זיהוי קספאזות והמוטיבים שלהן שמבקעים חלבונים במהלך הידבקות בנגיף שפעת A

Summary

זיהום בנגיף שפעת A (IAV) מפעיל את הקספאזות שמבקעות חלבונים פונדקאיים ונוגפיים, אשר בתורם הם בעלי תפקידים פרו-ויראליים. על ידי שימוש במעכבים, הפרעות RNA, מוטגנזה מכוונת אתר, וטכניקות כתם מערביות ו- RT-qPCR, זוהו קספאזות בתאי יונקים נגועים המבקעים קורטקטין מארח והיסטון דאקטילאזות.

Abstract

Caspases, משפחה של פרוטאזות ציסטאין, מתזמרת מוות תאי מתוכנת בתגובה לגירויים שונים, כולל זיהומים מיקרוביאליים. מוות תאי מתוכנת, שתואר בתחילה כמתרחש על ידי אפופטוזיס, ידוע כיום כמקיף שלושה מסלולים הקשורים זה בזה: פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס, יחד נטבעו כתהליך אחד, PANoptosis. השפעה זיהום בנגיף (IAV) משרה PANoptosis בתאי יונקים על ידי גרימת הפעלה של קספאזות שונות, אשר בתורן מבקעות חלבונים מארחים שונים כמו גם ויראליים, מה שמוביל לתהליכים כמו הפעלת התגובה האנטי-ויראלית המולדת של המארח או השפלה של חלבונים מארחים אנטגוניסטיים. בהקשר זה, ביקוע קספאז 3 בתיווך של קורטקטין מארח, היסטון דאצטילאז 4 (HDAC4) והיסטון דאצטילאז 6 (HDAC6) התגלה הן בתאי אפיתל של בעלי חיים והן בתאי אפיתל אנושיים בתגובה לזיהום ב- IAV. כדי להדגים זאת, נעשה שימוש במעכבים, הפרעות RNA ומוטגנזה מכוונת אתר, ולאחר מכן, הבקיעה או ההתנגדות לביקוע וההתאוששות של פוליפפטידים של קורטקטין, HDAC4 ו- HDAC6 נמדדו על ידי כתם מערבי. שיטות אלה, בשילוב עם RT-qPCR, יוצרות אסטרטגיה פשוטה אך יעילה לזיהוי הפונדקאי, כמו גם חלבונים נגיפיים העוברים ביקוע בתיווך קספאז במהלך זיהום של IAV או נגיפים אחרים בבני אדם ובבעלי חיים. הפרוטוקול הנוכחי מפרט את התוצאות המייצגות של אסטרטגיה זו, והדרכים להפוך אותה ליעילה יותר נדונות גם הן.

Introduction

נגיף שפעת A (IAV) הוא חבר אב טיפוס במשפחת Orthomyxoviridae וידוע כגורם למגפות עולמיות ולמגפות בלתי צפויות. IAV גורם למחלה נשימתית אנושית, שפעת, הידועה בכינויה "שפעת". שפעת היא מחלה חריפה הגורמת להשראת תגובות חיסוניות מולדות פרו-דלקתיות ואנטי-דלקתיות ולמוות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה האנושיות. שני התהליכים נשלטים על ידי תופעה הנקראת מוות תאי מתוכנת¹. האיתות למוות תאי מתוכנת מושרה ברגע שקולטני זיהוי פתוגנים שונים חשים את חלקיקי הנגיף הנכנסים בתאים המארחים. זה מוביל לתכנות של מוות של תאים נגועים ואיתות לתאים בריאים שכנים על ידי שלושה מסלולים מחוברים הנקראים פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס - שנטבעו לאחרונה כתהליך אחד, PANoptosis¹.

PANoptosis כרוך בעיבוד פרוטאוליטי של חלבונים רבים של פונדקאים ונגיפים משלב האינדוקציה ועד לביצוע. עיבוד כזה של חלבונים מובל בעיקר על ידי משפחה של פרוטאזות ציסטאין הנקראות קספאזות ^1,2. עד 18 קספאזות (מקספאזה 1 עד קספאזה 18) ידועות³. רוב הקספאזות מבוטאות כפרו-קספאזות ומופעלות על ידי עיבוד פרוטאוליטי משלהן על ידי אוטוקטליזה או קספאזות^{אחרות 4} בתגובה לגירוי כמו זיהום בווירוס. ה-PANoptosis של תאים נגועים ב-IAV נחשב למנגנון הגנה מארח, אך IAV פיתח דרכים להתחמק ממנו ולנצל אותו כדי להקל על שכפולו 1,2,5,6. אחד מהם הוא לנטרל את הגורמים המארחים באמצעות ביקוע או השפלה בתיווך קספאז שהם אנטי-ויראליים מטבעם או מפריעים לאחד השלבים במחזור החיים של ה-IAV. לשם כך התגלו גורמים מארחים, קורטקטין, HDAC4 ו-HDAC6 שעברו ביקוע או השפלה בתיווך קספאז בתאי אפיתל נגועים ב-IAV ^7,8,9. ה-HDAC4 וה-HDAC6 הם גורמים אנטי-IAV^8,10, והקורטקטין מפריע לשכפול ה-IAV בשלב מאוחר יותר של ההדבקה^, באופן פוטנציאלי במהלך הרכבת הנגיף וניצנים ¹¹.

בנוסף, מופעלות גם קספאזות שונות, אשר בתורן מבקעות חלבונים מרובים כדי להפעיל את התגובה הדלקתית של המארח במהלך זיהום ב- IAV ^1,2. יתר על כן, נוקליאופרוטאין (NP), חלבון M2 תעלת יונים של IAV 12,13,14, וחלבונים שונים של נגיפים אחרים 3,15,16 עוברים גם הם ביקוע בתיווך קספאז במהלך ההדבקה^, המשפיע על פתוגנזה נגיפית. לכן, יש צורך מתמשך לחקור ביקוע בתיווך קספאז או השפלה של חלבונים מארחים ונגיפיים במהלך IAV וזיהומים נגיפיים אחרים כדי להבין את הבסיס המולקולרי של פתוגנזה נגיפית. כאן מוצגות השיטות כדי (1) להעריך את הבקיעה או הפירוק של חלבונים כאלה על ידי קספאזות, (2) לזהות את הקספאזות האלה, ו-(3) לאתר את אתרי הבקיעה.

Protocol

אישורים רגולטוריים התקבלו מוועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית של אוניברסיטת אוטגו לעבודה עם IAV ותאי יונקים. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בכליות כלבים של Madin-Darby (MDCK) או בתאי אפיתל A549 של ריאה אנושית ובתת-סוגים של IAV H1N1. IAV גודל בביצי עוף, כפי שתואר במקום אחר¹⁷. תנאים סטריליים ואספטיים שימשו לעבודה עם תאי יונקים, ומתקן Biosafety רמה 2 (או בלימה פיזית 2) וארון בטיחות ביולוגית מדרגה II שימשו לעבודה עם תת-סוגים של IAV.

1. הערכת ביקוע או פירוק של חלבונים בתאים נגועים ב-IAV על ידי קספאזות

1. זרע 3 x 10⁵ תאי MDCK או A549 לכל באר בצלחת תרבית תאים של 12 בארות.
   הערה: אם אתם משתמשים בתאי MDCK, ודאו שהנוגדן כנגד החלבון המעניין מזהה את המין הכלבי שלו.
2. זרעו את הבארות בזוגות, כלומר, זוג בקרה - אחת טובה עבור הדגימה הלא נגועה ואחת עבור הדגימה הנגועה-מדומה - וזוג בדיקה - אחת טובה עבור מעכב לא נגוע דגימה ואחת עבור מעכב נגוע דגימה A. הגדל את מספר הזוגות עם כל מעכב נוסף (ראה הפניות ^7,8).
3. דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO₂ במהלך הלילה.
4. למחרת, להדביק את התאים עם IAV (תת-סוג H1N1 או תת-סוג אחר).
   1. לשם כך, הכינו את החיסון של הנגיף על ידי דילול מלאי הנגיף ב-400 μL של מדיום חיוני מינימלי ללא סרום (MEM) (ראו טבלת חומרים) בריבוי של זיהום (MOI) של 0.5-3.0 יחידות יוצרות פלאק (pfu)/תא ^7,11 (גורם להכפלת מספר התא בעת חישוב ה-MOI).
      הערה: להדבקת תאי MDCK, השלימו את הנגיף אינוקולום בטוסיל פנילאניל כלורומתיל קטון (TPCK)-טריפסין בריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל.
5. הסר את מדיום התרבית הישן מהתאים (שלב 1.3) ושטוף את התאים עם 1 מ"ל/באר של MEM 2x ללא סרום.
6. הוסיפו 400 μL של נגיף אינוקולום (שלב 1.4.1) לתאים ודגרו אותם במשך שעה אחת ב-35 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% CO₂ .
7. בינתיים, יש לדלל מעכב קספאז (לדוגמה, Z-DEVD-FMK), מעכב ליזוזום (לדוגמה, NH₄Cl), או מעכב פרוטאזום (לדוגמה, MG132) (ראו טבלת חומרים) בריכוז סופי של 40 מיקרומטר, 20 mM או 10 μM, בהתאמה, ב-MEM⁷ נטול סרום (ראו טבלת חומרים). שני המעכבים האחרונים משמשים כבקרה. לדלל נפח שווה של הממס (אם אינו מים) המשמש לשחזור אחד המעכבים בתווך נטול סרום כדמה.
8. הסר את הנגיף inoculum ולשטוף את התאים כמו בשלב 1.5 (1x).
9. הוסיפו לתאים את ה-MEM נטול הסרום, 1 מ"ל/טוב, לעג או תוסף עם מעכב, והדגירו את התאים כמו בשלב 1.6. נקודת זמן זו נחשבת כהדבקה של 0 שעות.
10. לאחר 24 שעות, לקצור את התאים על ידי גירוד אותם עם בוכנה מזרק 1 מ"ל (צד גומי) ולהעביר אותם לתוך צינור פוליפרופילן 1.5 מ"ל.
11. צנטריפוגה את הצינור ב 12,000 x גרם במשך 1-2 דקות בטמפרטורת החדר. לאסוף את supernatant באמצעות פיפטה.
    הערה: ניתן להשליך את ה-supernatant הזה או להשתמש בו^לבדיקת רובד 8 כדי למדוד את הטיטר של צאצאי הנגיף ששוחררו.
12. שטפו את כדור התא עם 250 μL של תמיסת מלח עם אגירת פוספט (PBS) על ידי צנטריפוגה מחדש כמו בשלב 1.11.
13. הסר את הסופרנטנט וליטף את התאים על ידי הוספת 80-100 μL של חיץ תזה של התא (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% נתרן דודציל סולפט (SDS), 0.5% נתרן דאוקסיכולאט, 1% טריטון X-100, וקוקטייל מעכב פרוטאז 1x, ראה טבלת חומרים) ומערבולות.
14. מחממים את הצינור בטמפרטורה של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לליז לחלוטין ולהכין את סך התא ליזאט. אחסן את הליזטים בטמפרטורה של 4 °C לביצוע שלבים 1.15-1.17 למחרת, אך לקבלת התוצאות הטובות ביותר, סיים שלבים אלה באותו יום.
15. הערך את כמות החלבון בכל דגימה באמצעות ערכת בדיקה של חומצות אמינו מסועפות שרשרת (ראו טבלת חומרים).
16. פתור כמויות שוות של חלבון מדגימות לא נגועות ונגועות על ידי אלקטרופורזה סטנדרטית של ג'ל SDS-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE)11 יחד עם סמני משקל מולקולריים ¹¹.
17. מעבירים את החלבון לממברנת ניטרוצלולוז או פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) (ראו טבלת חומרים).
    הערה: קרום PVDF עשוי לתת רקע גבוה בחלק מתמונות הכתם המערביות; בדוק תאימות.
18. בצע כתם מערבי כדי לזהות את החלבון המעניין בשיטה המתוארת במקום אחר¹¹.
19. השווה את רמות החלבון בנתיבי הדגימה הנגועים שטופלו במדומה ובמעכבים.
    הערה: אם רמת החלבון התאוששה במסלול הדגימה הנגועה שטופלה במעכבי קספאז, החלבון נבקע או מתפרק על ידי קספאזות. אחרת, הוא מושפל על ידי ליזוזום או פרוטאזום.
20. כימות התאוששות החלבון על ידי מדידת עוצמת הפסים שלו בכל נתיב מלפחות שלושה שכפולים של אותו ניסוי ונרמול שלו עם רצועת בקרת ההעמסה המתאימה.
21. השתמש בכל תמונה עכשווית ובתוכנה הקשורה אליה (ראה טבלת חומרים) כדי לדמות את הכתמים המערביים ולכמת את התאוששות החלבון.

2. אישור על ביקוע בתיווך קספאז או פירוק חלבונים בתאים נגועים ב-IAV על ידי הפרעות RNA

1. תכנון או השגה של RNA (siRNA) מתערב קטן בתכנון מראש המכוון לכלבים או לבני אדם caspase 3, caspase 6 ו-caspase 7 (caspases¹ של התליין) ו-siRNA בקרה שאינו ממוקד (ראו טבלת חומרים).
2. העבר כל siRNA לתאי MDCK או A549 על-ידי העברה הפוכה^{של 8,11.}
3. לשם כך, יש לדלל בצינורות נפרדים 100 ננומטר של siRNA בקרה או caspase siRNA או נפח מומלץ של מגיב טרנספקציה (ראו טבלת חומרים) ב-100 μL של מדיום מתאים (כמו OptiMEM, ראו טבלת חומרים), ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
4. הכינו כל דילול בשכפול.
   הערה: שכפול זה כולל שכפול אחד לניתוח ההדחה של ביטוי קספאז על ידי RT-qPCR או כתם מערבי (אם קיימים נוגדנים לקספאזות) ושכפול אחר להערכת ההתאוששות של החלבון המעניין על ידי כתם מערבי.
5. יש לערבב 100 μL של כל תמיסת siRNA עם 100 μL של תמיסת ריאגנט טרנספקציה (שלב 2.3) ולדגור במשך 20-45 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור את קומפלקס הריאגנטים siRNA-transfection.
6. בינתיים, פצלו והוסיפו 1 x 10⁵ תאי MDCK או A549 ב-800 μL של מדיום הגידול השלם, ערבבו עם 200 μL של קומפלקס מגיבי siRNA-transfection (שלב 2.5), והוסיפו 1 מ"ל של המתלה לבאר של צלחת תרבית של 12 בארות. דילול זה מביא את הריכוז הסופי של siRNA בקרה או caspase siRNA ל 10 ננומטר.
7. דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% CO₂ למשך 72 שעות.
8. קצור את התאים משכפול אחד כמו בשלב 1.10, ועבד אותם כדי לאמת או לאשר את ההפלה של הביטוי של caspase 3, caspase 6 ו- caspase 7 על ידי RT-qPCR או כתם מערבי, בהתאמה, באמצעות שיטות סטנדרטיות ופרוטוקולים ^8,11.
9. להדביק את התאים באחרים להשתכפל עם IAV כמתואר בשלבים 1.4-1.9 (ללא מעכבים).
10. לאחר 24 שעות, קציר, עיבוד וניתוח התאים על ידי כתם מערבי ומדידה וכימות של התאוששות החלבון כמתואר בשלבים 1.10-1.20.

3. מוטגנזה מכוונת אתר לאיתור אתרי הבקיעה הקספאזית בפוליפפטיד

1. שכפלו את החלבון המקודד גנים בעל עניין בפלסמיד¹¹ של ביטוי יונקים או השיגו אותו ממעבדת מחקר או ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).
   הערה: עדיף אם הגן משובט בתג אפיטופ או כאיחוי GFP כדי להבחין בין הפוליפפטיד המתבטא באופן אקטופי לבין זה המובע באופן אנדוגני במהלך הכתם המערבי.
2. באמצעות מסדי נתונים של מצע קספאז⁴ או כלי יישור חלבונים, אתר את מוטיבים הקונצנזוס של מחשוף קספאז, XXXD ו- DXXD, על הפוליפפטיד. כמעט כל מוטיבים של מחשוף קספאז מכילים את החומצה האספרטית באתר המחשוף (P1)^3,4.
3. מוטציה של חומצה אספרטית P1 פוטטיבית לחומצה גלוטמית או חומצת אמינו לא קוטבית (אלנין, ואלין) על ידי מוטגנזה מכוונת אתר ואחריה ריצוף DNA¹¹ באמצעות שיטות ופרוטוקולים סטנדרטיים.
4. העבירו את הדנ"א מסוג בר (WT) ופלסמיד מוטנטי לתאי MDCK או A549 על-ידי העברה הפוכה¹¹.
   1. לשם כך, יש לדלל 2 מיקרוגרם של דנ"א פלסמיד או נפח מומלץ של מגיב הטרנספקציה ב-100 μL של מדיום מתאים (ראו שלב 2.3 וטבלת חומרים) בצינורות נפרדים, ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. יש לערבב 100 μL של כל תמיסת DNA פלסמידית עם 100 μL של תמיסת מגיב הטרנספקציה ולדגור במשך 20-45 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור את קומפלקס מגיב ה- DNA-transfection.
5. בינתיים, פצלו והוסיפו 3 x 10 5^{תאי MDCK} או A549 ל-800 μL של מדיום הגידול השלם, ערבבו עם 200 μL של קומפלקס ריאגנטים של DNA-transfection, והוסיפו את התרחיף של 1 מ"ל לבאר של צלחת תרבית של 12 בארות.
6. דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% CO₂ .
7. לאחר 48 שעות, הדביקו את התאים ב-IAV כמתואר בשלבים 1.4-1.9 (מבלי להוסיף את המעכבים).
8. לאחר 24 שעות, קציר, עיבוד וניתוח התאים על ידי כתם מערבי (אם רלוונטי, באמצעות הנוגדן לתג אפיטופ או GFP). לאחר מכן, מדוד וכמת את התאוששות החלבון כמתואר בשלבים 1.10-1.20.

תוצאות

טיפול במעכב קספז 3
התגלה כי פוליפפטידים של קורטקטין מארח, HDAC4 ו-HDAC6 עוברים פירוק בתגובה לזיהום ב-IAV הן בתאי הכלבים (MDCK) והן בתאי האדם (A549, NHBE) ^7,8,9. על ידי שימוש בגישות הנ"ל, נחשף כי קספאזות מארחות המושרות על ידי IAV, במיוחד caspase 3, גורמות ?...

Discussion

נקבע כי וירוסים מתאימים את הגורמים והמסלולים המארחים לטובתם. בתורו, התאים המארחים מתנגדים לכך על ידי שימוש באסטרטגיות שונות. אחת מאותן אסטרטגיות היא PANoptosis, שבה משתמשים תאים מארחים כאסטרטגיה אנטי-ויראלית נגד זיהומים בנגיף. עם זאת, וירוסים כמו IAV פיתחו אסטרטגיות משלהם כדי להתמודד עם PANoptosis ו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A549 cells	ATCC	CRM-CCL-185	Human, epithelial, lung
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Caspase 3 Inhibitor	Sigma-Aldrich	264156-M	Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Goat anti-NP antibody			Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	13778150
MDCK cells	ATCC	CCL-34	Dog, epithelial, kidney
MG132	Sigma-Aldrich	M7449
Minimum Essential Medium (MEM)	ThermoFisher Scientific	11095080	Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2	LI-COR		Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion	Addgene	50728	Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3	Sigma-Aldrich	NM_004346	siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6	Sigma-Aldrich	NM_001226	siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7	Sigma-Aldrich	NM_001227	siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs	Sigma-Aldrich	KSPQ12012	Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membrane	Cytiva (Fomerly GE Healthcare)	10600003
Rabbit anti-actin antibody	Abcam	ab8227
Rabbit anti-cortactin antibody	Cell Signaling	3502
Rabbit anti-GFP antibody	Takara	632592
SeeBlue Pre-stained Protein Standard	ThermoFisher Scientific	LC5625
Transfection medium, Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100	Merck
Trypsin, TPCK-Treated	Sigma-Aldrich	4370285