Identificando Caspases e seus motivos que clivam proteínas durante a infecção pelo vírus da gripe A

Resumo

A infecção pelo vírus da gripe A (IAV) ativa as caspases que clivam o hospedeiro e as proteínas virais, que, por sua vez, têm funções pró e antivirais. Empregando-se inibidores, interferência de RNA, mutagênese sítio-dirigida e técnicas de western blotting e RT-qPCR, foram identificadas caspases em células de mamíferos infectadas que clivam a cortactina do hospedeiro e as histonas desacetilases.

Resumo

Caspases, uma família de proteases de cisteína, orquestram a morte celular programada em resposta a vários estímulos, incluindo infecções microbianas. Inicialmente descrita como ocorrendo por apoptose, a morte celular programada é agora conhecida por abranger três vias interconectadas: piroptose, apoptose e necroptose, cunhadas juntas como um processo, PANoptose. Influência A infecção por vírus (IAV) induz a PANoptose em células de mamíferos, induzindo a ativação de diferentes caspases, que, por sua vez, clivam várias proteínas hospedeiras e virais, levando a processos como a ativação da resposta antiviral inata do hospedeiro ou a degradação de proteínas antagônicas do hospedeiro. A este respeito, a clivagem mediada pela caspase 3 da cortactina do hospedeiro, histona desacetilase 4 (HDAC4) e histona desacetilase 6 (HDAC6) foi descoberta em células epiteliais animais e humanas em resposta à infecção por IAV. Para demonstrar isso, foram empregados inibidores, interferência de RNA e mutagênese sítio-dirigida e, posteriormente, a clivagem ou resistência à clivagem e a recuperação dos polipeptídeos cortactina, HDAC4 e HDAC6 foram medidas por western blotting. Esses métodos, em conjunto com a RT-qPCR, formam uma estratégia simples, mas eficaz, para identificar o hospedeiro, bem como as proteínas virais submetidas à clivagem mediada pela caspase durante uma infecção por IAV ou outros vírus humanos e animais. O presente protocolo elabora os resultados representativos dessa estratégia, e também são discutidas as formas de torná-la mais eficaz.

Introdução

O vírus da gripe A (IAV) é o membro prototípico da família Orthomyxoviridae e é conhecido por causar epidemias globais e pandemias imprevisíveis. IAV causa doença respiratória humana, gripe, comumente conhecida como "gripe". A gripe é uma doença aguda que resulta na indução de respostas imunes inatas pró e anti-inflamatórias do hospedeiro e na morte de células epiteliais no trato respiratório humano. Ambos os processos são regidos por um fenômeno chamado morte celular programada¹. A sinalização para a morte celular programada é induzida assim que vários receptores de reconhecimento de patógenos detectam as partículas virais recebidas nas células hospedeiras. Isso leva à programação da morte de células infectadas e à sinalização para as células saudáveis vizinhas por três vias interconectadas chamadas piroptose, apoptose e necroptose - recentemente cunhadas como um processo, PANoptose¹.

A PANoptose envolve o processamento proteolítico de muitas proteínas hospedeiras e virais desde a indução até a execução. Esse processamento de proteínas é liderado principalmente por uma família de cisteínas proteases chamadas caspases ^1,2. Até 18 caspases (da caspase 1 à caspase 18) são conhecidas³. A maioria das caspases é expressa como pró-caspases e ativada por meio de seu próprio processamento proteolítico por autocatálise ou outras caspases⁴ em resposta a um estímulo como uma infecção por vírus. Acreditava-se que a PANoptose de células infectadas por IAV fosse um mecanismo de defesa do hospedeiro, mas a IAV desenvolveu maneiras de evitá-la e explorá-la para facilitar sua replicação ^1,2,5,6. Uma delas é antagonizar os fatores do hospedeiro por meio de clivagem ou degradação mediada por caspase que são inerentemente antivirais ou interferem em uma das etapas do ciclo de vida da IAV. Para esse fim, fatores do hospedeiro, cortactina, HDAC4 e HDAC6 foram descobertos como submetidos a clivagem ou degradação mediada por caspase em células epiteliais infectadas por IAV ^7,8,9. O HDAC4 e o HDAC6 são fatores anti-IAV 8,10, e a cortactina interfere na replicação do IAV em um estágio posterior da infecção^, potencialmente durante a montagem viral e brotamento ¹¹.

Além disso, várias caspases também são ativadas, que, por sua vez, clivam múltiplas proteínas para ativar a resposta inflamatória do hospedeiro durante a infecção por IAV ^1,2. Além disso, a nucleoproteína (NP), a proteína M2 do canal iônico da IAV 12,13,14 e várias proteínas de outros vírus 3,15,16 também sofrem clivagem mediada por caspase durante a infecção^, o que influencia a patogênese viral. Portanto, há uma necessidade contínua de estudar a clivagem mediada pela caspase ou a degradação das proteínas do hospedeiro e virais durante a IAV e outras infecções virais para entender a base molecular da patogênese viral. Neste documento, os métodos são apresentados para (1) avaliar a clivagem ou degradação de tais proteínas por caspases, (2) identificar essas caspases e (3) localizar os locais de clivagem.

Protocolo

As aprovações regulatórias foram obtidas do Comitê de Segurança Biológica Institucional da Universidade de Otago para trabalhar com o IAV e as células de mamíferos. Rim Canino de Madin-Darby (MDCK) ou células A549 epiteliais alveolares pulmonares humanas e subtipos IAV H1N1 foram utilizados para o presente estudo. A VAI foi cultivada em ovos de galinha, conforme descrito em outros^{lugares 17}. Condições estéreis e assépticas foram usadas para trabalhar com células de mamíferos, e uma instalação de Nível de Biossegurança 2 (ou Contenção Física 2) e um gabinete de biossegurança de Classe II foram usados para trabalhar com subtipos de IAV.

1. Avaliação da clivagem ou degradação de proteínas em células infectadas por IAV por caspases

1. Sementes 3 x 10⁵ células MDCK ou A549 por poço em uma placa de cultura celular de 12 poços.
   NOTA: Se estiver usando células MDCK, certifique-se de que o anticorpo contra a proteína de interesse reconheça sua espécie canina.
2. Semeia os poços em pares, ou seja, um par de controle - um poço para a amostra simulada não infectada e um para a amostra simulada infectada - e um par de teste - um poço para a amostra A de inibidor não infectado e um para a amostra A do inibidor infectado. Aumentar o número de pares com cada inibidor adicional (ver referências ^7,8).
3. Incubar as células a 37 °C sob uma atmosfera de 5% de CO₂ durante a noite.
4. No dia seguinte, infecte as células com IAV (um subtipo H1N1 ou outro subtipo).
   1. Para tal, preparar o inóculo do vírus diluindo o stock do vírus em 400 μL de meio essencial mínimo (MEM) isento de soro (ver Tabela de Materiais) a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,5-3,0 unidades formadoras de placas (pfu)/célula ^7,11 (um fator da duplicação do número de células no cálculo do MOI).
      NOTA: Para infectar células MDCK, complementar o inóculo do vírus com tosilfenilalanil clorometil cetona (TPCK)-tripsina a uma concentração final de 1 μg/mL.
5. Retirar o meio de cultura antigo das células (passo 1.3) e lavar as células com 1 ml/poço de MEM 2x sem soro.
6. Adicionar 400 μL de inóculo virado (etapa 1.4.1) às células e incubá-las durante 1 h a 35 °C sob uma atmosfera de CO₂ a 5%.
7. Enquanto isso, dilua um inibidor da caspase (por exemplo, Z-DEVD-FMK), um inibidor do lisossomo (por exemplo, NH₄Cl) ou um inibidor do proteassoma (por exemplo, MG132) (ver Tabela de Materiais) a uma concentração final de 40 μM, 20 mM ou 10 μM, respectivamente, na MEM⁷ livre de soro (ver Tabela de Materiais). Os dois últimos inibidores servem como controle. Diluir um volume igual do solvente (se não for água) utilizado para reconstituir um dos inibidores em meio isento de soro como simulação.
8. Remova o inóculo do vírus e lave as células como na etapa 1.5 (1x).
9. Adicione o MEM sem soro, 1 mL/poço, simulado ou suplementado com um inibidor, às células e incube as células como na etapa 1.6. Este ponto de tempo é considerado como 0 h de infecção.
10. Após 24 h, colha as células raspando-as com um êmbolo de seringa de 1 mL (lado da borracha) e transfira-as para um tubo de polipropileno de 1,5 mL.
11. Centrifugar o tubo a 12.000 x g durante 1-2 min à temperatura ambiente. Colete o sobrenadante usando uma pipeta.
    NOTA: Este sobrenadante pode ser descartado ou usado para um ensaio de placa⁸ para medir o título da progênie do vírus liberado.
12. Lavar o pellet celular com 250 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) por recentrifugação, como indicado no passo 1.11.
13. Remova o sobrenadante e lise as células adicionando 80-100 μL de tampão de lise celular (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5% de desoxicolato de sódio, 1% de Triton X-100 e 1x coquetel de inibidores de protease, ver Tabela de Materiais) e vórtice.
14. Aqueça o tubo a 98 °C durante 10 minutos para lisar completamente e preparar o lisado total das células. Armazene os lisados a 4 °C para executar as etapas 1.15-1.17 no dia seguinte, mas, para obter melhores resultados, termine essas etapas no mesmo dia.
15. Estimar a quantidade de proteína em cada amostra usando um kit de ensaio de BCA (consulte Tabela de Materiais).
16. Resolver quantidades iguais de proteína de amostras não infectadas e infectadas por eletroforese em gel de poliacrilamida padrão (SDS-PAGE)11 juntamente com marcadores de peso molecular ¹¹.
17. Transfira a proteína para uma membrana de nitrocelulose ou difluoreto de polivinilideno (PVDF) (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: A membrana PVDF pode fornecer um fundo alto em alguns imageadores de western blot; verifique a compatibilidade.
18. Realizar western blotting para detectar a proteína de interesse utilizando o método descrito em outro lugar¹¹.
19. Compare os níveis de proteína nas faixas de amostra infectadas tratadas com simulação e tratamento com inibidor.
    NOTA: Se o nível de proteína se recuperou na faixa de amostra infectada tratada com inibidor de caspase, a proteína é clivada ou degradada por caspases. Caso contrário, é degradado por lisossomo ou proteassoma.
20. Quantifique a recuperação de proteínas medindo sua intensidade de banda em cada pista a partir de pelo menos três repetições do mesmo experimento e normalizando-a com a banda de controle de carga correspondente.
21. Use qualquer imageador contemporâneo e software associado (consulte Tabela de Materiais) para obter imagens das manchas ocidentais e quantificar a recuperação de proteínas.

2. Confirmação de clivagem mediada por caspase ou degradação de proteínas em células infectadas por IAV por interferência de RNA

1. Projetar ou obter um RNA de pequena interferência (siRNA) pré-projeto visando a caspase 3 canina ou humana, a caspase 6 e a caspase 7 (caspases¹ do executor) e um siRNA de controle não direcionado (ver Tabela de Materiais).
2. Entregar cada siRNA às células MDCK ou A549 por transfecção reversa ^8,11.
3. Para isso, diluir em tubos separados 100 nM de siRNA de controle ou siRNA de caspase ou um volume recomendado de reagente de transfecção (ver Tabela de Materiais) em 100 μL de meio apropriado (como OptiMEM, ver Tabela de Materiais) e incubar por 5 min à temperatura ambiente.
4. Preparar cada diluição em duplicado.
   NOTA: Esta duplicata inclui uma réplica para analisar o knockdown da expressão de caspase por RT-qPCR ou western blotting (se anticorpos para caspases estiverem disponíveis) e outra para avaliar a recuperação da proteína de interesse por western blotting.
5. Misturar 100 μL de cada solução de siRNA com 100 μL de solução reagente de transfecção (passo 2.3) e incubar durante 20-45 min à temperatura ambiente para formar o complexo reagente de transfecção de siRNA.
6. Enquanto isso, dividir e adicionar 1 x 10 5 células MDCK ou A549 em 800 μL do meio de crescimento completo, misturar com 200 μL de complexo reagente de transfecção de siRNA (etapa^2.5 ) e adicionar 1 mL da suspensão a um poço de uma placa de cultura de 12 poços. Esta diluição eleva a concentração final de siRNA de controlo ou siRNA de caspase para 10 nM.
7. Incubar as células a 37 °C sob uma atmosfera de CO₂ a 5% durante 72 h.
8. Colher as células de uma replicação, como na etapa 1.10, e processá-las para validar ou confirmar a derrubada da expressão de caspase 3, caspase 6 e caspase 7 por RT-qPCR ou western blotting, respectivamente, usando métodos e protocolos padrão ^8,11.
9. Infecte as células na outra réplica com IAV, conforme descrito nas etapas 1.4-1.9 (sem inibidores).
10. Após 24 h, colhe, processe e analise as células por western blotting e meça e quantifique a recuperação de proteínas, conforme descrito nas etapas 1.10-1.20.

3. Mutagênese dirigida ao local para localizar o(s) sítio(s) de clivagem da caspase no polipeptídeo

1. Clone a proteína codificadora de genes de interesse em um plasmídeo de expressão de mamíferos¹¹ ou obtenha-a de um laboratório de pesquisa ou fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: É preferível que o gene seja clonado com uma etiqueta de epítopo ou como fusão de GFP para distinguir o polipeptídeo expresso ectopicamente do expresso endogenamente durante o western blotting.
2. Usando bancos de dados de substrato de caspase⁴ ou ferramentas de alinhamento de proteínas, localize os motivos de clivagem de caspase de consenso, XXXD e DXXD, no polipeptídeo. Quase todos os motivos de clivagem da caspase possuem o ácido aspártico no local da clivagem (P1)^3,4.
3. Mutar o ácido aspártico P1 putativo em ácido glutâmico ou um aminoácido não polar (alanina, valina) por mutagênese sítio-dirigida seguida de sequenciamento de DNA¹¹ usando métodos e protocolos padrão.
4. Entregar o DNA plasmidial do tipo selvagem (WT) e mutante às células MDCK ou A549 por transfecção reversa¹¹.
   1. Para tal, diluir 2 μg de ADN plasmídico ou um volume recomendado do reagente de transfecção em 100 μL de um meio adequado (ver passo 2.3 e Tabela de Materiais) em tubos separados e incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente.
   2. Misture 100 μL de cada solução de DNA plasmídico com 100 μL da solução reagente de transfecção e incube por 20-45 min à temperatura ambiente para formar o complexo reagente de transfecção de DNA.
5. Enquanto isso, divida e adicione 3 x 10⁵ células MDCK ou A549 a 800 μL do meio de crescimento completo, misture com 200 μL do complexo reagente de transfecção de DNA e adicione a suspensão de 1 mL a um poço de uma placa de cultura de 12 poços.
6. Incubar as células a 37 °C sob uma atmosfera de CO₂ a 5%.
7. Após 48 h, infectar as células com IAV, conforme descrito nas etapas 1.4-1.9 (sem adicionar os inibidores).
8. Após 24 h, colhe, processe e analise as células por western blotting (se aplicável, usando o anticorpo para uma etiqueta de epítopo ou GFP). Em seguida, meça e quantifique a recuperação da proteína, conforme descrito nas etapas 1.10-1.20.

Resultados

Tratamento com inibidor da caspase 3
Verificou-se que os polipeptídeos cortactina, HDAC4 e HDAC6 do hospedeiro sofrem degradação em resposta à infecção por IAV em células caninas (MDCK) e humanas (A549, NHBE) ^7,8,9. Utilizando as abordagens acima, descobriu-se que as caspases do hospedeiro induzidas por IAV, particularmente a caspase 3, causam sua degradação ^...

Discussão

Está estabelecido que os vírus adaptam os fatores e vias do hospedeiro para seu benefício. Por sua vez, as células hospedeiras resistem a isso, empregando várias estratégias. Uma dessas estratégias é a PANoptosis, que as células hospedeiras usam como estratégia antiviral contra infecções por vírus. No entanto, vírus como o IAV desenvolveram suas próprias estratégias para combater a PANoptose e explorá-la a seu favor ^1,3,6....

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
A549 cells	ATCC	CRM-CCL-185	Human, epithelial, lung
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Caspase 3 Inhibitor	Sigma-Aldrich	264156-M	Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Goat anti-NP antibody			Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	13778150
MDCK cells	ATCC	CCL-34	Dog, epithelial, kidney
MG132	Sigma-Aldrich	M7449
Minimum Essential Medium (MEM)	ThermoFisher Scientific	11095080	Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2	LI-COR		Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion	Addgene	50728	Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3	Sigma-Aldrich	NM_004346	siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6	Sigma-Aldrich	NM_001226	siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7	Sigma-Aldrich	NM_001227	siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs	Sigma-Aldrich	KSPQ12012	Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membrane	Cytiva (Fomerly GE Healthcare)	10600003
Rabbit anti-actin antibody	Abcam	ab8227
Rabbit anti-cortactin antibody	Cell Signaling	3502
Rabbit anti-GFP antibody	Takara	632592
SeeBlue Pre-stained Protein Standard	ThermoFisher Scientific	LC5625
Transfection medium, Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100	Merck
Trypsin, TPCK-Treated	Sigma-Aldrich	4370285