Identificación de caspasas y sus motivos que escinden proteínas durante la infección por el virus de la influenza A

Resumen

La infección por el virus de la influenza A (IAV) activa las caspasas que escinden las proteínas del huésped y virales, que, a su vez, tienen funciones pro y antivirales. Mediante el empleo de inhibidores, interferencia de ARN, mutagénesis dirigida al sitio y técnicas de Western blotting y RT-qPCR, se identificaron caspasas en células de mamíferos infectadas que escinden cortactina del huésped e histonas desacetilasas.

Resumen

Las caspasas, una familia de proteasas de cisteína, orquestan la muerte celular programada en respuesta a diversos estímulos, incluidas las infecciones microbianas. Inicialmente descrito como que ocurre por apoptosis, ahora se sabe que la muerte celular programada abarca tres vías interconectadas: piroptosis, apoptosis y necroptosis, acuñadas juntas como un proceso, PANoptosis. La infección por el virus Influence A (IAV) induce PANoptosis en células de mamíferos al inducir la activación de diferentes caspasas, que, a su vez, escinden varias proteínas del huésped y virales, lo que lleva a procesos como la activación de la respuesta antiviral innata del huésped o la degradación de proteínas antagónicas del huésped. En este sentido, se ha descubierto escisión mediada por caspasa 3 de la cortactina del huésped, la histona desacetilasa 4 (HDAC4) y la histona desacetilasa 6 (HDAC6) en células epiteliales animales y humanas en respuesta a la infección por IAV. Para demostrarlo, se emplearon inhibidores, interferencia de ARN y mutagénesis dirigida al sitio y, posteriormente, se midió la escisión o resistencia a la escisión y la recuperación de los polipéptidos cortactina, HDAC4 y HDAC6 mediante western blotting. Estos métodos, junto con RT-qPCR, forman una estrategia simple pero efectiva para identificar el huésped, así como las proteínas virales que experimentan escisión mediada por caspasa durante una infección de IAV u otros virus humanos y animales. En el presente protocolo se elaboran los resultados representativos de esta estrategia, y también se examinan las formas de hacerla más eficaz.

Introducción

El virus de la influenza A (IAV) es el miembro prototípico de la familia Orthomyxoviridae y se sabe que causa epidemias globales y pandemias impredecibles. IAV causa enfermedad respiratoria humana, gripe, comúnmente conocida como "gripe". La gripe es una enfermedad aguda que resulta en la inducción de respuestas inmunes innatas pro y antiinflamatorias del huésped y la muerte de las células epiteliales en el tracto respiratorio humano. Ambos procesos están gobernados por un fenómeno llamado muerte celular programada¹. La señalización para la muerte celular programada se induce tan pronto como varios receptores de reconocimiento de patóg....

Protocolo

Se obtuvieron aprobaciones regulatorias del Comité Institucional de Seguridad Biológica de la Universidad de Otago para trabajar con el IAV y las células de mamíferos. Para el presente estudio se utilizó el riñón canino Madin-Darby (MDCK) o células epiteliales a549 alveolares de pulmón humano y subtipos IAV H1N1. El IAV se cultivó en huevos de gallina, como se describe en otra parte¹⁷. Se utilizaron condiciones estériles y asépticas para trabajar con células de mamíferos, y se utilizaron una instalación de Bioseguridad Nivel 2 (o Contención Física 2) y un gabinete de bioseguridad Clase II para trabajar con subtipos de IAV.

Resultados

Tratamiento con inhibidor de caspasa 3
Se ha descubierto que los polipéptidos cortactina del huésped, HDAC4 y HDAC6 sufren degradación en respuesta a la infección por IAV tanto en células caninas (MDCK) como humanas (A549, NHBE) ^7,8,9. Mediante el uso de los enfoques anteriores, se descubrió que las caspasas del huésped inducidas por IAV, particularmente la caspasa 3, causan su .......

Discusión

Se establece que los virus adaptan los factores y vías del huésped para su beneficio. A su vez, las células huésped se resisten a eso empleando varias estrategias. Una de esas estrategias es la PANoptosis, que las células huésped utilizan como estrategia antiviral contra las infecciones por virus. Sin embargo, virus como IAV han desarrollado sus propias estrategias para contrarrestar la PANoptosis y explotarla en su beneficio ^1,3,6.<.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
A549 cells	ATCC	CRM-CCL-185	Human, epithelial, lung
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Caspase 3 Inhibitor	Sigma-Aldrich	264156-M	Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Goat anti-NP antibody			Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	13778150
MDCK cells	ATCC	CCL-34	Dog, epithelial, kidney
MG132	Sigma-Aldrich	M7449
Minimum Essential Medium (MEM)	ThermoFisher Scientific	11095080	Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2	LI-COR		Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion	Addgene	50728	Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3	Sigma-Aldrich	NM_004346	siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6	Sigma-Aldrich	NM_001226	siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7	Sigma-Aldrich	NM_001227	siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs	Sigma-Aldrich	KSPQ12012	Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membrane	Cytiva (Fomerly GE Healthcare)	10600003
Rabbit anti-actin antibody	Abcam	ab8227
Rabbit anti-cortactin antibody	Cell Signaling	3502
Rabbit anti-GFP antibody	Takara	632592
SeeBlue Pre-stained Protein Standard	ThermoFisher Scientific	LC5625
Transfection medium, Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100	Merck
Trypsin, TPCK-Treated	Sigma-Aldrich	4370285