Identifier les caspases et leurs motifs qui clivent les protéines lors de l’infection par le virus de la grippe A

Résumé

L’infection par le virus de la grippe A (IAV) active les caspases qui clivent les protéines de l’hôte et les protéines virales, qui, à leur tour, ont des fonctions provirales et antivirales. En utilisant des inhibiteurs, l’interférence ARN, la mutagénèse dirigée et des techniques de transfert Western et de RT-qPCR, les caspases dans les cellules de mammifères infectées qui clivent la cortactine de l’hôte et les histone désacétylases ont été identifiées.

Résumé

Les caspases, une famille de cystéines protéases, orchestrent la mort cellulaire programmée en réponse à divers stimuli, y compris les infections microbiennes. Initialement décrite comme se produisant par apoptose, la mort cellulaire programmée est maintenant connue pour englober trois voies interconnectées: la pyroptose, l’apoptose et la nécroptose, inventées ensemble comme un seul processus, PANoptosis. L’infection virale Influence A (IAV) induit une panoptique dans les cellules de mammifères en induisant l’activation de différentes caspases, qui, à leur tour, clivent diverses protéines hôtes et virales, conduisant à des processus tels que l’activation de la réponse antivirale innée de l’hôte ou la dégradation des protéines antagonistes de l’hôte. À cet égard, le clivage médié par la caspase 3 de la cortactine de l’hôte, de l’histone désacétylase 4 (HDAC4) et de l’histone désacétylase 6 (HDAC6) a été découvert dans des cellules épithéliales animales et humaines en réponse à l’infection par le VIA. Pour démontrer cela, des inhibiteurs, des interférences ARN et une mutagénèse dirigée ont été utilisés et, par la suite, le clivage ou la résistance au clivage et la récupération des polypeptides cortactin, HDAC4 et HDAC6 ont été mesurés par transfert Western. Ces méthodes, associées à la RT-qPCR, constituent une stratégie simple mais efficace pour identifier l’hôte ainsi que les protéines virales subissant un clivage médié par la caspase lors d’une infection par le virus IAV ou d’autres virus humains et animaux. Le présent protocole élabore les résultats représentatifs de cette stratégie, et les moyens de la rendre plus efficace sont également discutés.

Introduction

Le virus de la grippe A (IAV) est le membre prototypique de la famille des Orthomyxoviridae et est connu pour causer des épidémies mondiales et des pandémies imprévisibles. L’IAV provoque une maladie respiratoire humaine, la grippe, communément appelée « grippe ». La grippe est une maladie aiguë qui entraîne l’induction de réponses immunitaires innées pro et anti-inflammatoires de l’hôte et la mort des cellules épithéliales dans les voies respiratoires humaines. Les deux processus sont régis par un phénomène appelé mort cellulaire programmée¹. La signalisation de la mort cellulaire programmée est induite dès que divers récepteurs de reconnaissance des agents pathogènes détectent les particules virales entrantes dans les cellules hôtes. Cela conduit à la programmation de la mort des cellules infectées et à la signalisation aux cellules saines voisines par trois voies interconnectées appelées pyroptose, apoptose et nécroptose - récemment inventées comme un seul processus, PANoptosis¹.

PANoptosis implique le traitement protéolytique de nombreuses protéines hôtes et virales de l’induction à l’exécution. Un tel traitement des protéines est principalement mené par une famille de cystéines protéases appelées caspases ^1,2. Jusqu’à 18 caspases (de la caspase 1 à la caspase 18) sont connues³. La plupart des caspases sont exprimées en pro-caspases et activées en subissant leur propre traitement protéolytique soit par autocatalyse, soit par d’autres caspases⁴ en réponse à un stimulus comme une infection virale. On pensait que la panoptique des cellules infectées par IAV était un mécanisme de défense de l’hôte, mais l’IAV a mis au point des moyens de l’échapper et de l’exploiter pour faciliter sa réplication 1,2,5,6. L’une d’entre elles consiste à antagoniser les facteurs de l’hôte par le biais d’un clivage ou d’une dégradation médiée par la caspase qui sont intrinsèquement antiviraux ou interfèrent avec l’une des étapes du cycle de vie de l’IAV. À cette fin, on a découvert que les facteurs de l’hôte, la cortactine, HDAC4 et HDAC6 subissent un clivage ou une dégradation médiée par la caspase dans les cellules épithéliales infectées par l’IAV ^7,8,9. Les HDAC4 et HDAC6 sont des facteurs anti-IAV 8,10, et la cortactine interfère avec la réplication de l’IAV à un stade ultérieur de l’infection^, potentiellement pendant l’assemblage viral et le bourgeonnement ¹¹.

En outre, diverses caspases sont également activées, qui, à leur tour, clivent plusieurs protéines pour activer la réponse inflammatoire de l’hôte lors de l’infection IAV ^1,2. En outre, la nucléoprotéine (NP), la protéine M2 des canaux ioniques IAV 12,13,14 et diverses protéines d’autres virus 3,15,16 subissent également un clivage médié par la caspase au cours de l’infection^, ce qui influence la pathogenèse virale. Par conséquent, il existe un besoin continu d’étudier le clivage ou la dégradation médiée par la caspase des protéines de l’hôte et des protéines virales au cours de l’IAV et d’autres infections virales pour comprendre la base moléculaire de la pathogenèse virale. Ici, les méthodes sont présentées pour (1) évaluer le clivage ou la dégradation de ces protéines par les caspases, (2) identifier ces caspases, et (3) localiser les sites de clivage.

Protocole

Les approbations réglementaires ont été obtenues du comité institutionnel de sécurité biologique de l’Université d’Otago pour travailler avec l’IAV et les cellules de mammifères. Les cellules A549 alvéolaires alvéolaires du rein canin Madin-Darby (MDCK) ou du poumon humain et les sous-types IAV H1N1 ont été utilisés pour la présente étude. IAV a été cultivé dans des œufs de poule, comme décrit ailleurs¹⁷. Des conditions stériles et aseptiques ont été utilisées pour travailler avec des cellules de mammifères, et une installation de niveau de biosécurité 2 (ou confinement physique 2) et une enceinte de biosécurité de classe II ont été utilisées pour travailler avec des sous-types de VAI.

1. Évaluation du clivage ou de la dégradation des protéines dans les cellules infectées par l’IAV par les caspases

1. Ensemencer 3 x 10⁵ cellules MDCK ou A549 par puits dans une plaque de culture cellulaire de 12 puits.
   REMARQUE: Si vous utilisez des cellules MDCK, assurez-vous que l’anticorps contre la protéine d’intérêt reconnaît son espèce canine.
2. Ensemencer les puits par paires, c’est-à-dire une paire témoin - un puits pour l’échantillon simulé non infecté et un pour l’échantillon simulé infecté - et une paire d’essais - un puits pour l’échantillon A inhibiteur non infecté et un pour l’échantillon infecté-inhibiteur A. Augmenter le nombre de paires avec chaque inhibiteur supplémentaire (voir références ^7,8).
3. Incuber les cellules à 37 °C sous une atmosphère de 5% de CO₂ pendant une nuit.
4. Le lendemain, infectez les cellules avec IAV (un sous-type H1N1 ou un autre sous-type).
   1. Pour cela, préparer l’inoculum du virus en diluant le stock de virus dans 400 μL de milieu essentiel (MEM) minimum sans sérum (MEM) (voir le tableau des matériaux) à une multiplicité d’infection (MOI) de 0,5 à 3,0 unités plaqueuses (pfu)/cellule ^7,11 (un facteur du doublement du nombre de cellules lors du calcul de l’MOI).
      NOTE: Pour infecter les cellules MDCK, compléter l’inoculum du virus avec tosyl phénylalanyl chlorométhylcétone (TPCK)-trypsine à une concentration finale de 1 μg/mL.
5. Retirer l’ancien milieu de culture des cellules (étape 1.3) et laver les cellules avec 1 mL/puits de MEM 2x sans sérum.
6. Ajouter 400 μL d’inoculum viral (étape 1.4.1) aux cellules et les incuber pendant 1 h à 35 °C sous une atmosphère de CO₂ à 5%.
7. Entre-temps, diluer un inhibiteur de la caspase (p. ex. Z-DEVD-FMK), un inhibiteur du lysosome (p. ex._NH4Cl) ou un inhibiteur du protéasome (p. ex. MG132) (voir le tableau des matières) à une concentration finale de 40 μM, 20 mM ou 10 μM, respectivement, dans le MEM⁷ sans sérum (voir le tableau des matériaux). Les deux derniers inhibiteurs servent de contrôle. Diluer un volume égal du solvant (s’il n’est pas de l’eau) utilisé pour reconstituer l’un des inhibiteurs dans un milieu sans sérum comme un simulacre.
8. Retirer l’inoculum du virus et laver les cellules comme à l’étape 1.5 (1x).
9. Ajouter le MEM sans sérum, 1 mL/puits, simulé ou complété par un inhibiteur, aux cellules et incuber les cellules comme à l’étape 1.6. Ce point temporel est considéré comme une infection de 0 h.
10. Après 24 h, récoltez les cellules en les grattant avec un piston de seringue de 1 mL (côté caoutchouc) et transférez-les dans un tube en polypropylène de 1,5 mL.
11. Centrifuger le tube à 12 000 x g pendant 1-2 min à température ambiante. Recueillir le surnageant à l’aide d’une pipette.
    REMARQUE : Ce surnageant pourrait être jeté ou utilisé pour un essai de plaque⁸ afin de mesurer le titre de la descendance virale libérée.
12. Laver la pastille cellulaire avec 250 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par recentrifugation comme à l’étape 1.11.
13. Retirer le surnageant et lyser les cellules en ajoutant 80-100 μL de tampon de lyse cellulaire (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% de dodécylsulfate de sodium (SDS), 0,5% de désoxycholate de sodium, 1% Triton X-100 et 1x cocktail inhibiteur de protéase, voir Tableau des matériaux) et vortex.
14. Chauffer le tube à 98 °C pendant 10 min pour lyser complètement et préparer le lysat cellulaire total. Conservez les lysats à 4 °C pour effectuer les étapes 1.15-1.17 le lendemain, mais, pour de meilleurs résultats, terminez ces étapes le même jour.
15. Estimer la quantité de protéines dans chaque échantillon à l’aide d’une trousse de dosage BCA (voir le tableau des matières).
16. Résoudre des quantités égales de protéines provenant d’échantillons non infectés et infectés par électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide standard (SDS-PAGE)11 avec des marqueurs de poids moléculaire ¹¹.
17. Transférer la protéine dans une membrane de nitrocellulose ou de polyfluorure de vinylidène (PVDF) (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE : La membrane PVDF peut donner un arrière-plan élevé dans certains imageurs Western Blot; Vérifiez la compatibilité.
18. Effectuer le transfert Western pour détecter la protéine d’intérêt en utilisant la méthode décrite ailleurs¹¹.
19. Comparez les niveaux de protéines dans les voies d’échantillonnage infectées traitées simulées et traitées par inhibiteur.
    REMARQUE: Si le niveau de protéine s’est rétabli dans la voie d’échantillonnage infectée traitée par inhibiteur de caspase, la protéine est clivée ou dégradée par les caspases. Sinon, il est dégradé par le lysosome ou le protéasome.
20. Quantifier la récupération de la protéine en mesurant l’intensité de sa bande dans chaque voie à partir d’au moins trois répétitions de la même expérience et en la normalisant avec la bande de contrôle de charge correspondante.
21. Utilisez n’importe quel imageur contemporain et le logiciel associé (voir le tableau des matériaux) pour imager les Western blots et quantifier la récupération des protéines.

2. Confirmation du clivage médié par la caspase ou de la dégradation des protéines dans les cellules infectées par l’IAV par interférence ARN

1. Concevoir ou obtenir un petit ARN interférent (siRNA) pré-conçu ciblant les caspases canines ou humaines 3, la caspase 6 et la caspase 7 (caspases^{bourreaux 1}) et un siRNA témoin non ciblé (voir le tableau des matériaux).
2. Délivrer chaque siRNA aux cellules MDCK ou A549 par transfection inverse ^8,11.
3. Pour cela, diluer dans des tubes séparés 100 nM de siRNA témoin ou de caspase siRNA ou un volume recommandé de réactif de transfection (voir Tableau des matériaux) dans 100 μL de milieu approprié (comme OptiMEM, voir Tableau des matériaux), et incuber pendant 5 min à température ambiante.
4. Préparer chaque dilution en deux exemplaires.
   NOTE: Ce duplicata comprend une réplique pour analyser l’élimination de l’expression de la caspase par RT-qPCR ou Western blot (si des anticorps contre les caspases sont disponibles) et une autre pour évaluer la récupération de la protéine d’intérêt par Western blotting.
5. Mélanger 100 μL de chaque solution siRNA avec 100 μL de solution de réactif de transfection (étape 2.3) et incuber pendant 20-45 min à température ambiante pour former le complexe réactif siRNA-transfection.
6. Entre-temps, diviser et ajouter 1 x 10 5 cellules MDCK ou A549 dans 800 μL du milieu de croissance complet, mélanger avec 200 μL de complexe réactif siRNA-transfection (étape^2.5 ) et ajouter 1 mL de la suspension dans un puits d’une plaque de culture de 12 puits. Cette dilution porte la concentration finale de siRNA témoin ou de siRNA de caspase à 10 nM.
7. Incuber les cellules à 37 °C sous une atmosphère de 5% de CO₂ pendant 72 h.
8. Récolter les cellules d’une réplication comme à l’étape 1.10 et les traiter pour valider ou confirmer l’élimination de l’expression de la caspase 3, de la caspase 6 et de la caspase 7 par RT-qPCR ou Western blotting, respectivement, en utilisant des méthodes et protocoles standard ^8,11.
9. Infecter les cellules de l’autre réplication avec IAV comme décrit aux étapes 1.4-1.9 (sans inhibiteurs).
10. Après 24 h, prélever, traiter et analyser les cellules par transfert Western et mesurer et quantifier la récupération des protéines comme décrit aux étapes 1.10-1.20.

3. Mutagénèse dirigée pour localiser le(s) site(s) de clivage de la caspase dans le polypeptide

1. Cloner la protéine codant pour le gène d’intérêt dans un plasmide d’expression¹¹ chez un mammifère ou l’obtenir d’un laboratoire de recherche ou d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE: Il est préférable si le gène est cloné avec une étiquette épitopique ou en tant que fusion GFP pour distinguer le polypeptide exprimé ectopiquement de celui exprimé de manière endogène pendant le Western blotting.
2. À l’aide de bases de données de substrats de caspases 4 ou d’outils d’alignement protéique, localisez les motifs de clivage^de la caspase consensuels, XXXD et DXXD, sur le polypeptide. Presque tous les motifs de clivage des caspases possèdent l’acide aspartique au site de clivage (P1)^3,4.
3. Faire muter l’acide aspartique P1 putatif en acide glutamique ou en un acide aminé non polaire (alanine, valine) par mutagénèse dirigée suivie d’un séquençage de l’ADN¹¹ à l’aide de méthodes et de protocoles standard.
4. Délivrer l’ADN plasmidique de type sauvage (WT) et mutant aux cellules MDCK ou A549 par transfection^{inverse 11}.
   1. Pour cela, diluer 2 μg d’ADN plasmidique ou un volume recommandé du réactif de transfection dans 100 μL d’un milieu approprié (voir étape 2.3 et Tableau des matériaux) dans des tubes séparés, et incuber pendant 5 min à température ambiante.
   2. Mélanger 100 μL de chaque solution d’ADN plasmidique avec 100 μL de la solution de réactif de transfection et incuber pendant 20-45 min à température ambiante pour former le complexe de réactif de transfection ADN.
5. Entre-temps, diviser et ajouter 3 x 10⁵ cellules MDCK ou A549 à 800 μL du milieu de croissance complet, mélanger avec 200 μL de complexe de réactif de transfection d’ADN et ajouter la suspension de 1 mL à un puits d’une plaque de culture de 12 puits.
6. Incuber les cellules à 37 °C sous une atmosphère de 5% de CO₂ .
7. Après 48 h, infecter les cellules avec IAV comme décrit aux étapes 1.4-1.9 (sans ajouter les inhibiteurs).
8. Après 24 h, prélever, traiter et analyser les cellules par transfert Western (le cas échéant, en utilisant l’anticorps contre un marqueur d’épitope ou GFP). Ensuite, mesurez et quantifiez la récupération des protéines comme décrit aux étapes 1.10-1.20.

Résultats

Traitement par inhibiteur de la caspase 3
Il a été découvert que les polypeptides de cortactine, HDAC4 et HDAC6 de l’hôte subissent une dégradation en réponse à l’infection par le VAI dans les cellules canines (MDCK) et humaines (A549, NHBE) ^7,8,9. En utilisant les approches ci-dessus, il a été découvert que les caspases hôtes induites par l’IAV, en particulier les caspases 3, provoquent leur...

Discussion

Il est établi que les virus adaptent les facteurs et les voies de l’hôte à leur avantage. À leur tour, les cellules hôtes résistent à cela en employant diverses stratégies. L’une de ces stratégies est PANoptosis, que les cellules hôtes utilisent comme stratégie antivirale contre les infections virales. Cependant, des virus comme IAV ont développé leurs propres stratégies pour contrer PANoptosis et l’exploiter à leur avantage ^1,3,6

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
A549 cells	ATCC	CRM-CCL-185	Human, epithelial, lung
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Caspase 3 Inhibitor	Sigma-Aldrich	264156-M	Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Goat anti-NP antibody			Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	13778150
MDCK cells	ATCC	CCL-34	Dog, epithelial, kidney
MG132	Sigma-Aldrich	M7449
Minimum Essential Medium (MEM)	ThermoFisher Scientific	11095080	Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2	LI-COR		Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion	Addgene	50728	Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3	Sigma-Aldrich	NM_004346	siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6	Sigma-Aldrich	NM_001226	siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7	Sigma-Aldrich	NM_001227	siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs	Sigma-Aldrich	KSPQ12012	Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membrane	Cytiva (Fomerly GE Healthcare)	10600003
Rabbit anti-actin antibody	Abcam	ab8227
Rabbit anti-cortactin antibody	Cell Signaling	3502
Rabbit anti-GFP antibody	Takara	632592
SeeBlue Pre-stained Protein Standard	ThermoFisher Scientific	LC5625
Transfection medium, Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100	Merck
Trypsin, TPCK-Treated	Sigma-Aldrich	4370285