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要約

インフルエンザAウイルス(IAV)感染は、宿主およびウイルスタンパク質を切断するカスパーゼを活性化し、次に、プロウイルスおよび抗ウイルス機能を有する。阻害剤、RNA干渉、部位特異的突然変異誘発、およびウェスタンブロッティングおよびRT-qPCR技術を採用することにより、宿主コルタクチンおよびヒストンデアセチラーゼを切断する感染哺乳類細胞におけるカスパーゼが同定された。

要約

システインプロテアーゼのファミリーであるカスパーゼは、微生物感染を含むさまざまな刺激に応答してプログラムされた細胞死を調整します。当初はアポトーシスによって起こると説明されていましたが、プログラムされた細胞死は、パイロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシスの3つの相互接続された経路を含むことが現在知られており、一緒になって1つのプロセスであるパントーシスとして造られています。インフルエンスAウイルス(IAV)感染は、さまざまなカスパーゼの活性化を誘導することにより哺乳類細胞のパンノプトーシスを誘導し、さまざまな宿主およびウイルスタンパク質を切断し、宿主の自然抗ウイルス応答の活性化や拮抗宿主タンパク質の分解などのプロセスを引き起こします。これに関して、宿主コルタクチンのカスパーゼ3媒介切断、ヒストンデアセチラーゼ4(HDAC4)、およびヒストンデアセチラーゼ6(HDAC6)が、IAV感染に応答して動物およびヒト上皮細胞の両方で発見されている。これを実証するために、阻害剤、RNA干渉、および部位特異的突然変異誘発法を使用し、続いて、コルタクチン、HDAC4、およびHDAC6ポリペプチドの切断または切断に対する耐性および回収をウェスタンブロッティングによって測定しました。これらの方法は、RT-qPCRと組み合わせて、IAVまたは他のヒトおよび動物ウイルスの感染中にカスパーゼ媒介切断を受けている宿主およびウイルスタンパク質を同定するための単純でありながら効果的な戦略を形成します。本議定書は、この戦略の代表的な結果を詳述し、それをより効果的にする方法についても議論する。

概要

インフルエンザAウイルス(IAV)は、 オルトミクソウイルス科 のプロトタイプメンバーであり、世界的な流行と予測不可能なパンデミックを引き起こすことが知られています。IAVは、一般に「インフルエンザ」として知られているヒト呼吸器疾患、インフルエンザを引き起こします。インフルエンザは、宿主の炎症誘発性および抗炎症性の自然免疫応答の誘導とヒト気道の上皮細胞の死をもたらす急性疾患です。どちらのプロセスも、プログラムされた細胞死と呼ばれる現象によって支配されています1。プログラムされた細胞死のシグナル伝達は、さまざまな病原体認識受容体が宿主細胞に入ってくるウイルス粒子を感知するとすぐに誘導されます。これは、感染した細胞の死のプログラミングと、パイロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシスと呼ばれる3つの相互接続された経路による隣接する健康な細胞へのシグナル伝達につながります-最近、1つのプロセスとして造られました、 PANoptosis1。

PANoptosisは、誘導から実行までの多くの宿主およびウイルスタンパク質のタンパク質分解プロセスを含みます。このようなタンパク質のプロセシングは、主にカスパーゼ1,2と呼ばれるシステインプロテアーゼのファミリーによって主導されています。最大18個のカスパーゼ(カスパーゼ1からカスパーゼ18まで)が知られています3。ほとんどのカスパーゼはプロカスパーゼとして発現され、ウイルス感染のような刺激に応答して自己触媒または他のカスパーゼ4のいずれかによって独自のタンパク質分解処理を受けることによって活性化される。IAV感染細胞のPANoptosisは宿主防御機構であると考えられていましたが、IAVは、その複製を促進するためにそれを回避および悪用する方法を進化させました1,2,5,6。それらの1つは、本質的に抗ウイルス性であるか、IAVライフサイクルのステップの1つを妨害するカスパーゼ媒介性の切断または分解を介して宿主因子に拮抗することです。この目的のために、宿主因子であるコルタクチン、HDAC4、およびHDAC6は、IAV感染上皮細胞においてカスパーゼ媒介切断または分解を受けることが発見されている7、8、9。HDAC4およびHDAC6は抗IAV因子8,10であり、コルタクチンは感染の後期段階、潜在的にウイルスの集合および出芽中にIAV複製を妨害する11。

さらに、さまざまなカスパーゼも活性化され、それが次に複数のタンパク質を切断して、IAV感染中の宿主炎症反応を活性化します1,2。さらに、核タンパク質(NP)、IAV 12,13,14のイオンチャネルM2タンパク質、および他のウイルス3,15,16の様々なタンパク質も、感染中にカスパーゼ媒介切断を受け、ウイルスの病因に影響を与える。したがって、ウイルス病因の分子基盤を理解するために、IAVおよび他のウイルス感染中の宿主およびウイルスタンパク質のカスパーゼ媒介切断または分解を研究することが継続的に必要とされています。本明細書では、(1)カスパーゼによるそのようなタンパク質の切断または分解を評価し、(2)それらのカスパーゼを同定し、および(3)切断部位を特定するための方法が提示される。

プロトコル

オタゴ大学機関生物学的安全委員会から、IAVおよび哺乳類細胞を扱うための規制当局の承認が得られました。マディンダービーイヌ腎臓(MDCK)またはヒト肺胞上皮A549細胞およびIAV H1N1サブタイプが本研究に使用されました。IAVは、他の場所に記載されているように、鶏の卵で育てられました17。無菌および無菌条件を使用して哺乳類細胞を処理し、バイオセーフティレベル2(または物理的封じ込め2)施設とクラスIIバイオセーフティキャビネットを使用してIAVサブタイプを処理します。

1. カスパーゼによるIAV感染細胞におけるタンパク質の切断または分解の評価

  1. ウェルあたり3 x 105 MDCKまたはA549細胞を12ウェル細胞培養プレートに播種します。
    注:MDCK細胞を使用する場合は、目的のタンパク質に対する抗体がそのイヌ種を認識していることを確認してください。
  2. ウェルをペアで播種します、すなわち、対照ペア(感染していない模擬サンプル用のウェルと感染した模擬サンプル用のウェル)と、テストペア(感染していない阻害剤Aサンプル用のウェルと感染阻害剤Aサンプル用のウェル)をシードします。追加の阻害剤ごとにペアの数を増やします(参考文献7、8を参照)。
  3. 細胞を5%CO2 雰囲気下37°Cで一晩インキュベートする。
  4. 翌日、細胞にIAV(H1N1サブタイプまたは別のサブタイプ)を感染させます。
    1. このために、ウイルスストックを400μLの無血清最小必須培地(MEM)(材料の表を参照)で0.5〜3.0プラーク形成単位(pfu)/細胞7,11(MOIを計算するときの細胞数の倍増の倍率)の感染多重度(MOI)で希釈することにより、ウイルス接種材料を調製します。
      注:MDCK細胞に感染させるには、ウイルス接種源にトシルフェニルアラニルクロロメチルケトン(TPCK)-トリプシンを最終濃度1μg/mLで補給します。
  5. 細胞から古い培養液を取り出し(ステップ1.3)、1 mL/ウェルの無血清MEM 2xで細胞を洗浄します。
  6. 400 μLのウイルス接種材料を細胞に加え(ステップ1.4.1)、5%CO2 雰囲気下で35°Cで1時間インキュベートします。
  7. それまでの間、カスパーゼ阻害剤(Z-DEVD-FMKなど)、リソソーム阻害剤(NH4Clなど)、またはプロテアソーム阻害剤(MG132など)(材料の表を参照)を、無血清MEM7でそれぞれ最終濃度40 μM、20 mM、または10 μMに希釈します(材料の表を参照)。後者の2つの阻害剤は対照として役立つ。阻害剤の1つを無血清培地で再構成するために使用した溶媒(水以外の場合)をモックとして等容量に希釈します。
  8. ウイルスの接種材料を取り除き、ステップ1.5(1x)のように細胞を洗浄します。
  9. 無血清MEM、1 mL/ウェル、モック、または阻害剤を添加して細胞に加え、ステップ1.6と同様に細胞をインキュベートします。この時点は0時間の感染と見なされます。
  10. 24時間後、1 mLシリンジプランジャー(ゴム側)で細胞をこすって細胞を回収し、1.5 mLポリプロピレンチューブに移します。
  11. チューブを12,000 x g で室温で1〜2分間遠心分離します。ピペットを使用して上清を採取する。
    注:この上清は廃棄するか、プラークアッセイ8 に使用して、放出されたウイルス子孫の力価を測定することができます。
  12. ステップ1.11と同様に再遠心分離により、細胞ペレットを250 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。
  13. 上清を除去し、80〜100 μLの細胞溶解バッファー(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、1%Triton X-100、および1xプロテアーゼ阻害剤カクテル、 材料の表を参照)を添加して細胞を溶解し、ボルテックスします。
  14. チューブを98°Cで10分間加熱して完全に溶解し、全細胞溶解液を調製します。翌日手順1.15〜1.17を実行するためにライセートを4°Cで保管しますが、最良の結果を得るには、同じ日にこれらの手順を完了します。
  15. BCAアッセイキットを使用して、各サンプルのタンパク質量を推定します(材料の表を参照)。
  16. 標準SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)11 と分子量マーカー11により、感染していないサンプルと感染したサンプルから等量のタンパク質を分離します。
  17. タンパク質をニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜に移します( 材料表を参照)。
    注:PVDFメンブレンは、一部のウェスタンブロットイメージャーで高いバックグラウンドを与える場合があります。互換性を確認します。
  18. ウエスタンブロッティングを行い、他の11に記載の方法を用いて目的のタンパク質を検出する。
  19. 模擬処理された感染サンプルレーンと阻害剤処理された感染サンプルレーンのタンパク質レベルを比較します。
    注:カスパーゼ阻害剤で処理された感染サンプルレーンでタンパク質レベルが回復した場合、タンパク質はカスパーゼによって切断または分解されます。そうでなければ、それはリソソームまたはプロテアソームのいずれかによって分解される。
  20. 同じ実験の少なくとも3回の反復から各レーンでバンド強度を測定し、対応するローディングコントロールバンドで正規化することにより、タンパク質回収率を定量化します。
  21. 最新のイメージャーと関連ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、ウェスタンブロットをイメージングし、タンパク質回収率を定量化します。

2. RNA干渉によるIAV感染細胞におけるカスパーゼを介したタンパク質の切断または分解の確認

  1. イヌまたはヒトのカスパーゼ3、カスパーゼ6、およびカスパーゼ7(実行者カスパーゼ1)のいずれかを標的とする低分子干渉RNA(siRNA)およびノンターゲティングコントロールsiRNAを設計または取得します( 材料の表を参照)。
  2. 各siRNAをリバーストランスフェクションによりMDCKまたはA549細胞に送達する8,11。
  3. このためには、100 nMのコントロールsiRNAまたはカスパーゼsiRNA、または推奨量のトランスフェクション試薬( 材料の表を参照)を100 μLの適切な培地(OptiMEMなど、 材料の表を参照)で別のチューブで希釈し、室温で5分間インキュベートします。
  4. 各希釈液を2回に分けて調製する。
    注:この複製には、RT-qPCRまたはウェスタンブロッティング(カスパーゼに対する抗体が利用可能な場合)によるカスパーゼ発現のノックダウンを分析するための複製と、ウェスタンブロッティングによる目的のタンパク質の回収を評価するための複製が含まれます。
  5. 各siRNA溶液100 μLをトランスフェクション試薬溶液100 μLと混合し(ステップ2.3)、室温で20〜45分間インキュベートして、siRNA-トランスフェクション試薬複合体を形成します。
  6. その間に、800 μLの完全増殖培地に1 x 10 5 MDCKまたはA549細胞を分割して添加し、200 μLのsiRNAトランスフェクション試薬複合体と混合し(ステップ2.5 )、1 mLの懸濁液を12ウェル培養プレートのウェルに加えます。この希釈により、コントロールsiRNAまたはカスパーゼsiRNAの最終濃度は10 nMになります。
  7. 細胞を5%CO2雰囲気下37°Cで72 時間インキュベートします。
  8. ステップ1.10のように1回の複製から細胞を回収し、標準的な方法とプロトコル8,11を使用して、それぞれRT-qPCRまたはウェスタンブロッティングによってカスパーゼ3、カスパーゼ6、およびカスパーゼ7の発現のノックダウンを検証または確認するために処理します8,11。
  9. ステップ1.4〜1.9に記載されるようにIAVで複製する他の細胞を感染させる(阻害剤なし)。
  10. 24時間後、ウェスタンブロッティングにより細胞を回収、処理、および分析し、ステップ1.10〜1.20に記載されているようにタンパク質回収率を測定および定量します。

3. ポリペプチド中のカスパーゼ切断部位を特定するための部位特異的突然変異誘発

  1. 目的の遺伝子コードタンパク質を哺乳類発現プラスミド11 にクローニングするか、または研究室または市販のソースから入手してください( 材料の表を参照)。
    注:遺伝子をエピトープタグでクローニングするか、GFP融合としてクローニングして、ウェスタンブロッティング中に異所性発現ポリペプチドと内因性発現ポリペプチドを区別することが好ましい。
  2. カスパーゼ基質データベース4またはタンパク質アライメントツールを使用して、ポリペプチド上のコンセンサスカスパーゼ切断モチーフXXXDおよびDXXDを見つけます。ほとんどすべてのカスパーゼ切断モチーフは、切断部位(P1)にアスパラギン酸を持っています3,4。
  3. 推定P1アスパラギン酸をグルタミン酸または非極性アミノ酸(アラニン、バリン)に部位特異的突然変異誘発法とそれに続く標準的な方法およびプロトコルを使用したDNAシーケンシング11 によって変異させる。
  4. 野生型(WT)および変異型プラスミドDNAをリバーストランスフェクション11によりMDCKまたはA549細胞に送達する。
    1. そのためには、2 μgのプラスミドDNAまたは推奨容量のトランスフェクション試薬を100 μLの適切な培地(ステップ2.3および 材料表を参照)で別々のチューブで希釈し、室温で5分間インキュベートします。
    2. 各プラスミドDNA溶液100 μLとトランスフェクション試薬溶液100 μLを混合し、室温で20〜45分間インキュベートして、DNAトランスフェクション試薬複合体を形成します。
  5. その間に、3 x 105 MDCKまたはA549細胞を800 μLの完全増殖培地に分割して添加し、200 μLのDNAトランスフェクション試薬複合体と混合し、1 mL懸濁液を12ウェル培養プレートのウェルに加えます。
  6. 細胞を5%CO2 雰囲気下で37°Cでインキュベートする。
  7. 48時間後、ステップ1.4〜1.9に記載されているように細胞にIAVを感染させる(阻害剤を添加せずに)。
  8. 24時間後、細胞を回収、処理、およびウェスタンブロッティング(該当する場合、エピトープタグまたはGFPに対する抗体を使用)によって分析します。次いで、ステップ1.10〜1.20に記載のタンパク質回収率を測定および定量する。

結果

カスパーゼ3阻害剤による治療
宿主のコルタクチン、HDAC4、およびHDAC6ポリペプチドは、イヌ(MDCK)細胞とヒト(A549、NHBE)細胞の両方でIAV感染に応答して分解を受けることが発見されています7、8、9。上記のアプローチを使用することにより、IAV誘発宿主カスパーゼ、特にカスパーゼ3がそれらの分解を引き起こ?...

ディスカッション

ウイルスは宿主の要因と経路をその利益に合わせて調整することが確立されています。次に、宿主細胞はさまざまな戦略を採用することによってそれに抵抗します。それらの戦略の1つは、宿主細胞がウイルス感染に対する抗ウイルス戦略として使用するパンノプトーシスです。しかし、IAVのようなウイルスは、パンノプトーシスに対抗し、それを有利に利用するために独自の戦略を進化させ...

開示事項

著者には、開示する利益相反はありません。

謝辞

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
A549 cellsATCCCRM-CCL-185Human, epithelial, lung
Ammonium chlorideSigma-AldrichA9434
Caspase 3 InhibitorSigma-Aldrich264156-MAlso known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor CocktailRoche11836153001
Goat anti-NP antibodyGift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermoFisher Scientific31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection ReagentThermoFisher Scientific13778150
MDCK cellsATCCCCL-34Dog, epithelial, kidney
MG132Sigma-AldrichM7449
Minimum Essential Medium (MEM)ThermoFisher Scientific11095080Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1Sigma-AldrichSIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 LI-COROdyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion Addgene50728Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3Sigma-AldrichNM_004346siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6Sigma-AldrichNM_001226siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7Sigma-AldrichNM_001227siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairsSigma-AldrichKSPQ12012Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membraneCytiva (Fomerly GE Healthcare)10600003
Rabbit anti-actin antibodyAbcamab8227
Rabbit anti-cortactin antibodyCell Signaling3502
Rabbit anti-GFP antibodyTakara632592
SeeBlue Pre-stained Protein StandardThermoFisher ScientificLC5625
Transfection medium, Opti-MEMThermoFisher Scientific11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100Merck
Trypsin, TPCK-TreatedSigma-Aldrich4370285

参考文献

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