结合透明和荧光显微镜，可视化基因表达的变化和对芸苔疟原虫的生理反应

摘要

本协议描述了一种优化的方法，用于组织学观察由 芸苔疟原虫 诱导的瘿。在荧光成像之前清除下胚轴的振动切片，以研究疾病进展过程中转录因子和植物激素的参与。该方案克服了树脂包埋的限制 ，使荧光 蛋白的植物可视化成为可能。

摘要

土源原生生物 芸苔 属植物对芸苔属作物的感染导致地下器官形成胆。瘿的形成需要细胞重编程和受感染植物新陈代谢的变化。这对于建立一个面向病原体的生理汇是必要的，宿主营养物质被重定向到该汇。为了全面了解这种特殊的植物 - 病原体相互作用以及宿主生长和发育被颠覆和重塑的机制，必须跟踪和观察伴随细胞分辨率形成胆的内部变化。结合荧光染料和荧光蛋白的方法通常用于研究植物的解剖学和生理反应。不幸的是，胆的大尺寸和低透明度是显微镜下进行整体安装观察的主要障碍。此外，低透明度限制了荧光显微镜研究马蹄根疾病进展和胆形成的应用。本文提出了一种用于固定和清除胆的优化方法，以促进落射荧光和共聚焦显微镜检查 芸苔属细菌感染的胆。使用用于快速光学清除的组织清除方案，然后进行振动切片机切片以检测解剖学变化，并通过启动子融合和用荧光蛋白标记的报告株系定位基因表达。这种方法将被证明可用于研究植物中其他病原体触发结构中的细胞和生理反应，例如线虫诱导的合胞体和根结，以及昆虫引起的叶瘿和变形。

引言

受病原体或昆虫影响的植物可能会发展出异常结构（器官变形或胆），这使得入侵者能够摄取营养并繁殖¹。在这里，采用了一种有效的组织病理学方法来研究在感染原生生物 芸苔 属的植物地下部分发育的瘿中发生的变化（图1）。与这种病原体相关的次要线索源于这样一个事实，即 芸苔属松弛孢 子可以保持其入侵植物的能力多年。在大规模种植油菜（Brassica napus）的情况下，这是一个严重的问题，因为经济因素限制了作物轮作，^{导致土壤中}静止孢子堆积2。油菜对 芸苔假单胞 菌引起的马蹄根病的抗性是遗传决定的。可悲的是，这种病原体往往胜过耐药性，因为它的生物学和油菜起源的狭窄基因库。因此，研究寄主植物的感染后反应及其减缓疾病进展或预防某些症状发展的能力变得具有相关性。

在根根病中，严重程度通常根据胆的发育和根系损伤的程度进行评估。这被称为疾病指数-DI³.然而，它并没有完全捕捉到这种植物-病原体相互作用的真实评价。特别是，它没有解决病原体如何在根内分布以及植物是否可以抑制 P. brassicae 在其组织内的运动。此外，不容易预测到什么程度 P. brassicae 重新编程地下器官解剖学。模型工厂研究 Arabidopsis thaliana 已经表明 P. brassicae 感染导致抑制木生成（起始和成熟步骤）和增强瘿内韧皮部分化^4,5.此外，在受感染植物的根和下胚轴中，坎比细胞后代不会退出有丝分裂状态并且比健康植物增殖的时间更长⁶.这个过程控制着胆的最终大小，并确定受感染植物内产生的病原体静息孢子的数量。 P. brassicae-宿主中驱动的发育、代谢和生理重编程非常复杂⁷;因此，应用允许检查瘿内内部变化的工具对于正确评估这种相互作用至关重要。生命周期进程 P. brassicae 伴随着宿主细胞代谢的重编程，可以观察到淀粉或脂质沉积^7,8.成功进行胆镜显微镜检查的主要障碍来自其低透明度。因此，大多数在瘿内呈现马蹄根驱动变化的组织学标本源于固定包埋（蜡或树脂）技术，然后是切片机切片。这些方法成功地用于定位马蹄根瘿中许多活跃基因的启动子活性^4,5 或各种染色技术，便于观察 P. brassicae 生命周期进程⁹.然而，必须注意的是，固定和包埋阶段非常耗时，并且会导致重要生物分子（例如脂质）的部分或完全洗掉，从而严重阻碍某些观察。最近 P. brassicae 在荧光原位杂交（FISH）的帮助下可视化宿主的生命周期进程，其中SABATH型甲基转移酶（PbBSMT）基因特异性探针用于标记静止孢子的形成¹⁰.一个好的替代方案是使用其他基于荧光的方法，其中可以看到某些细胞成分的自发荧光，与荧光蛋白标记物融合的基因的5'-上游调控区域的活性以及特定荧光标记蛋白的积累。然而，除了样品的低透明度之外，与此类物体相关的一个主要缺点是使用未固定的标本，这大大减少了记录高质量图像的时间。2015年，栗原等.¹¹ 开发了一种透明试剂，可以保存荧光蛋白并增加植物组织标本的透明度。此外，它还与许多组织学染色剂兼容。最近，相同的技术被成功地应用于可视化植物组织中的不同细胞壁成分^12,13.在这里，该协议已被用于分析各种马蹄根胆的发展方面。工作流程从瘿的固定、振动切片、组织清除、染色和荧光成像开始。根据个人的需要，直接或在特定染色后，可以在落射荧光或共聚焦显微镜下检查所得切片。该方法为研究基因表达和生理反应的局部变化（包括植物激素平衡和信号传导）提供了有效的解决方案。可以通过观察静息孢子的分布模式和成熟动态来跟踪疾病进展。此外，该协议可以很容易地应用于内部的成像特征变化 P. brassicae 受感染的植物，包括抑制木生成或宿主植物防御反应，在抗性基因型中可见为局部木质化。该协议中的示例来自在 Arabidopsis thaliana 型;但是，该协议也可以适用于属于 Brassicaceae 家庭。下面描述的方法将有助于未来对伴随胆形成的细胞结构和分子变化的详细研究 P. brassicae-受感染的植物。

该方案的一般工作流程非常简单，胆汁发育的所有阶段都可以轻松成像和表征（图2）。由于 芸苔属是一种 土源性病原体，因此所有实验都必须在土壤系统中进行。病原体喜欢酸性条件;因此，必须使用未经石灰处理的土壤基质。虽然 芸苔属不会 对人类构成威胁，但严格来说，它是一种植物病原体，可以通过土壤和水传播。因此，受感染植物的所有部分以及土壤都需要在实验后通过高压灭菌或漂白剂处理来破坏。

研究方案

1. 植物生长条件

1. 在短日照状态下生长拟 南芥 植物，在22°C下光照9小时，在20°C下光照15小时，辐照度为120μmol·m^{−2 s-1} （测量为光合有效辐射，冠层水平的PAR，见 材料表）。

2.孢子接种物的制备

注:有关详细信息，请参阅Fuchs等人.¹⁴。

1. 在含有 300 mL 高压灭菌蒸馏水的搅拌机中均质化来自大白菜植物（芸苔属 rapa var. pekinensis 品种"Granaat"）的两到三个冷冻瘿，并通过四层无菌纱布过滤。
2. 离心滤液（在6，000× g，5分钟和4°C下），并使用刮刀从孢子颗粒中机械地除去淀粉层。重复此过程，直到去除大部分淀粉。
3. 使用血细胞计数器¹³ 通过计数20个不同田野区域中的孢子数来确定孢子浓度。
4. 确保用于接种拟南芥的孢子悬浮液的最终浓度为1 x 10⁶孢子·mL⁻¹。发芽后 20 天用 2 mL 校准的孢子悬浮液接种每株植物。

3. 组织准备和固定

1. 准备植物组织。
   1. 小心地从马蹄根感染和未感染植物的根系中去除土壤。用水彻底清洁，并将下胚轴和胆（长度在0.5-2厘米之间）收集到微量离心管中。
2. 按照以下步骤进行PFA固定（4%多聚甲醛，1x PBS + 0.01%Triton X-100中的PFA）。
   1. 在65°C（不要煮沸）下搅拌，将4gPFA粉末（见 材料表）加入100mL的PBS（磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4， 表1）中。滴加使用KOH（10M和1M）获得pH值约为11的澄清溶液。
   2. 用 H₂SO₄ 调节 pH 值，使其降至 6.9，并加入 0.01% （v/v） Triton X-100 以改善固定。将溶液等分储存在-20°C（不要重新冷冻）或储存在4°C。
3. 进行组织固定。
   1. 使用真空泵施加恒定真空（700 mbar），在室温下将样品固定在 200-500 μL PFA 固定剂中 1 小时。确保物体完全浸入PFA溶液中。
      注意:样品可以在4°C（冰箱）下储存几周，稍后用于切片。

4. 组织包埋和切片

1. 使用 4% w/v 琼脂糖包埋未感染的下胚轴和感染的胆。将溶液煮沸以溶解琼脂糖，并在冷却时倒入，同时它仍然粘稠。
2. 将物体在纸巾上轻轻干燥几秒钟以去除多余的PFA。
3. 使用牙签/镊子小心地将植物物体嵌入琼脂糖中并定向。为防止斜截面，请确保物体的方向和模制正确，使其轴线垂直于振动切片机叶片的平面（对于径向截面）。
4. 为了加速琼脂糖固化，将培养皿或多培养板置于4°C下10分钟。
   注意:如果物体太大（如接种后 21 天 [DPI] 时较大的拟 南芥 瘿），即使不嵌入琼脂糖中，也可以对物体进行切片。

5. 振动切片机

注意:振动切片机配有振动剃须刀片，可切割植物器官/组织。振动速度、振幅、叶片角度和截面厚度都是可以调整的参数（见 材料表）。

1. 使用刀片，小心地在琼脂糖块内切割和成型物体，注意切片的首选方向。
2. 使用氰基丙烯酸酯/即时胶和遮蔽胶带将琼脂糖块/大胆粘在试样架上（见 材料表）。
3. 对于 拟南芥下 胚轴和胆（早期阶段），将切片的厚度保持在30-40μm之间，以获得高质量的图像。
   注意:为了分析胆汁进展的后期阶段，切片的厚度可以在50-80μm之间。
4. 避免切割较薄的部分，因为它会由于移动刀片的振动而破坏胆样品。
5. 根据胆的厚度和尺寸（40 μm 或 60 μm）调整截面、速度和振动幅度的厚度。
6. 将蒸馏水加入水浴中，然后开始切片。
7. 使用镊子或刷子小心地收集切片，并将其转移到含有 1mL 1x PBS 缓冲液 （pH 7.4） 的微量离心管中。
   注意:通常，振动幅度越高，切片质量越好。对于未感染的下胚轴或不含成熟静息孢子的瘿，振动幅值可保持在1.2 mm，速度为0.60 mm·s⁻¹ 。在大瘿细胞完整性部分丧失和孢子成熟迹象明显的情况下，振动幅度应以0.45 mm·s⁻¹ 的速度降低到0.55 mm。

6. 样本清除

1. 从微量离心管中取出1x PBS，加入200-500μL澄清溶液（表1）。
2. 从现在开始，将样品在室温下在黑暗中储存。确保对象始终浸没在清除溶液中。
3. 如果在样品处理过程中一段时间后颜色发生变化，请用新的溶液替换清除溶液。
   注意:由于样品处理，澄清溶液的颜色可能会变黄。在这种情况下，建议更换溶液以改善组织的清除。

7. 染色程序

1. 对于细胞壁的Calcofluor白色染色（用于输出植物细胞），在清除溶液中制备5%v / v的Calcofluor白色染色剂（参见 材料表）。在黑暗中染色至少5分钟。
2. 为了用尼罗红染色脂质（用于染色感染细胞中的静息孢子和油滴），在透明溶液中制备1mg / mL的原液（参见 材料表）。进一步稀释以获得 1:99。在黑暗中染色至少10分钟。
3. 对于基本品红木质素染色，在清除溶液中制备0.2% w / v的染色剂（参见 材料表）。在黑暗中染色至少10分钟。
   注意:在双重染色过程中，在施用Calcofluor白之前，首先用尼罗红染色样品10分钟。每一步后除去多余的染色溶液。如果物体似乎染色过度，请用清除溶液洗涤以去除多余的污渍。如果需要，使用清除溶液稀释污渍。在钙氟染色之前，始终用尼罗红/碱性紫红色对样品进行染色。首先用钙氟染色可以防止尼罗河红对孢子进行适当染色。

8. 显微镜

1. 将清除的部分安装在显微镜载玻片上，并在落射荧光或共聚焦显微镜下观察（参见 材料表）。使用澄清溶液作为封片剂，以防止样品干燥。
2. 使用多种采集模式同时对多个荧光光谱进行成像。
   注意:所呈现协议中使用的激发/发射光谱如下:对于尼罗红553 / 636 nm，木质部自发荧光380 / 475 nm，对于碱性紫红色561 / 650 nm，对于Calcofluor White 405 / 475 nm，对于erRFP 585 / 608 nm和GFP 488 / 509 nm（表2）。

结果

使用染色脂质和木脂蛋白的尼罗红，可以查看含有脂质的病原体静止孢子（图3A，B）。因此，使用双重染色，可以获得清晰的图像来观察瘿内病原体分布的模式。用Calcofluor白复染产生对比，并有助于同时跟踪木质部发育与 芸苔假单胞菌 成熟（图3B）。

木质部的形成和发育也可以通过观察未染色样品中的自发荧光（图4A）或使用碱性紫红色等染色剂来检查木质素的形成和发育，这些染色剂能够对木质素进行基于荧光的成像（图4B）。

通过使用这种方法，人们可以跟踪基因表达的变化或对生长调节剂的反应。一个完美的例子是利用含有pHCA2:erRFP构建体的拟南芥植物来可视化棒根瘿内韧皮部组织中的高坎比活性2（HCA2）基因表达。HCA2基因活性先前已在分生活跃的韧皮部和韧皮部谱系细胞中发现¹⁵。在这里，它与韧皮部在芸苔假单胞菌驱动的胆发育后期共同定位，其活性反映了芸苔假单胞菌如何增加韧皮部的复杂性（图5）。由此产生的图像显示了韧皮部在胆发育后期的增殖，当凸起碎片化时。图5A显示了胆的未清除的手部部分，而图5B显示了通过振动切片机切片和组织清除获得的更清晰和局部的荧光信号。这些物体用Calcofluor白色复染。图6将该图像（图6B）与树脂包埋和切片机切片的胆（图6A）中描绘的类似区域进行了比较，DPI为21 DPI。通过检查TCS:GFP（双组分信号传导）标记^物16在发育中的瘿中的表达来评估感染和未感染植物之间的差异细胞分裂素反应（图7）。在对具有二次增厚的胆和组织中的微弱GFP信号进行成像时，重要的是要注意，在成像过程中也会捕获由于成熟木质部细胞自发荧光而产生的额外背景信号。

图1:油菜（油菜双歧杆菌）和 拟南芥 （哥伦比亚-0）在26 DPI下与 芸苔疟原 虫孢子的根状根病症状。 在病程中，整个根系上都会形成大瘿，使其非常脆弱。它通过将孢子释放到周围的土壤中来促进未来的感染。植物身体的上部也显示出生长发育不良的迹象。最后，一旦根系完全受损，植物无法再应对疾病，受感染的植物就会屈服于对生长代谢和发育的破坏性影响。比例尺代表 1 厘米。-INF代表模拟接种，而+INF代表接种 芸苔属植物。在这种情况下，在去除土壤之前提供油菜植物的图片，以呈现健康的根系。洗涤后，仅收集下胚轴和根的上部。 请点击此处查看此图的大图。

图 2:常规工作流程。 洗涤的 拟南芥 根系是（A）解剖的，（B）固定的，（C）琼脂糖嵌入的，（D）安装的，（E）切片在振动切开器上。将所得物体进行组织清除（在黑暗中的室温下3天至数周，具体取决于组织类型和厚度）。（F）然后可以在显微镜下对清除的物体进行染色和检查。（G） 工作流程摘要。 请点击此处查看此图的大图。

图3:用尼罗河红染色标记病原体孢 子。 （A，B）尼罗红染色静止孢子中的脂质，这非常适合跟踪 芸苔属假单胞菌 的成熟。（A）由 芸苔假单胞菌 定植并充满病原体孢子的扩大细胞。（B）成熟的木质部细胞也会被尼罗河红染色。该切片已用Calcofluor白色复染，以查看宿主细胞的支出（A:物镜= 20x，切片厚度= 60μm; B:物镜= 5x，截面厚度= 60 μm）。 请点击此处查看此图的大图。

图 4:跟踪木质部发育和成熟的程度。 （A）木质素在紫外线激发时产生强烈的自发荧光;因此，成熟的木质部可以相对容易地区分。（B）用碱性紫红色和钙氟双重染色会产生更好的结果，因为所有细胞都被后一种染料染色，而成熟的木质部用碱性紫红色明显染色。通过这种方式，双重染色为图像提供了具有改进对比度的图像，描绘了对木生成的明显抑制（A:物镜= 10x，切片厚度= 60μm; B:物镜= 10x，截面厚度= 60 μm）。 请点击此处查看此图的大图。

图 5:21 DPI 下芸苔属植物下胚轴中 HCA2 基因的韧皮部特异性信号。 proHCA2::erRFP携带转基因拟南芥的启动子活性可以在（A）和（B）中看到。在图（A）中未清除的手部部分之间可以观察到差异，其中erRFP信号由于叠加和重叠的细胞层而显得扩散，特别是在不均匀的手部部分。另一方面，（B）显示了组织清除后的振动切片机切片，其中erRFP信号精确地标记成熟维管束中的韧皮部细胞（物镜= 20x，切片厚度= 60μm）。请点击此处查看此图的大图。

图 6:借助荧光处理 TB、树脂包埋和切片机切片胆之间的比较。 （A）甲苯胺蓝（TB），树脂包埋和切片机切片瘿的图像之间的比较，以及（B）借助荧光获得的代表性物体（也显示在图5B中）。木质部细胞用黄色星号标记，坎比区域用鲜绿色括号标记，韧皮部用青色星号标记，芸苔属疟原虫定植细胞用白色PB符号标记。树脂包埋切片（A）为研究肥大器官中静息孢子的分布，疾病进展程度以及其他过程（例如抗性植物中的局部木质化）提供了良好的分辨率。然而，这里描述的方案（B）能够灵敏地观察基因表达或蛋白质积累，并可视化其他生理变化和重要分子，如脂质（在孢子中）。请点击此处查看此图的大图。

图 7:在 16 DPI 下跟踪未感染 （-INF） 和 芸苔属假单胞菌感染 （+INF） 拟 南芥 植物下胚轴中的细胞分裂素信号反应。 TCS::GFP标志物用于表征 植物 细胞分裂素反应。对振动切片进行清除处理，然后用Calcofluor white染色。根据图像，在16 DPI下，细胞分裂素反应在受感染的胆中似乎大大减少（右图），而它们仍然很强，特别是在韧皮部池（最终将分化形成韧皮部组织的细胞），在未感染的植物中（左图）（物镜= 5x和厚度= 30μm）。某些水平的木质部自发荧光也可见。 请点击此处查看此图的大图。

清除溶液（有毒）
组件	百分比 （%）	在 100 mL 蒸馏水中
木糖醇	10%	10克
脱氧胆酸钠	15%	15克
尿素	25%	25克
10x PBS（磷酸盐缓冲盐水）		1 个 PBS（100 毫升）
氯化钠	8 克	10 mL 10x PBS + 90 mL 蒸馏水
氯化钾	0.2 克
KH2PO4	0.24 克
Na2HPO4 ·2H2O	1.81 克
蒸馏水	100毫升
酸碱度	使用 HCl 将 pH 值调节至 7.4
高压灭菌并储存在4°C。

表1:澄清溶液和磷酸盐缓冲盐水（PBS）的组成。

荧光染色剂/标签	激发/发射波长	使用的显微镜滤光片组
尼罗河红	553/636 纳米	过滤器组 43
木质部自发荧光	380/475 纳米	过滤器组 49
钙氟白	405/475 纳米	过滤器组 49
基本品红	561/650 纳米	过滤器组 43
erRFP	585/608 纳米	过滤器组 43
GFP	488/509海里	过滤器组 38

表2:为本研究选择的激发/发射光谱。

讨论

将清除溶液应用于瘿的振动切片切片肯定会增强研究 芸苔属假单胞菌 与寄主植物之间生物营养相互作用的能力。尽管清除协议甚至适用于手部部分，但它在振动切片机部分效果更好。将样品固定在PFA固定剂中是方案中的关键步骤，因为样品可以在4°C下储存几天，然后再进行切片。这提供了在有限时间内储存样品的灵活性，而不会影响固定过程中荧光蛋白的表达和保存。

尼罗红（在DMSO或甲醇中）由于其疏水性而与树脂部分不相容，这会溶解树脂并破坏树脂嵌入的部分¹⁷。因此，振动切片机切片被证明有助于研究发育中的瘿内的病原体分布及其生命周期，其中尼罗红染色可以很容易地使用。

本协议中使用的清除溶液具有高度通用性¹²，允许以不同的组合使用各种荧光染料来染色细胞壁的各种生物分子/组分（真菌相互作用中的木栓素，木质素，纤维素和几丁质）。还可以对荧光GFP标记线的部分进行复染，从而将启动子活性或蛋白质积累模式与病原体在特定细胞或胆区域中的存在相关联。然而，即使在清除方案之后，木质部和充满病原体的巨细胞的背景自发荧光也无法消除。这限制了在胆形成后期观察荧光标记物，特别是在使用落射荧光显微镜和对微弱信号进行成像时。

由于荧光信号的表达/积累水平低，转录因子难以检测，但是，使用这种技术，可以获得令人满意的图像。总体而言，将振动切片与组织清除方法相结合，扩展了复杂胆组织组织学观察的工具包。该方案的灵活性简化了组织固定过程，并减少了切割和成像新鲜组织样品以观察荧光蛋白和启动子活性所需的时间。随着进一步的改进，并通过利用针对各种生物分子的其他荧光染料，该方法将标志着具有复杂组织组织的致密，不透明组织的组织学研究和图像分析的更大进展。最近，所提出的组织清除方法已成为一种流行且广泛使用的方案，用于组合并能够同时采集不同的荧光信号¹¹，^12，13。这些技术的未来发展和修改将大大提高在细胞水平上观察植物 - 病原体相互作用的图像分辨率。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2N Sulfuric acid (H2SO4)	Roth	UN2796	pH adjustment
Agarose	PRONA	BGQT100	Embedding
Basic Fuchsin	BIOSHOP	BSF410.5	Fluorescent dye
Calcofluor White	Sigma Aldrich	18909-100ML-F	Fluorescent dye
Commercial Bleach	Domestos
Cyanoacrylate/ Instant glue	Kropelka		Adhesive
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	BIOSHOP	DMS555.500	Solvent
Epifluorescence microscope	Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system	Carl Zeiss M2	Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used
Fully automated Vibratome	Leica	VT1200 S
Lightmeter /Photometer	LI-COR Biosciences	LI-250A + LI-190R quantum sensor	For measuring  light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband
Masking tape			For sticking agarose block on mould
Murashige & Skoog Medium (MS Medium)	Duchefa Biochemie	MO222.0050	Plant Growth Medium
Nile Red	Sigma Aldrich	N3013-100MG	Fluorescent dye
Paraformaldehyde PFA	Sigma Aldrich	158127-100G	Fixative
Potassium Chloride (KCl)	POCH	739740114	PBS component
Potassium Hydroxide (KOH)	Sigma Aldrich	P1767-250G	pH adjustment
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	BIOSHOP	PPM302.500	PBS component
Sodium chloride (NaCl)	BIOSHOP	SOD001.1	PBS component
Sodium Deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750-25G	Clearing Solution
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O)	POCH	799490116	PBS component
Triton X-100	BIOSHOP	TRX506.100	Fixative
Urea	Sigma Aldrich	U5378-100G	Clearing Solution
Vacuum/Pressure pump and Dessicator	Welch by Gardner Denver	2522C-02	For Vacuum Infilteration
Xylitol	Sigma Aldrich	X3375-25G	Clearing Solution (componenet)