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요약

인플루엔자 A 바이러스 (IAV) 감염은 숙주 및 바이러스 단백질을 절단하는 카스파 제를 활성화시켜 프로 바이러스 및 항 바이러스 기능을 갖습니다. 억제제, RNA 간섭, 부위 지향 돌연변이 유발, 웨스턴 블로팅 및 RT-qPCR 기술을 사용하여 숙주 코르탁틴 및 히스톤 탈아세틸라제를 절단하는 감염된 포유류 세포의 카스파제를 식별했습니다.

초록

시스테인 프로테아제 계열인 Caspases는 미생물 감염을 포함한 다양한 자극에 반응하여 프로그램된 세포 사멸을 조정합니다. 처음에는 세포 사멸에 의해 발생하는 것으로 설명 된 프로그램 된 세포 사멸은 이제 세 가지 상호 연결된 경로, 즉 pyroptosis, 세포 사멸 및 괴사 증을 포함하는 것으로 알려져 있으며, 함께 하나의 과정 인 PANoptosis로 만들어졌습니다. 영향 바이러스(IAV) 감염은 다양한 카스파제의 활성화를 유도하여 포유류 세포에서 PANoptosis를 유도하고, 이는 차례로 다양한 숙주 및 바이러스 단백질을 절단하여 숙주 선천적 항바이러스 반응의 활성화 또는 길항성 숙주 단백질의 분해와 같은 과정을 유도합니다. 이와 관련하여, 숙주 코르탁틴, 히스톤 탈아세틸라제 4 (HDAC4), 및 히스톤 탈아세틸라제 6 (HDAC6)의 카스파제 3-매개 절단이 IAV 감염에 반응하여 동물 및 인간 상피 세포 모두에서 발견되었다. 이를 입증하기 위해 억제제, RNA 간섭 및 부위 지시 돌연변이 유발을 사용했으며, 이어서 절단에 대한 절단 또는 저항성 및 코르탁틴, HDAC4 및 HDAC6 폴리펩티드의 회복을 웨스턴 블롯팅으로 측정했습니다. 이러한 방법은 RT-qPCR과 함께 IAV 또는 기타 인간 및 동물 바이러스의 감염 중에 카스파제 매개 절단을 겪는 바이러스 단백질뿐만 아니라 숙주를 식별하는 간단하면서도 효과적인 전략을 형성합니다. 본 프로토콜은이 전략의 대표적인 결과를 자세히 설명하고이를 더 효과적으로 만드는 방법도 논의합니다.

서문

인플루엔자 A 바이러스 (IAV)는 Orthomyxoviridae 계열의 프로토 타입 구성원이며 전 세계적으로 전염병과 예측할 수없는 전염병을 일으키는 것으로 알려져 있습니다. IAV는 일반적으로 "독감"으로 알려진 인간 호흡기 질환, 인플루엔자를 유발합니다. 상기 독감은 숙주 전염증성 및 항염증성 선천성 면역 반응의 유도 및 인간 호흡기에서 상피 세포의 사멸을 초래하는 급성 질환이다. 두 과정 모두 프로그램 된 세포 사멸1이라는 현상에 의해 지배됩니다. 프로그램된 세포 사멸에 대한 신호 전달은 다양한 병원체 인식 수용체가 숙주 세포에서 들어오는 바이러스 입자를 감지하는 즉시 유도됩니다. 이것은 감염된 세포의 죽음을 프로그래밍하고 pyroptosis, 세포 사멸 및 괴사라고 불리는 세 가지 상호 연결된 경로에 의해 인접한 건강한 세포에 신호를 보냅니다 - 최근에는 하나의 과정 인 PANoptosis1로 만들어졌습니다.

PANoptosis는 유도에서 실행까지 많은 숙주 및 바이러스 단백질의 단백질 분해 처리를 포함합니다. 이러한 단백질 처리는 주로 카스파제 1,2라고 하는 시스테인 프로테아제 계열에 의해 주도됩니다. 최대 18 개의 카스파제 (카스파제 1에서 카스파제 18까지)가 알려져 있습니다3. 대부분의 카스파제는 프로 카스파제로 표현되며 바이러스 감염과 같은 자극에 반응하여자가 촉매 또는 다른 카스파 아제4에 의해 자체 단백질 분해 처리를 통해 활성화됩니다. IAV에 감염된 세포의 PANoptosis는 숙주 방어 메커니즘으로 생각되었지만 IAV는 복제를 촉진하기 위해이를 회피하고 이용하는 방법을 진화 시켰습니다 1,2,5,6. 그 중 하나는 본질적으로 항 바이러스이거나 IAV 수명주기의 단계 중 하나를 방해하는 카스파 제 매개 절단 또는 분해를 통해 숙주 인자를 길항하는 것입니다. 이를 위해, 숙주 인자, 코르탁틴, HDAC4 및 HDAC6는 IAV에 감염된 상피 세포 7,8,9에서 카스파제 매개 절단 또는 분해를 겪는 것으로 밝혀졌다. HDAC4 및 HDAC6는 항 IAV 인자 8,10이며, 코르 탁틴은 감염의 후기 단계, 잠재적으로 바이러스 조립 및 출아 11 동안 IAV 복제를 방해합니다.

또한, 다양한 카스파아제가 활성화되고, 이는 차례로 IAV 감염 동안 숙주 염증 반응을 활성화시키기 위해 여러 단백질을 절단한다 1,2. 또한, 핵 단백질 (NP), IAV 12,13,14의 이온 채널 M2 단백질 및 다른 바이러스 3,15,16의 다양한 단백질도 감염 중에 카스파 제 매개 절단을 겪어 바이러스 병인에 영향을 미친다. 따라서, 바이러스 발병기전의 분자적 기초를 이해하기 위해 IAV 및 다른 바이러스 감염 동안 숙주 및 바이러스 단백질의 카스파제 매개 절단 또는 분해를 지속적으로 연구할 필요가 있다. 본원에서, 상기 방법은 (1) 카스파제에 의한 이러한 단백질의 절단 또는 분해를 평가하고, (2) 이들 카스파제를 확인하고, (3) 절단 부위를 위치시키기 위해 제시된다.

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프로토콜

IAV 및 포유류 세포와 협력하기 위해 오타고 대학 기관 생물 안전 위원회로부터 규제 승인을 받았습니다. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) 또는 인간 폐 폐포 상피 A549 세포 및 IAV H1N1 아형을 본 연구에 사용하였다. IAV는 다른 곳에서 설명한 바와 같이 닭고기 알에서 성장하였다17. 무균 및 무균 조건은 포유류 세포와 함께 작업하는 데 사용되었으며 생물 안전 레벨 2 (또는 물리적 격리 2) 시설 및 클래스 II 생물 안전 캐비닛은 IAV 하위 유형으로 작업하는 데 사용되었습니다.

1. 카스파제에 의한 IAV 감염 세포에서 단백질의 절단 또는 분해 평가

  1. 12-웰 세포 배양 플레이트에 웰당 3 x 105 MDCK 또는 A549 세포를 시드한다.
    참고: MDCK 세포를 사용하는 경우 관심 단백질에 대한 항체가 송곳니 종을 인식하는지 확인하십시오.
  2. 웰을 쌍으로 시드, 즉 대조군 쌍 - 감염되지 않은 모의 샘플에 대한 하나의 웰 및 감염된 모의 샘플에 대한 하나의 웰 - 및 시험 쌍 - 감염되지 않은 억제제 A 샘플에 대한 하나의 웰 및 감염된 억제제 A 샘플에 대한 하나의 웰. 각 추가 억제제와 함께 쌍의 수를 늘립니다 (참고 문헌 7,8 참조).
  3. 세포를 5%CO2 분위기 하에 37°C에서 밤새 인큐베이션한다.
  4. 다음날 세포를 IAV (H1N1 아형 또는 다른 아형)로 감염시킵니다.
    1. 이를 위해 0.5-3.0 플라크 형성 단위(pfu)/세포 7,11(MOI 계산 시 세포 수의 배가 계수)의 감염 다중도(MOI)로 400μL의 무혈청 최소 필수 배지(MEM)(재료 표 참조)에 바이러스 스톡을 희석하여 바이러스 접종물을 준비합니다.
      참고: MDCK 세포를 감염시키려면 최종 농도 1μg/mL의 토실 페닐알라닐클로로메틸케톤(TPCK)-트립신으로 바이러스 접종물을 보충하십시오.
  5. 세포에서 기존 배양 배지를 제거하고(단계 1.3) 1mL/웰의 무혈청 MEM 2x로 세포를 세척합니다.
  6. 400 μL의 바이러스 접종물(단계 1.4.1)을 세포에 첨가하고, 이들을 5%CO2 분위기 하에 35°C에서 1시간 동안 배양한다.
  7. 그 동안 카스파제 억제제(예: Z-DEVD-FMK), 리소좀 억제제(예:NH4Cl) 또는 프로테아좀 억제제(예: MG132)( 재료 표 참조)를 무혈청 MEM7 (재료 표 참조)에서 각각 최종 농도 40μM, 20mM 또는 10μM로 희석합니다. 후자의 두 억제제는 대조군 역할을합니다. 무혈청 배지에서 억제제 중 하나를 재구성하는 데 사용되는 동일한 부피의 용매(물 이외의 경우)를 모의로 희석합니다.
  8. 바이러스 접종물을 제거하고 단계 1.5(1x)에서와 같이 세포를 세척한다.
  9. 무혈청 MEM, 1mL/웰, 모의 또는 억제제 보충을 세포에 추가하고 단계 1.6과 같이 세포를 배양합니다. 이 시점은 0 시간 감염으로 간주됩니다.
  10. 24시간 후 1mL 주사기 플런저(고무 면)로 긁어 세포를 수확하고 1.5mL 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.
  11. 실온에서 12,000 x g 의 튜브를 1-2분 동안 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상청액을 수집합니다.
    참고: 이 상청액은 폐기되거나 방출된 바이러스 자손의 역가를 측정하기 위한 플라크 분석8 에 사용될 수 있습니다.
  12. 단계 1.11에서와 같이 재원심분리하여 250μL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포 펠릿을 세척합니다.
  13. 상청액을 제거하고 80-100 μL의 세포 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5 % 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS), 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 1 % 트리톤 X-100 및 1x 프로테아제 억제제 칵테일, 재료 표 참조)을 첨가하여 세포를 용해시키고 vortexing합니다.
  14. 튜브를 98°C에서 10분 동안 가열하여 완전히 용해시키고 전체 세포 용해물을 준비합니다. 다음 날 단계 1.15-1.17을 수행하기 위해 용해물을 4°C에서 저장하되, 최상의 결과를 얻으려면 이 단계를 같은 날에 완료하십시오.
  15. BCA 분석 키트를 사용하여 각 샘플의 단백질 양을 추정합니다( 재료 표 참조).
  16. 표준 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)11과 분자량 마커11로 감염되지 않은 샘플과 감염된 샘플에서 동일한 양의 단백질을 분해합니다.
  17. 단백질을 니트로셀룰로오스 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막으로 옮깁니다( 재료 표 참조).
    참고 : PVDF 멤브레인은 일부 웨스턴 블롯 이미 저에서 높은 배경을 제공 할 수 있습니다. 호환성을 확인하십시오.
  18. 다른 곳에서도 설명된 방법을 사용하여 관심있는 단백질을 검출하기 위해 웨스턴 블롯팅을 수행한다(11).
  19. 모의 처리 및 억제제 처리 감염된 샘플 레인의 단백질 수준을 비교합니다.
    참고: 단백질 수준이 카스파제 억제제로 처리된 감염된 샘플 레인에서 회복되면 단백질은 카스파제에 의해 절단되거나 분해됩니다. 그렇지 않으면 리소좀 또는 프로테아좀에 의해 분해됩니다.
  20. 동일한 실험의 최소 3회 반복에서 각 레인의 밴드 강도를 측정하고 해당 로딩 제어 밴드로 정규화하여 단백질 회수율을 정량화합니다.
  21. 최신 이미저 및 관련 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 웨스턴 블롯을 이미지화하고 단백질 회수율을 정량화합니다.

2. RNA 간섭에 의한 IAV 감염 세포에서 단백질의 카스파제 매개 절단 또는 분해 확인

  1. 개 또는 인간 카스파아제 3, 카스파아제 6, 및 카스파아제 7 (사형집행인 카스파제1) 및 비표적화 대조군 siRNA를 표적화하는 사전 설계된 소간섭 RNA (siRNA)를 설계 또는 수득한다( 재료 표 참조).
  2. 각각의 siRNA를 역형질감염 8,11에 의해 MDCK 또는 A549 세포에 전달한다.
  3. 이를 위해 100 μL의 적절한 배지(예: OptiMEM, 재료 표 참조)에 100nM의 대조군 siRNA 또는 카스파아제 siRNA 또는 권장 부피의 형질감염 시약(재료 표 참조)을 별도의 튜브에 희석하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
  4. 각 희석액을 이중으로 준비하십시오.
    참고: 이 복제본에는 RT-qPCR 또는 웨스턴 블로팅(카스파제에 대한 항체가 사용 가능한 경우)에 의한 카스파아제 발현의 녹다운을 분석하기 위한 하나의 복제와 웨스턴 블로팅에 의한 관심 단백질의 회복을 평가하기 위한 다른 하나의 복제가 포함됩니다.
  5. 각 siRNA 용액 100μL와 형질주입 시약 용액 100μL를 혼합하고(단계 2.3) 실온에서 20-45분 동안 배양하여 siRNA-형질주입 시약 복합체를 형성한다.
  6. 그 동안 800μL의 완전한 성장 배지에 1 x 10 5 MDCK 또는 A549 세포를 분할하여 추가하고, 200μL의 siRNA-형질주입 시약 복합체와 혼합하고(단계2.5 ), 현탁액 1mL를 12웰 배양 플레이트의 웰에 추가합니다. 이러한 희석은 대조군 siRNA 또는 카스파아제 siRNA의 최종 농도를 10nM로 만든다.
  7. 세포를 5% CO2 분위기 하에 37°C에서72 시간 동안 인큐베이션한다.
  8. 단계 1.10에서와 같이 하나의 복제물로부터 세포를 수확하고, 표준 방법및 프로토콜 8,11을 사용하여 각각 RT-qPCR 또는 웨스턴 블로팅에 의해 카스파아제 3, 카스파아제 6 및 카스파아제 7의 발현의 녹다운을 검증하거나 확인하기 위해 이들을 처리한다.
  9. 다른 복제물의 세포를 단계 1.4-1.9(억제제 없음)에 설명된 대로 IAV로 감염시킨다.
  10. 24시간 후, 세포를 수확, 처리 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하고, 단계 1.10-1.20에 기재된 바와 같이 단백질 회수를 측정 및 정량화한다.

3. 폴리펩티드에서 카스파아제 절단 부위(들)를 찾기 위한 부위-지시된 돌연변이유발

  1. 관심 있는 유전자 코딩 단백질을 포유동물 발현 플라스미드11 에 복제하거나 연구실 또는 상용 공급원으로부터 수득한다( 재료 표 참조).
    참고: 유전자가 에피토프 태그로 클로닝되거나 GFP 융합체로서 클로닝되어 외분비적으로 발현된 폴리펩티드를 웨스턴 블롯팅 동안 내인성으로 발현된 폴리펩티드와 구별하는 것이 바람직하다.
  2. 카스파아제 기질 데이터베이스(4) 또는 단백질 정렬 도구를 사용하여, 폴리펩티드 상에서 컨센서스 카스파아제 절단 모티프, XXXD 및 DXXD를 위치시킨다. 거의 모든 카스파아제 절단 모티프는 절단 부위(P1)3,4에서 아스파르트산을 소유합니다.
  3. 표준 방법 및 프로토콜을 사용하여 DNA 시퀀싱11 에 이어 부위 지시 돌연변이 유발에 의해 추정 P1 아스파르트산을 글루탐산 또는 비극성 아미노산(알라닌, 발린)으로 돌연변이시킵니다.
  4. 야생형 (WT) 및 돌연변이체 플라스미드 DNA를 역형질감염에 의해 MDCK 또는 A549 세포에 전달한다11.
    1. 이를 위해, 2 μg의 플라스미드 DNA 또는 형질주입 시약의 권장 부피를 100 μL의 적절한 배지(단계 2.3 및 재료 표 참조)에 별도의 튜브에 희석하고, 실온에서 5분 동안 배양한다.
    2. 각 플라스미드 DNA 용액 100μL와 형질주입 시약 용액 100μL를 혼합하고 실온에서 20-45분 동안 배양하여 DNA-형질주입 시약 복합체를 형성한다.
  5. 그 동안 3 x 105 MDCK 또는 A549 세포를 분할하여 800μL의 완전한 성장 배지에 추가하고, 200μL의 DNA-형질주입 시약 복합체와 혼합하고, 1mL 현탁액을 12웰 배양 플레이트의 웰에 추가합니다.
  6. 세포를 5%CO2 분위기 하에 37°C에서 인큐베이션한다.
  7. 48 시간 후, 단계 1.4-1.9에 설명 된대로 세포를 IAV로 감염시킵니다 (억제제를 추가하지 않음).
  8. 24시간 후, 세포를 수확, 처리하고, 웨스턴 블롯팅에 의해 분석한다 (적용가능한 경우, 에피토프 태그 또는 GFP에 대한 항체를 사용함). 그런 다음 단계 1.10-1.20에 설명된 대로 단백질 회수율을 측정하고 정량합니다.

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결과

카스파 아제 3 억제제로 치료
숙주 코르탁틴, HDAC4 및 HDAC6 폴리펩티드는 개 (MDCK) 및 인간 (A549, NHBE) 세포 7,8,9 모두에서 IAV 감염에 반응하여 분해되는 것으로 밝혀졌다. 상기 접근법을 사용함으로써, IAV-유도된 숙주 카스파제, 특히 카스파아제 3이 이들의 분해 7,8,9

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토론

바이러스는 숙주 요인과 경로를 자신의 이익에 맞게 조정한다는 것이 입증되었습니다. 차례로, 숙주 세포는 다양한 전략을 사용함으로써 그것에 저항합니다. 이러한 전략 중 하나는 숙주 세포가 바이러스 감염에 대한 항바이러스 전략으로 사용하는 PANoptosis입니다. 그러나 IAV와 같은 바이러스는 PANoptosis에 대응하고이를 유리하게 악용하기 위해 자체 전략을 발전시켰습니다1,3,6.<...

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공개

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

저자는 Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), Health Research Council of New Zealand, Maurice and Phyllis Paykel Trust (뉴질랜드), HS and J.C. Anderson Trust (더니든), 미생물학 및 면역학과 및 생물 의학 학교 (University of Otago).

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
A549 cellsATCCCRM-CCL-185Human, epithelial, lung
Ammonium chlorideSigma-AldrichA9434
Caspase 3 InhibitorSigma-Aldrich264156-MAlso known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor CocktailRoche11836153001
Goat anti-NP antibodyGift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermoFisher Scientific31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection ReagentThermoFisher Scientific13778150
MDCK cellsATCCCCL-34Dog, epithelial, kidney
MG132Sigma-AldrichM7449
Minimum Essential Medium (MEM)ThermoFisher Scientific11095080Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1Sigma-AldrichSIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 LI-COROdyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion Addgene50728Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3Sigma-AldrichNM_004346siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6Sigma-AldrichNM_001226siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7Sigma-AldrichNM_001227siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairsSigma-AldrichKSPQ12012Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membraneCytiva (Fomerly GE Healthcare)10600003
Rabbit anti-actin antibodyAbcamab8227
Rabbit anti-cortactin antibodyCell Signaling3502
Rabbit anti-GFP antibodyTakara632592
SeeBlue Pre-stained Protein StandardThermoFisher ScientificLC5625
Transfection medium, Opti-MEMThermoFisher Scientific11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100Merck
Trypsin, TPCK-TreatedSigma-Aldrich4370285

참고문헌

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