JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Инфекция вируса гриппа А (IAV) активирует каспазы, расщепляющие хозяина, и вирусные белки, которые, в свою очередь, обладают про- и противовирусными функциями. Используя ингибиторы, интерференцию РНК, сайт-направленный мутагенез и методы западного блоттинга и RT-qPCR, были идентифицированы каспазы в инфицированных клетках млекопитающих, которые расщепляют кортактин хозяина и гистоновые деацетилазы.

Аннотация

Caspases, семейство цистеиновых протеаз, организует запрограммированную гибель клеток в ответ на различные раздражители, включая микробные инфекции. Первоначально описанная как происходящая апоптозом, запрограммированная гибель клеток в настоящее время, как известно, охватывает три взаимосвязанных пути: пироптоз, апоптоз и некроптоз, вместе придуманные как один процесс, PANoptosis. Вирусная инфекция (IAV) вызывает PANoptosis в клетках млекопитающих, индуцируя активацию различных каспаз, которые, в свою очередь, расщепляют различные белки-хозяева, а также вирусные белки, что приводит к таким процессам, как активация врожденного противовирусного ответа хозяина или деградация антагонистических белков-хозяев. В связи с этим каспаза 3-опосредованное расщепление кортактина хозяина, гистондеацетилазы 4 (HDAC4) и гистондеацетилазы 6 (HDAC6) было обнаружено как в эпителиальных клетках животных, так и в эпителиальных клетках человека в ответ на инфекцию IAV. Чтобы продемонстрировать это, были использованы ингибиторы, интерференция РНК и сайт-направленный мутагенез, и, впоследствии, расщепление или устойчивость к расщеплению и восстановление кортактина, HDAC4 и HDAC6 полипептидов были измерены с помощью западного блоттинга. Эти методы в сочетании с RT-qPCR образуют простую, но эффективную стратегию идентификации хозяина, а также вирусных белков, подвергающихся опосредованному каспазой расщеплению во время заражения IAV или другими вирусами человека и животных. В настоящем протоколе излагаются репрезентативные результаты этой стратегии, а также обсуждаются пути повышения ее эффективности.

Введение

Вирус гриппа А (IAV) является прототипным членом семейства Orthomyxoviridae и, как известно, вызывает глобальные эпидемии и непредсказуемые пандемии. IAV вызывает респираторные заболевания человека, грипп, широко известный как «грипп». Грипп является острым заболеванием, которое приводит к индукции про- и противовоспалительных врожденных иммунных реакций хозяина и гибели эпителиальных клеток в дыхательных путях человека. Оба процесса управляются явлением, называемым запрограммированной гибелью клеток1. Передача сигналов о запрограммированной гибели клеток индуцируется, как только различные рецепторы распознавания патогенов воспринимают входящие вирусные частицы в клетках-хозяевах. Это приводит к программированию смерти инфицированных клеток и передаче сигналов соседним здоровым клеткам тремя взаимосвязанными путями, называемыми пироптозом, апоптозом и некроптозом, недавно придуманным как один процесс, PANoptosis1.

PANoptosis включает в себя протеолитическую обработку многих белков-хозяев и вирусных белков от индукции до исполнения. Такая обработка белков в первую очередь возглавляется семейством цистеиновых протеаз, называемых каспазами 1,2. Известно до 18 каспаз (от каспазы 1 до каспазы 18). Большинство каспаз экспрессируются как прокаспазы и активируются путем прохождения собственной протеолитической обработки либо автокатализом, либо другими каспазами4 в ответ на стимул, такой как вирусная инфекция. PANoptosis IAV-инфицированных клеток считался защитным механизмом хозяина, но IAV разработал способы уклонения и использования его для облегчения его репликации 1,2,5,6. Одним из них является антагонизм факторов хозяина посредством опосредованного каспазой расщепления или деградации, которые либо по своей сути являются противовирусными, либо мешают одной из стадий жизненного цикла IAV. С этой целью было обнаружено, что факторы хозяина, кортактин, HDAC4 и HDAC6 подвергаются опосредованному каспазой расщеплению или деградации в инфицированных IAV эпителиальных клетках 7,8,9. HDAC4 и HDAC6 являются анти-IAV факторами 8,10, а кортактин препятствует репликации IAV на более поздней стадии инфекции, потенциально во время вирусной сборки и почкования11.

Кроме того, также активируются различные каспазы, которые, в свою очередь, расщепляют несколько белков, чтобы активировать воспалительную реакцию хозяина во время инфекции IAV 1,2. Кроме того, нуклеопротеин (NP), белок М2 ионного канала IAV 12,13,14 и различные белки других вирусов 3,15,16 также подвергаются каспазно-опосредованному расщеплению во время инфекции, что влияет на вирусный патогенез. Поэтому существует постоянная потребность в изучении опосредованного каспазой расщепления или деградации белков-хозяев и вирусных белков во время IAV и других вирусных инфекций, чтобы понять молекулярную основу вирусного патогенеза. В настоящем описании представлены способы (1) оценки расщепления или деградации таких белков каспазами, (2) идентификации этих каспаз и (3) локализации участков расщепления.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Регулирующие разрешения были получены от Институционального комитета по биологической безопасности Университета Отаго для работы с IAV и клетками млекопитающих. Для настоящего исследования использовались клетки собачьей почки Мадина-Дарби (MDCK) или альвеолярные эпителиальные клетки A549 легких человека и подтипы IAV H1N1. IAV был выращен в куриных яйцах, как описано в другом месте17. Стерильные и асептические условия использовались для работы с клетками млекопитающих, а для работы с подтипами IAV использовались установка уровня биобезопасности 2 (или физическая изоляция 2) и шкаф биобезопасности класса II.

1. Оценка расщепления или деградации белков в IAV-инфицированных клетках каспазами

  1. Семена 3 x 105 клеток MDCK или A549 на лунку в 12-луночной клеточной культуральной пластине.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании клеток MDCK убедитесь, что антитело против интересующего белка распознает свои собачьи виды.
  2. Засейте скважины парами, т.е. контрольной парой - одна скважина для неинфицированного пробного образца и одна для зараженного пробного образца - и тестовая пара - одна скважина для образца неинфицированного ингибитора А и одна для образца инфицированного ингибитора А. Увеличьте количество пар с каждым дополнительным ингибитором (см. ссылки 7,8).
  3. Инкубируйте клетки при 37 °C при 5% атмосфере CO2 в течение ночи.
  4. На следующий день заражайте клетки IAV (подтип H1N1 или другой подтип).
    1. Для этого готовят вирусный инокулят путем разведения запаса вируса в 400 мкл бессывороточной минимально необходимой среды (MEM) (см. Таблицу материалов) при кратности заражения (MOI) 0,5-3,0 бляшекообразующих единиц (pfu)/клетка 7,11 (коэффициент удвоения числа клеток при расчете MOI).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для заражения клеток MDCK дополните инокулятор вируса тозилфенилаланилхлорметилкетоном (TPCK)-трипсином в конечной концентрации 1 мкг/мл.
  5. Удалите старую культуральную среду из клеток (этап 1.3) и промыть клетки 1 мл/лунку безсыворочного MEM 2x.
  6. Добавьте к клеткам 400 мкл инокулята вируса (стадия 1.4.1) и инкубируйте их в течение 1 ч при 35 °C при 5% атмосфере CO2 .
  7. Тем временем разбавляют ингибитор каспазы (например, Z-DEVD-FMK), ингибитор лизосомы (например, NH4Cl) или ингибитор протеасомы (например, MG132) (см. Таблицу материалов) при конечной концентрации 40 мкМ, 20 мМ или 10 мкМ, соответственно, в mem7 без сыворотки (см. Таблицу материалов). Последние два ингибитора служат в качестве контроля. Разбавить равный объем растворителя (если он не является водой), используемый для восстановления одного из ингибиторов в среде, свободной от сыворотки, в качестве макета.
  8. Удалите вирусный инокулятор и промыть клетки, как на шаге 1.5 (1x).
  9. Добавьте бессывороточный MEM, 1 мл/лунку, макет или дополненный ингибитором, к клеткам и инкубируйте клетки, как на этапе 1.6. Этот момент времени считается 0-часовой инфекцией.
  10. Через 24 ч соберите клетки, соскоблив их плунжером шприца 1 мл (резиновая сторона) и переложите их в полипропиленовую трубку объемом 1,5 мл.
  11. Центрифугируйте трубку при 12 000 х г в течение 1-2 мин при комнатной температуре. Соберите супернатант с помощью пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот супернатант может быть выброшен или использован для анализа бляшек8 для измерения титра высвобождаемого потомства вируса.
  12. Промыть ячейку гранулы 250 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) путем повторного центрифугирования, как на этапе 1.11.
  13. Удаляют супернатант и лизируют клетки, добавляя 80-100 мкл буфера лизиса клеток (50 мМ Tris-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 0,5% додецилсульфата натрия (SDS), 0,5% дезоксихолата натрия, 1% тритона X-100 и коктейль ингибитора протеазы 1x, см. Таблицу материалов) и вихревое.
  14. Нагревайте трубку при 98 °C в течение 10 мин, чтобы полностью лизировать и приготовить общий клеточный лизат. Храните лизаты при 4 °C для выполнения шагов 1,15-1,17 на следующий день, но для достижения наилучших результатов завершите эти шаги в тот же день.
  15. Оцените количество белка в каждом образце с помощью набора для анализа BCA (см. Таблицу материалов).
  16. Разрешать равные количества белка из неинфицированных и инфицированных образцов с помощью стандартного электрофореза SDS-полиакриламидного геля (SDS-PAGE)11 вместе с маркерами молекулярной массы11.
  17. Перенос белка на мембрану из нитроцеллюлозы или поливинилидендифторида (PVDF) (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: PVDF мембрана может давать высокий фон в некоторых западных блот-тепловизорах; проверьте совместимость.
  18. Выполняют вестерн-блоттинг для обнаружения интересующего белка с помощью способа, описанного в другом месте11.
  19. Сравните уровни белка в полосах инфицированных образцов, обработанных имитацией и ингибиторами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если уровень белка восстановился в инфицированной полосе образца, обработанной ингибитором каспазы, то белок расщепляется или разлагается каспазами. В противном случае он деградирует либо лизосомой, либо протеасомой.
  20. Количественно оценить восстановление белка, измерив его интенсивность полосы в каждой полосе по меньшей мере от трех реплик одного и того же эксперимента и нормализовав его с соответствующей полосой управления нагрузкой.
  21. Используйте любой современный тепловизор и связанное с ним программное обеспечение (см. Таблицу материалов) для изображения западных пятен и количественной оценки восстановления белка.

2. Подтверждение опосредованного каспазой расщепления или деградации белков в IAV-инфицированных клетках РНК-интерференцией

  1. Спроектировать или получить предварительно разработанную малоинтерферирующую РНК (siRNA), нацеленную либо на собачью, либо на человеческую каспазу 3, каспазу 6 и каспазу 7 (каспазы палача1), и нецелевую контрольную siRNA (см. Таблицу материалов).
  2. Доставляют каждую siRNA в клетки MDCK или A549 путем обратной трансфекции 8,11.
  3. Для этого разводят в отдельных пробирках 100 нМ контрольной siRNA или каспазы siRNA или рекомендуемого объема трансфекционного реагента (см. Таблицу материалов) в 100 мкл соответствующей среды (например, OptiMEM, см. Таблица материалов) и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре.
  4. Подготовьте каждое разведение в двух экземплярах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот дубликат включает в себя одну реплику для анализа нокдауна экспрессии каспазы с помощью RT-qPCR или западного блоттинга (если доступны антитела к каспазам) и другую для оценки восстановления интересующего белка путем вестерн-блоттинга.
  5. Смешайте 100 мкл каждого раствора siRNA со 100 мкл раствора трансфекционного реагента (стадия 2.3) и инкубируйте в течение 20-45 мин при комнатной температуре с образованием комплекса реагентов siRNA-трансфекции.
  6. Тем временем разделите и добавьте 1 х 105 клеток MDCK или A549 в 800 мкл полной питательной среды, смешайте с 200 мкл комплекса реагентов siRNA-трансфекции (стадия 2,5) и добавьте 1 мл суспензии в лунку 12-луночной культуральной пластины. Это разведение доводит конечную концентрацию контрольной siRNA или каспазы siRNA до 10 нМ.
  7. Инкубируют клетки при 37 °C при 5% CO2 атмосфере в течение 72 ч.
  8. Соберите клетки из одной реплики, как на этапе 1.10, и обработайте их для проверки или подтверждения нокдауна экспрессии каспазы 3, каспазы 6 и каспазы 7 либо с помощью RT-qPCR, либо западного блоттинга, соответственно, используя стандартные методы и протоколы 8,11.
  9. Инфицировать клетки в другой реплицируемой С помощью IAV, как описано в шагах 1.4-1.9 (без ингибиторов).
  10. Через 24 ч собирают, обрабатывают и анализируют клетки с помощью вестерн-блоттинга, а также измеряют и количественно оценивают восстановление белка, как описано в шагах 1.10-1.20.

3. Сайт-направленный мутагенез для определения местоположения места (участков) расщепления каспазы в полипептиде

  1. Клонировать ген-кодирующий белок, представляющий интерес в плазмидеэкспрессии 11 млекопитающих, или получить его из исследовательской лаборатории или коммерческого источника (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно, если ген клонируется с эпитопной меткой или в виде слияния GFP, чтобы отличить эктопически экспрессированный полипептид от эндогенно экспрессированного во время вестерн-блоттинга.
  2. Используя базы данных субстрата каспазы4 или инструменты выравнивания белка, найдите консенсусные мотивы расщепления каспазы, XXXD и DXXD, на полипептиде. Почти все мотивы расщепления каспазы обладают аспарагиновой кислотой в месте расщепления (P1)3,4.
  3. Мутировать предполагаемую аспарагиновую кислоту P1 в глутаминовую кислоту или неполярную аминокислоту (аланин, валин) путем сайт-направленного мутагенеза с последующим секвенированием ДНК11 с использованием стандартных методов и протоколов.
  4. Доставляют ДНК диких (WT) и мутантных плазмид в клетки MDCK или A549 путем обратной трансфекции11.
    1. Для этого разводят 2 мкг плазмидной ДНК или рекомендуемый объем трансфекционного реагента в 100 мкл соответствующей среды (см. стадию 2.3 и Таблицу материалов) в отдельных пробирках и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Смешайте 100 мкл каждого раствора плазмидной ДНК со 100 мкл раствора трансфекционного реагента и инкубируйте в течение 20-45 мин при комнатной температуре с образованием днк-трансфекционного реагентного комплекса.
  5. Тем временем разделите и добавьте 3 х 105 клеток MDCK или A549 к 800 мкл полной питательной среды, смешайте с 200 мкл комплекса реагентов ДНК-трансфекции и добавьте суспензию 1 мл в лунку 12-луночной культуральной пластины.
  6. Инкубируйте клетки при 37 °C в атмосфере 5% CO2 .
  7. Через 48 ч инфицируют клетки IAV, как описано на этапах 1.4-1.9 (без добавления ингибиторов).
  8. Через 24 ч собирают, обрабатывают и анализируют клетки путем вестерн-блоттинга (если применимо, с использованием антитела к эпитопной метке или GFP). Затем измерьте и количественно оцените восстановление белка, как описано в шагах 1.10-1.20.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Лечение ингибитором каспазы 3
Было обнаружено, что полипептиды кортактина хозяина, HDAC4 и HDAC6 подвергаются деградации в ответ на инфекцию IAV как в собачьих (MDCK), так и в человеческих (A549, NHBE) клетках 7,8,9. Используя вышеуказанные по...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Установлено, что вирусы адаптируют факторы и пути хозяина к своей выгоде. В свою очередь, клетки-хозяева сопротивляются этому, используя различные стратегии. Одной из таких стратегий является PANoptosis, который клетки-хозяева используют в качестве противовирусной стратегии против вирусны...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У автора нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Автор признает Дженнифер Типпер, Билана Ли, Джесси ванВестринена, Кевина Харрода, Да-Юань Чена, Фарджану Ахмед, Соню Мрос, Кеннета Ямаду, Ричарда Уэбби, BEI Resources (NIAID), Совет по исследованиям в области здравоохранения Новой Зеландии, Фонд Мориса и Филлис Пайкель (Новая Зеландия), Фонд H.S. и J.C. Anderson Trust (Данидин), а также Департамент микробиологии и иммунологии и Школу биомедицинских наук (Университет Отаго).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
A549 cellsATCCCRM-CCL-185Human, epithelial, lung
Ammonium chlorideSigma-AldrichA9434
Caspase 3 InhibitorSigma-Aldrich264156-MAlso known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor CocktailRoche11836153001
Goat anti-NP antibodyGift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermoFisher Scientific31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection ReagentThermoFisher Scientific13778150
MDCK cellsATCCCCL-34Dog, epithelial, kidney
MG132Sigma-AldrichM7449
Minimum Essential Medium (MEM)ThermoFisher Scientific11095080Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1Sigma-AldrichSIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 LI-COROdyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion Addgene50728Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3Sigma-AldrichNM_004346siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6Sigma-AldrichNM_001226siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7Sigma-AldrichNM_001227siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairsSigma-AldrichKSPQ12012Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membraneCytiva (Fomerly GE Healthcare)10600003
Rabbit anti-actin antibodyAbcamab8227
Rabbit anti-cortactin antibodyCell Signaling3502
Rabbit anti-GFP antibodyTakara632592
SeeBlue Pre-stained Protein StandardThermoFisher ScientificLC5625
Transfection medium, Opti-MEMThermoFisher Scientific11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100Merck
Trypsin, TPCK-TreatedSigma-Aldrich4370285

Ссылки

  1. Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -D. PANoptosis in microbial infection. Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).
  2. Zheng, M., Kanneganti, T. -D. The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).
  3. Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).
  4. Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).
  5. Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection. Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).
  6. Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation. Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).
  7. Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells. Virology. 497, 146-156 (2016).
  8. Galvin, H. D., Husain, M. Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4. Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).
  9. Husain, M., Harrod, K. S. Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells. FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).
  10. Husain, M., Cheung, C. Y. Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules. Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).
  11. Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres. Viruses. 12 (1), 87(2020).
  12. Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).
  13. Zhirnov, O. P., Klenk, H. -D. Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus. Virology. 394 (1), 57-63 (2009).
  14. Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells. Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).
  15. Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells. PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940(2019).
  16. Richard, A., Tulasne, D. Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis. Cell Death & Disease. 3 (3), 277(2012).
  17. Brauer, R., Chen, P. Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e52421(2015).
  18. Lüthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: A searchable database of caspase substrates. Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
  19. Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates. PLoS One. 9 (10), 110539(2014).
  20. Igarashi, Y., et al. CutDB: A proteolytic event database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).
  21. Crawford, E. D., et al. The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).
  22. Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. MEROPS: The peptidase database. Nucleic Acids Research. 32, Database issue 160-164 (2004).
  23. Lange, P. F., Overall, C. M. TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function. Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).
  24. Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 290-297 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены