Identifizierung von Caspasen und ihren Motiven, die Proteine während einer Influenza-A-Virusinfektion spalten

Zusammenfassung

Die Infektion mit dem Influenza-A-Virus (IAV) aktiviert die Caspasen, die Wirts- und Virusproteine spalten, die wiederum pro- und antivirale Funktionen haben. Durch den Einsatz von Inhibitoren, RNA-Interferenz, ortsgerichteter Mutagenese und Western Blotting und RT-qPCR-Techniken wurden Caspasen in infizierten Säugetierzellen identifiziert, die Wirtscortactin- und Histon-Deacetylasen spalten.

Zusammenfassung

Caspasen, eine Familie von Cysteinproteasen, orchestrieren den programmierten Zelltod als Reaktion auf verschiedene Reize, einschließlich mikrobieller Infektionen. Ursprünglich als Apoptose beschrieben, ist heute bekannt, dass der programmierte Zelltod drei miteinander verbundene Wege umfasst: Pyroptose, Apoptose und Nekroptose, die zusammen als ein Prozess, PANoptose, bezeichnet werden. Einfluss Eine Virusinfektion (IAV) induziert PANoptose in Säugetierzellen, indem sie die Aktivierung verschiedener Caspasen induziert, die wiederum verschiedene Wirts- und virale Proteine spalten, was zu Prozessen wie der Aktivierung der angeborenen antiviralen Antwort des Wirts oder dem Abbau antagonistischer Wirtsproteine führt. In dieser Hinsicht wurde eine Caspase-3-vermittelte Spaltung von Wirtscortactin, Histon-Deacetylase 4 (HDAC4) und Histon-Deacetylase 6 (HDAC6) sowohl in tierischen als auch in menschlichen Epithelzellen als Reaktion auf die IAV-Infektion entdeckt. Um dies zu demonstrieren, wurden Inhibitoren, RNA-Interferenz und ortsgerichtete Mutagenese eingesetzt, und anschließend wurden die Spaltung oder Resistenz gegen Spaltung und die Erholung von Cortactin-, HDAC4- und HDAC6-Polypeptiden durch Western Blotting gemessen. Diese Methoden bilden in Verbindung mit der RT-qPCR eine einfache, aber effektive Strategie, um den Wirt sowie virale Proteine zu identifizieren, die während einer Infektion mit IAV oder anderen menschlichen und tierischen Viren eine Caspase-vermittelte Spaltung durchlaufen. Das vorliegende Protokoll erarbeitet die repräsentativen Ergebnisse dieser Strategie, und es werden auch die Möglichkeiten diskutiert, sie wirksamer zu gestalten.

Einleitung

Das Influenza-A-Virus (IAV) ist das prototypische Mitglied der Familie der Orthomyxoviridae und ist dafür bekannt, globale Epidemien und unvorhersehbare Pandemien zu verursachen. IAV verursacht menschliche Atemwegserkrankungen, Influenza, allgemein bekannt als "Grippe". Die Grippe ist eine akute Erkrankung, die zur Induktion wirtspro- und entzündungshemmender angeborener Immunantworten und zum Absterben von Epithelzellen in den menschlichen Atemwegen führt. Beide Prozesse werden von einem Phänomen gesteuert, das als programmierter Zelltod^{bezeichnet wird 1}. Die Signalisierung für den programmierten Zelltod wird induziert, sobald verschiedene Erregererkennungsrezeptoren die ankommenden Viruspartikel in Wirtszellen wahrnehmen. Dies führt zur Programmierung des Todes infizierter Zellen und zur Signalisierung an die benachbarten gesunden Zellen durch drei miteinander verbundene Signalwege, die Pyroptose, Apoptose und Nekroptose genannt werden - kürzlich als ein Prozess, PANoptose¹, geprägt.

Die PANoptose beinhaltet die proteolytische Verarbeitung vieler Wirts- und Virusproteine von der Induktion bis zur Ausführung. Diese Verarbeitung von Proteinen wird hauptsächlich von einer Familie von Cysteinproteasen angeführt, die Caspasen ^1,2 genannt werden. Bis zu 18 Caspasen (von Caspase 1 bis Caspase 18) sind bekannt³. Die meisten Caspasen werden als Pro-Caspasen exprimiert und durch ihre eigene proteolytische Verarbeitung entweder durch Autokatalyse oder andere Caspasen⁴ als Reaktion auf einen Reiz wie eine Virusinfektion aktiviert. Die PANoptose von IAV-infizierten Zellen wurde als Abwehrmechanismus des Wirts angesehen, aber IAV hat Wege entwickelt, um sie zu umgehen und auszunutzen, um ihre Replikation zu erleichtern 1,2,5,6. Eine davon besteht darin, die Wirtsfaktoren durch Caspase-vermittelte Spaltung oder Abbau zu antagonisieren, die entweder inhärent antiviral sind oder einen der Schritte des IAV-Lebenszyklus stören. Zu diesem Zweck wurde entdeckt, dass die Wirtsfaktoren Cortactin, HDAC4 und HDAC6 in IAV-infizierten Epithelzellen eine Caspase-vermittelte Spaltung oder Degradation durchlaufen ^7,8,9. HDAC4 und HDAC6 sind Anti-IAV-Faktoren 8,10, und Cortactin stört die IAV-Replikation in einem späteren Stadium der Infektion^, möglicherweise während der viralen Assemblierung und Knospung ¹¹.

Darüber hinaus werden auch verschiedene Caspasen aktiviert, die wiederum mehrere Proteine spalten, um die Entzündungsreaktion des Wirts während der IAV-Infektion zu aktivieren ^1,2. Darüber hinaus durchlaufen Nukleoprotein (NP), Ionenkanal-M2-Protein von IAV 12,13,14 und verschiedene Proteine anderer Viren 3,15,16 während der Infektion ebenfalls eine Caspase-vermittelte Spaltung, die die virale Pathogenese beeinflusst. Daher besteht ein kontinuierlicher Bedarf, die Caspase-vermittelte Spaltung oder den Abbau von Wirts- und Virusproteinen während IAV- und anderer Virusinfektionen zu untersuchen, um die molekularen Grundlagen der viralen Pathogenese zu verstehen. Hierin werden die Verfahren vorgestellt, um (1) die Spaltung oder den Abbau solcher Proteine durch Caspasen zu bewerten, (2) diese Caspasen zu identifizieren und (3) die Spaltstellen zu lokalisieren.

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Protokoll

Die behördlichen Genehmigungen wurden vom University of Otago Institutional Biological Safety Committee für die Arbeit mit IAV- und Säugetierzellen eingeholt. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) oder humane alveoläre Lungenepithelzellen A549 und IAV H1N1 Subtypen wurden für die vorliegende Studie verwendet. IAV wurde in Hühnereiern gezüchtet, wie an anderer Stelle^{beschrieben 17}. Für die Arbeit mit Säugetierzellen wurden sterile und aseptische Bedingungen verwendet, und eine Biosicherheitseinrichtung der Stufe 2 (oder Physical Containment 2) und eine Biosicherheitswerkbank der Klasse II wurden verwendet, um mit IAV-Subtypen zu arbeiten.

1. Beurteilung der Spaltung oder des Abbaus von Proteinen in IAV-infizierten Zellen durch Caspasen

1. Samen Sie 3 x 10⁵ MDCK- oder A549-Zellen pro Vertiefung in einer 12-Well-Zellkulturplatte.
   HINWEIS: Wenn Sie MDCK-Zellen verwenden, stellen Sie sicher, dass der Antikörper gegen das interessierende Protein seine Hundeart erkennt.
2. Saaten Sie die Vertiefungen paarweise, d. h. ein Kontrollpaar - eine Vertiefung für die nicht infizierte Scheinprobe und eine für die infizierte Scheinprobe - und ein Testpaar - eine Vertiefung für die nicht infizierte Inhibitor-A-Probe und eine für die infizierte Inhibitor-A-Probe. Erhöhen Sie die Anzahl der Paare mit jedem zusätzlichen Inhibitor (siehe Referenzen ^7,8).
3. Die Zellen werden über Nacht bei 37 °C unter 5%_{CO2-Atmosphäre} inkubiert.
4. Am nächsten Tag infizieren Sie die Zellen mit IAV (einem H1N1-Subtyp oder einem anderen Subtyp).
   1. Bereiten Sie dazu das Virusinokulum vor, indem Sie den Virusbestand in 400 μL serumfreies minimum essential medium (MEM) (siehe Materialtabelle) bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,5-3,0 plaquebildenden Einheiten (pfu)/Zelle ^7,11 (ein Faktor der Verdoppelung der Zellzahl bei der Berechnung des MOI) verdünnen.
      HINWEIS: Um MDCK-Zellen zu infizieren, ergänzen Sie das Virusinokulum mit Tosylphenylalanylchlormethylketon (TPCK)-Trypsin in einer Endkonzentration von 1 μg / ml.
5. Entfernen Sie das alte Kulturmedium aus den Zellen (Schritt 1.3) und waschen Sie die Zellen mit 1 ml/Vertiefung serumfreiem MEM 2x.
6. 400 μL Virusinokulum (Schritt 1.4.1) in die Zellen geben und 1 h bei 35 °C unter 5%_{CO2-Atmosphäre} inkubieren.
7. In der Zwischenzeit verdünnen Sie einen Caspase-Inhibitor (z. B. Z-DEVD-FMK), einen Lysosom-Inhibitor (z. B. NH₄Cl) oder einen Proteasom-Inhibitor (z. B. MG132) (siehe Materialtabelle) bei einer Endkonzentration von 40 μM, 20 mM bzw. 10 μM in serumfreiem MEM⁷ (siehe Materialtabelle). Die beiden letztgenannten Inhibitoren dienen als Kontrolle. Verdünnen Sie ein gleiches Volumen des Lösungsmittels (falls nicht Wasser), das verwendet wird, um einen der Inhibitoren in serumfreiem Medium als Mock zu rekonstituieren.
8. Entfernen Sie das Virusinokulum und waschen Sie die Zellen wie in Schritt 1.5 (1x).
9. Geben Sie das serumfreie MEM, 1 ml/Well, mock oder ergänzt mit einem Inhibitor, zu den Zellen und inkubieren Sie die Zellen wie in Schritt 1.6. Dieser Zeitpunkt wird als 0 h Infektion betrachtet.
10. Nach 24 h ernten Sie die Zellen, indem Sie sie mit einem 1-ml-Spritzenkolben (Gummiseite) abkratzen und in ein 1,5-ml-Polypropylenröhrchen überführen.
11. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 12.000 x g für 1-2 min bei Raumtemperatur. Sammeln Sie den Überstand mit einer Pipette.
    HINWEIS: Dieser Überstand könnte verworfen oder für einen Plaque-Assay⁸ verwendet werden, um den Titer der freigesetzten Virusnachkommen zu messen.
12. Das Zellpellet wird mit 250 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch Rezentrifugation wie in Schritt 1.11 gewaschen.
13. Entfernen Sie den Überstand und lysieren Sie die Zellen durch Zugabe von 80-100 μL Zelllysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5% Natriumdesoxycholat, 1% Triton X-100 und 1x Proteaseinhibitor-Cocktail, siehe Materialtabelle) und Vortexing.
14. Erhitzen Sie das Röhrchen bei 98 °C für 10 min, um das gesamte Zelllysat vollständig zu lysieren und vorzubereiten. Lagern Sie die Lysate bei 4 °C, um die Schritte 1.15-1.17 am nächsten Tag durchzuführen, aber beenden Sie diese Schritte am selben Tag, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
15. Schätzen Sie die Proteinmenge in jeder Probe mit einem BCA-Assay-Kit (siehe Materialtabelle).
16. Gleiche Mengen an Protein aus nicht infizierten und infizierten Proben werden durch Standard-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)11 zusammen mit Molekulargewichtsmarkern¹¹ aufgelöst.
17. Übertragen Sie das Protein auf eine Nitrocellulose- oder Polyvinylidendifluorid-Membran (PVDF) (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: PVDF-Membran kann bei einigen Western Blot-Imagern einen hohen Hintergrund erzeugen. Überprüfen Sie die Kompatibilität.
18. Führen Sie Western Blotting durch, um das interessierende Protein unter Verwendung der an anderer Stelle beschriebenen Methode^{nachzuweisen. 11}.
19. Vergleichen Sie die Proteinspiegel in den simuliert behandelten und inhibitorbehandelten infizierten Probenbahnen.
    HINWEIS: Wenn sich der Proteingehalt in der mit Caspase-Inhibitoren behandelten infizierten Probenbahn erholt hat, wird das Protein durch Caspasen gespalten oder abgebaut. Andernfalls wird es entweder durch Lysosom oder Proteasom abgebaut.
20. Quantifizieren Sie die Proteinrückgewinnung, indem Sie ihre Bandenintensität in jeder Spur aus mindestens drei Wiederholungen desselben Experiments messen und mit dem entsprechenden Belastungskontrollband normalisieren.
21. Verwenden Sie einen modernen Imager und zugehörige Software (siehe Materialtabelle), um die westlichen Blots abzubilden und die Proteinregeneration zu quantifizieren.

2. Bestätigung der Caspase-vermittelten Spaltung oder des Abbaus von Proteinen in IAV-infizierten Zellen durch RNA-Interferenz

1. Entwerfen oder erhalten Sie eine Pre-Design-Small-interfering-RNA (siRNA), die entweder auf Hunde oder menschliche Caspase 3, Caspase 6 und Caspase 7 (Henker-Caspasen¹) abzielt, und eine nicht-zielgerichtete Kontroll-siRNA (siehe Materialtabelle).
2. Jede siRNA wird durch umgekehrte Transfektion ^8,11 an MDCK- oder A549-Zellen abgegeben.
3. Dazu werden 100 nM Kontroll-siRNA oder Caspase-siRNA oder ein empfohlenes Volumen Transfektionsreagenz (siehe Materialtabelle) in 100 μL geeignetem Medium (wie OptiMEM, siehe Materialtabelle) in separaten Röhrchen verdünnt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
4. Jede Verdünnung wird in zweifacher Ausfertigung vorbereitet.
   HINWEIS: Dieses Duplikat enthält ein Replikat zur Analyse des Knockdowns der Caspase-Expression durch RT-qPCR oder Western Blotting (wenn Antikörper gegen Caspasen verfügbar sind) und ein weiteres zur Beurteilung der Erholung des interessierenden Proteins durch Western Blotting.
5. Mischen Sie 100 μL jeder siRNA-Lösung mit 100 μL Transfektionsreagenzlösung (Schritt 2.3) und inkubieren Sie für 20-45 min bei Raumtemperatur, um den siRNA-Transfektionsreagenzkomplex zu bilden.
6. In der Zwischenzeit werden 1 x 10 5 MDCK- oder A549-Zellen in 800 μL des kompletten Wachstumsmediums aufgeteilt und hinzugefügt, mit 200 μL siRNA-Transfektionsreagenzkomplex gemischt (Schritt^2.5 ) und 1 ml der Suspension in eine Vertiefung einer 12-Well-Kulturplatte gegeben. Diese Verdünnung bringt die Endkonzentration der Kontroll-siRNA oder Caspase-siRNA auf 10 nM.
7. Die Zellen werden 72 h lang bei 37 °C unter 5%_{CO2-Atmosphäre} inkubiert.
8. Ernten Sie die Zellen aus einem Replikat wie in Schritt 1.10 und verarbeiten Sie sie, um den Knockdown der Expression von Caspase 3, Caspase 6 und Caspase 7 entweder durch RT-qPCR bzw. Western Blotting unter Verwendung von Standardmethoden und Protokollen ^8,11 zu validieren oder zu bestätigen.
9. Infizieren Sie die Zellen in der anderen Replikation mit IAV, wie in den Schritten 1.4-1.9 (ohne Inhibitoren) beschrieben.
10. Nach 24 Stunden Ernte, Verarbeitung und Analyse der Zellen durch Western Blotting und Messung und Quantifizierung der Proteinrückgewinnung wie in den Schritten 1.10-1.20 beschrieben.

3. Ortsgerichtete Mutagenese zur Lokalisierung der Caspase-Spaltstelle(n) im Polypeptid

1. Klonen Sie das Gen-kodierende Protein von Interesse in einem Säugetierexpressionsplasmid¹¹ oder beziehen Sie es aus einem Forschungslabor oder einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Es wird bevorzugt, wenn das Gen mit einem Epitop-Tag oder als GFP-Fusion kloniert wird, um das ektopisch exprimierte Polypeptid vom endogen exprimierten während des Western Blotting zu unterscheiden.
2. Unter Verwendung von Caspase-Substratdatenbanken⁴ oder Protein-Alignment-Tools können Sie die Konsens-Caspase-Spaltungsmotive XXXD und DXXD auf dem Polypeptid lokalisieren. Fast alle Caspase-Spaltungsmotive besitzen die Asparaginsäure an der Spaltstelle (P1)^3,4.
3. Mutieren Sie die mutmaßliche P1-Asparaginsäure zu Glutaminsäure oder einer unpolaren Aminosäure (Alanin, Valin) durch ortsgerichtete Mutagenese, gefolgt von DNA-Sequenzierung¹¹ unter Verwendung von Standardmethoden und -protokollen.
4. Liefern Sie die Wildtyp- (WT) und mutierte Plasmid-DNA an MDCK- oder A549-Zellen durch umgekehrte Transfektion¹¹.
   1. Dazu werden 2 μg Plasmid-DNA oder ein empfohlenes Volumen des Transfektionsreagenz in 100 μL eines geeigneten Mediums (siehe Schritt 2.3 und Materialtabelle) in separaten Röhrchen verdünnt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
   2. Mischen Sie 100 μL jeder Plasmid-DNA-Lösung mit 100 μL der Transfektionsreagenzlösung und inkubieren Sie für 20-45 min bei Raumtemperatur, um den DNA-Transfektionsreagenzkomplex zu bilden.
5. In der Zwischenzeit werden 3 x 10⁵ MDCK- oder A549-Zellen zu 800 μL des gesamten Wachstumsmediums gespalten und hinzugefügt, mit 200 μL DNA-Transfektionsreagenzkomplex gemischt und die 1-ml-Suspension in eine Vertiefung einer 12-Well-Kulturplatte gegeben.
6. Die Zellen werden bei 37 °C unter 5%_{CO2-Atmosphäre} inkubiert.
7. Nach 48 h infizieren Sie die Zellen mit IAV, wie in den Schritten 1.4-1.9 beschrieben (ohne Zugabe der Inhibitoren).
8. Nach 24 h Ernte, Verarbeitung und Analyse der Zellen durch Western Blotting (falls zutreffend mit dem Antikörper gegen einen Epitop-Tag oder GFP). Messen und quantifizieren Sie dann die Proteinrückgewinnung wie in den Schritten 1.10-1.20 beschrieben.

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Ergebnisse

Behandlung mit Caspase-3-Hemmer
Es wurde entdeckt, dass Wirts-Cortactin-, HDAC4- und HDAC6-Polypeptide als Reaktion auf eine IAV-Infektion sowohl in Hunde- (MDCK) als auch in menschlichen (A549, NHBE) Zellen abgebaut werden ^7,8,9. Mit den oben genannten Ansätzen wurde aufgedeckt, dass IAV-induzierte Wirtskaspasen, insbesondere Caspase 3, deren Abbau^verursachen 7,8,9.

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Diskussion

Es ist erwiesen, dass Viren die Wirtsfaktoren und -wege zu ihrem Vorteil anpassen. Die Wirtszellen wiederum wehren sich dagegen, indem sie verschiedene Strategien anwenden. Eine dieser Strategien ist die PANoptose, die Wirtszellen als antivirale Strategie gegen Virusinfektionen einsetzen. Viren wie IAV haben jedoch ihre eigenen Strategien entwickelt, um der PANoptose entgegenzuwirken und sie zu ihrem Vorteil auszunutzen ^1,3,6. D...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
A549 cells	ATCC	CRM-CCL-185	Human, epithelial, lung
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Caspase 3 Inhibitor	Sigma-Aldrich	264156-M	Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Goat anti-NP antibody			Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	13778150
MDCK cells	ATCC	CCL-34	Dog, epithelial, kidney
MG132	Sigma-Aldrich	M7449
Minimum Essential Medium (MEM)	ThermoFisher Scientific	11095080	Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2	LI-COR		Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion	Addgene	50728	Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3	Sigma-Aldrich	NM_004346	siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6	Sigma-Aldrich	NM_001226	siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7	Sigma-Aldrich	NM_001227	siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs	Sigma-Aldrich	KSPQ12012	Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membrane	Cytiva (Fomerly GE Healthcare)	10600003
Rabbit anti-actin antibody	Abcam	ab8227
Rabbit anti-cortactin antibody	Cell Signaling	3502
Rabbit anti-GFP antibody	Takara	632592
SeeBlue Pre-stained Protein Standard	ThermoFisher Scientific	LC5625
Transfection medium, Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100	Merck
Trypsin, TPCK-Treated	Sigma-Aldrich	4370285