁷. Se utilizaron condiciones estériles y asépticas para trabajar con células de mamíferos, y se utilizaron una instalación de Bioseguridad Nivel 2 (o Contención Física 2) y un gabinete de bioseguridad Clase II para trabajar con subtipos de IAV.

1. Evaluación de la escisión o degradación de proteínas en células infectadas por IAV por caspasas

1. Semilla 3 x 10⁵ células MDCK o A549 por pocillo en una placa de cultivo celular de 12 pocillos.
   NOTA: Si utiliza células MDCK, asegúrese de que el anticuerpo contra la proteína de interés reconozca su especie canina.
2. Sembrar los pocillos en pares, es decir, un par de control, un pozo para la muestra simulada no infectada y otro para la muestra simulada infectada, y un par de pruebas, un pocillo para la muestra A del inhibidor A no infectado y otro para la muestra del inhibidor A infectado. Aumentar el número de pares con cada inhibidor adicional (ver referencias ^7,8).
3. Incubar las células a 37 °C bajo una atmósfera de_CO2 al 5% durante la noche.
4. Al día siguiente, infecte las células con IAV (un subtipo H1N1 u otro subtipo).
   1. Para ello, preparar el inóculo del virus diluyendo las existencias de virus en 400 μL de medio esencial mínimo (MEM) libre de suero (véase la Tabla de materiales) a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,5-3,0 unidades formadoras de placa (ufp)/célula ^7,11 (un factor de duplicación del número de células al calcular el MOI).
      NOTA: Para infectar células MDCK, complementar el inóculo del virus con tosilfenilanil clorometilcetona (TPCK)-tripsina a una concentración final de 1 μg/ml.
5. Retirar el medio de cultivo antiguo de las células (paso 1.3) y lavar las células con 1 ml/pocillo de MEM 2x sin suero.
6. Añadir 400 μL de inóculo vírico (paso 1.4.1) a las células e incubarlas durante 1 h a 35 °C en una atmósfera de_CO2 al 5%.
7. Mientras tanto, diluya un inhibidor de caspasa (por ejemplo, Z-DEVD-FMK), un inhibidor de lisosoma (por ejemplo, NH₄Cl) o un inhibidor del proteasoma (por ejemplo, MG132) (consulte la Tabla de materiales) a una concentración final de 40 μM, 20 mM o 10 μM, respectivamente, en MEM⁷ sin suero (consulte la Tabla de materiales). Los dos últimos inhibidores sirven como control. Diluir un volumen igual del disolvente (si no es agua) utilizado para reconstituir uno de los inhibidores en medio libre de suero como simulacro.
8. Retire el inóculo del virus y lave las células como en el paso 1.5 (1x).
9. Agregue la MEM sin suero, 1 ml / pocillo, simulada o suplementada con un inhibidor, a las células e incube las células como en el paso 1.6. Este punto de tiempo se considera como infección de 0 h.
10. Después de 24 h, recolecte las células raspándolas con un émbolo de jeringa de 1 ml (lado de goma) y transfiéralas a un tubo de polipropileno de 1,5 ml.
11. Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante 1-2 min a temperatura ambiente. Recoger el sobrenadante con una pipeta.
    NOTA: Este sobrenadante podría descartarse o usarse para un ensayo de placa⁸ para medir el título de la progenie del virus liberado.
12. Lavar el pellet celular con 250 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) mediante recentrifugación como en el paso 1.11.
13. Retire el sobrenadante y lisar las células agregando 80-100 μL de tampón de lisis celular (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 0.5% de desoxicolato de sodio, 1% Triton X-100 y 1x cóctel de inhibidores de proteasa, ver Tabla de materiales) y vórtice.
14. Calentar el tubo a 98 °C durante 10 min para lisar completamente y preparar el lisado celular total. Guarde los lisados a 4 °C para realizar los pasos 1.15-1.17 al día siguiente, pero, para obtener mejores resultados, finalice estos pasos el mismo día.
15. Calcule la cantidad de proteína en cada muestra utilizando un kit de ensayo de BCA (consulte la Tabla de materiales).
16. Resolver cantidades iguales de proteína de muestras no infectadas e infectadas mediante electroforesis estándar en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)11 junto con marcadores de peso molecular ¹¹.
17. Transfiera la proteína a una membrana de nitrocelulosa o difluoruro de polivinilideno (PVDF) (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: La membrana de PVDF puede dar un fondo alto en algunas imágenes de Western blot; Compruebe la compatibilidad.
18. Realizar Western blot para detectar la proteína de interés utilizando el método descrito en otra parte¹¹.
19. Compare los niveles de proteína en los carriles de muestra infectados tratados con simulacros y tratados con inhibidores.
    NOTA: Si el nivel de proteína se ha recuperado en el carril de muestra infectado tratado con inhibidores de caspasas, entonces la proteína es escindida o degradada por caspasas. De lo contrario, es degradado por lisosoma o proteasoma.
20. Cuantificar la recuperación de proteínas midiendo su intensidad de banda en cada carril a partir de al menos tres réplicas del mismo experimento y normalizándola con la banda de control de carga correspondiente.
21. Utilice cualquier generador de imágenes contemporáneo y el software asociado (consulte la Tabla de materiales) para obtener imágenes de las manchas occidentales y cuantificar la recuperación de proteínas.

2. Confirmación de la escisión mediada por caspasa o degradación de proteínas en células infectadas por IAV por interferencia de ARN

1. Diseñar u obtener un ARN de interferencia pequeña (ARNsi) prediseñado dirigido a la caspasa 3, caspasa 6 y caspasa 7 canina o humana (caspasas de verdugo¹) y un ARNip de control no dirigido (consulte la Tabla de materiales).
2. Administrar cada siRNA a células MDCK o A549 por transfección inversa ^8,11.
3. Para ello, diluir en tubos separados 100 nM de siRNA de control o siRNA de caspasa o un volumen recomendado de reactivo de transfección (ver Tabla de materiales) en 100 μL de medio apropiado (como OptiMEM, ver Tabla de materiales), e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
4. Preparar cada dilución por duplicado.
   NOTA: Este duplicado incluye una réplica para analizar la eliminación de la expresión de caspasa por RT-qPCR o western blot (si se dispone de anticuerpos contra caspasas) y otra para evaluar la recuperación de la proteína de interés por western blotting.
5. Mezclar 100 μL de cada solución de ARNip con 100 μL de solución de reactivo de transfección (paso 2.3) e incubar durante 20-45 min a temperatura ambiente para formar el complejo reactivo siRNA-transfección.
6. Mientras tanto, dividir y añadir 1 x 10 5 células MDCK o A549 en 800 μL del medio de crecimiento completo, mezclar con 200 μL de complejo reactivo de transfección de ARNip (paso^2.5 ) y añadir 1 ml de la suspensión a un pocillo de una placa de cultivo de 12 pocillos. Esta dilución eleva la concentración final de siRNA de control o siRNA de caspasa a 10 nM.
7. Incubar las células a 37 °C bajo una atmósfera de CO2 al 5% durante₇₂ h.
8. Recolectar las células de una réplica como en el paso 1.10, y procesarlas para validar o confirmar la eliminación de la expresión de caspasa 3, caspasa 6 y caspasa 7, ya sea por RT-qPCR o western blotting, respectivamente, utilizando métodos y protocolos estándar ^8,11.
9. Infectar las células en el otro replicar con IAV como se describe en los pasos 1.4-1.9 (sin inhibidores).
10. Después de 24 h, cosechar, procesar y analizar las células mediante Western blot y medir y cuantificar la recuperación de proteínas como se describe en los pasos 1.10-1.20.

3. Mutagénesis dirigida al sitio para localizar el sitio o sitios de escisión de la caspasa en el polipéptido

1. Clone la proteína codificante de genes de interés en un plásmido de expresión de mamífero¹¹ u obténgala de un laboratorio de investigación o fuente comercial (ver Tabla de materiales).
   NOTA: Se prefiere si el gen se clona con una etiqueta de epítopo o como fusión GFP para distinguir el polipéptido expresado ectópicamente del expresado endógenamente durante la transferencia occidental.
2. Utilizando bases de datos de sustrato de caspasa 4 o herramientas de alineación de proteínas, localice los motivos de escisión de caspasa^de consenso, XXXD y DXXD, en el polipéptido. Casi todos los motivos de escisión de caspasa poseen el ácido aspártico en el sitio de escisión (P1)^3,4.
3. Mutar el ácido aspártico P1 putativo a ácido glutámico o un aminoácido no polar (alanina, valina) mediante mutagénesis dirigida al sitio seguida de secuenciación de ADN¹¹ utilizando métodos y protocolos estándar.
4. Entregar el ADN plásmido mutante (WT) y de tipo salvaje a las células MDCK o A549 mediante transfección inversa¹¹.
   1. Para ello, diluir 2 μg de ADN plásmido o un volumen recomendado del reactivo de transfección en 100 μL de un medio apropiado (ver paso 2.3 y Tabla de materiales) en tubos separados, e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
   2. Mezclar 100 μL de cada solución de ADN plásmido con 100 μL de la solución de reactivo de transfección e incubar durante 20-45 min a temperatura ambiente para formar el complejo de reactivos de transfección de ADN.
5. Mientras tanto, divida y agregue 3 x 10⁵ células MDCK o A549 a 800 μL del medio de crecimiento completo, mezcle con 200 μL de complejo reactivo de transfección de ADN y agregue la suspensión de 1 ml a un pocillo de una placa de cultivo de 12 pocillos.
6. Incubar las células a 37 °C bajo una atmósfera de_CO2 al 5%.
7. Después de 48 h, infectar las células con IAV como se describe en los pasos 1.4-1.9 (sin agregar los inhibidores).
8. Después de 24 h, cosechar, procesar y analizar las células mediante Western blot (si corresponde, utilizando el anticuerpo contra una etiqueta de epítopo o GFP). Luego, mida y cuantifique la recuperación de proteínas como se describe en los pasos 1.10-1.20.

Resultados

Tratamiento con inhibidor de caspasa 3
Se ha descubierto que los polipéptidos cortactina del huésped, HDAC4 y HDAC6 sufren degradación en respuesta a la infección por IAV tanto en células caninas (MDCK) como humanas (A549, NHBE) ^7,8,9. Mediante el uso de los enfoques anteriores, se descubrió que las caspasas del huésped inducidas por IAV, particularmente la caspasa 3, causan su ...

Discusión

Se establece que los virus adaptan los factores y vías del huésped para su beneficio. A su vez, las células huésped se resisten a eso empleando varias estrategias. Una de esas estrategias es la PANoptosis, que las células huésped utilizan como estrategia antiviral contra las infecciones por virus. Sin embargo, virus como IAV han desarrollado sus propias estrategias para contrarrestar la PANoptosis y explotarla en su beneficio ^1,3,6.<...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
A549 cells	ATCC	CRM-CCL-185	Human, epithelial, lung
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Caspase 3 Inhibitor	Sigma-Aldrich	264156-M	Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Goat anti-NP antibody			Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	13778150
MDCK cells	ATCC	CCL-34	Dog, epithelial, kidney
MG132	Sigma-Aldrich	M7449
Minimum Essential Medium (MEM)	ThermoFisher Scientific	11095080	Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2	LI-COR		Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion	Addgene	50728	Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3	Sigma-Aldrich	NM_004346	siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6	Sigma-Aldrich	NM_001226	siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7	Sigma-Aldrich	NM_001227	siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs	Sigma-Aldrich	KSPQ12012	Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membrane	Cytiva (Fomerly GE Healthcare)	10600003
Rabbit anti-actin antibody	Abcam	ab8227
Rabbit anti-cortactin antibody	Cell Signaling	3502
Rabbit anti-GFP antibody	Takara	632592
SeeBlue Pre-stained Protein Standard	ThermoFisher Scientific	LC5625
Transfection medium, Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100	Merck
Trypsin, TPCK-Treated	Sigma-Aldrich	4370285