Combinación de microscopía de limpieza y fluorescencia para visualizar cambios en la expresión génica y respuestas fisiológicas a Plasmodiophora brassicae

Resumen

El presente protocolo describe un método optimizado para la observación histológica de agallas inducidas por Plasmodiophora brassicae. Las secciones de vibratomo de los hipocótilos se eliminan antes de las imágenes de fluorescencia para estudiar la participación de factores de transcripción y fitohormonas durante la progresión de la enfermedad. Este protocolo supera las limitaciones de incrustación de resina, permitiendo la visualización en planta de proteínas fluorescentes.

Resumen

La infección de los cultivos de Brassica por el protista terrestre Plasmodiophora brassicae conduce a la formación de agallas en los órganos subterráneos. La formación de agallas requiere reprogramación celular y cambios en el metabolismo de la planta infectada. Esto es necesario para establecer un sumidero fisiológico orientado a patógenos hacia el cual se redirigen los nutrientes del huésped. Para una comprensión completa de esta interacción planta-patógeno particular y los mecanismos por los cuales el crecimiento y desarrollo del huésped se subvierten y remodelan, es esencial rastrear y observar los cambios internos que acompañan a la formación de agallas con resolución celular. Los métodos que combinan tinciones fluorescentes y proteínas fluorescentes se emplean a menudo para estudiar las respuestas anatómicas y fisiológicas en las plantas. Desafortunadamente, el gran tamaño de las agallas y su baja transparencia actúan como obstáculos importantes para realizar observaciones de montaje completo bajo el microscopio. Además, la baja transparencia limita el empleo de la microscopía de fluorescencia para estudiar la progresión de la enfermedad de la raíz club y la formación de vesículas. Este artículo presenta un método optimizado para fijar y eliminar agallas para facilitar la epifluorescencia y la microscopía confocal para inspeccionar agallas infectadas por P. brassicae. Se utilizó un protocolo de limpieza de tejidos para la limpieza óptica rápida, seguido de una sección de vibratomo para detectar cambios anatómicos y localizar la expresión génica con fusiones de promotores y líneas reporteras marcadas con proteínas fluorescentes. Este método resultará útil para estudiar las respuestas celulares y fisiológicas en otras estructuras desencadenadas por patógenos en las plantas, como la sincitia inducida por nematodos y los nudos de la raíz, así como las agallas de las hojas y las deformaciones causadas por insectos.

Introducción

Las plantas afectadas por patógenos o insectos pueden desarrollar estructuras anormales (deformaciones de órganos o agallas), que permiten al invasor ingerir nutrientes y reproducirse¹. Aquí, se realizó un enfoque histopatológico eficiente para estudiar los cambios que tienen lugar en las agallas que se desarrollan en las partes subterráneas de las plantas infectadas con el protista Plasmodiophora brassicae (Figura 1). El hilo menor asociado con este patógeno surge del hecho de que las esporas en reposo de P. brassicae pueden conservar su capacidad de invadir las plantas durante muchos años. En el caso del cultivo a gran escala de colza (Brassica napus), este es un problema grave ya que los factores económicos restringen la rotación de cultivos, lo que lleva a la acumulación de esporas en reposo en el suelo². La resistencia de la colza oleaginosa a la enfermedad de la raíz palo causada por P. brassicae está determinada genéticamente. Lamentablemente, el patógeno a menudo supera la resistencia debido a su biología y al estrecho acervo genético del que se originó la colza. Por lo tanto, se ha vuelto relevante estudiar las respuestas posteriores a la infección en las plantas huésped y su capacidad para retrasar la progresión de la enfermedad o prevenir el desarrollo de ciertos síntomas.

En la enfermedad de la raíz club, la gravedad generalmente se evalúa en función del desarrollo de agallas y el grado de daño del sistema radicular. Esto se conoce como el Índice de Enfermedad-DI³. Sin embargo, no captura completamente la verdadera evaluación de esta interacción planta-patógeno. En particular, no aborda cómo se distribuye el patógeno dentro de las raíces y si la planta puede contenerse. P. brassicae movimiento dentro de sus tejidos. Además, no es fácil anticipar hasta qué punto P. brassicae Reprograma la anatomía de órganos subterráneos. Estudios sobre la planta modelo Arabidopsis thaliana han demostrado que P. brassicae La infección conduce a la inhibición de la xilogénesis (tanto en los pasos de inicio como de maduración) y la mejora de la diferenciación del floema dentro de las agallas^4,5. Además, en las raíces e hipocótilos de las plantas infectadas, la progenie de las células cambial no abandona el estado mitótico y prolifera más tiempo que en las plantas sanas.⁶. Este proceso gobierna el tamaño final de la agalla y determina el número de esporas en reposo de patógenos producidas dentro de la planta infectada. P. brassicaeLa reprogramación del desarrollo, metabólica y fisiológica impulsada en el huésped es muy compleja⁷; Por lo tanto, la aplicación de herramientas que permitan la inspección de los cambios internos dentro de las agallas es crucial para evaluar adecuadamente esta interacción. La progresión del ciclo de vida de P. brassicae se acompaña de la reprogramación del metabolismo de la célula huésped, que se puede observar como deposición de almidón o lípidos^7,8. El principal obstáculo para el éxito de la microscopía de agallas proviene de su baja transparencia. Debido a esto, la mayoría de las muestras histológicas que presentan cambios impulsados por la raíz del club dentro de las agallas se originan a partir de técnicas de fijación incrustada (cera o resina) seguidas de la sección de microtomos. Tales enfoques se utilizaron con éxito para localizar la actividad promotora de numerosos genes activos en las agallas de la raíz club.^4,5 o diversas técnicas de tinción que faciliten la observación de P. brassicae Progresión del ciclo de vida⁹. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que las etapas de fijación e incrustación requieren mucho tiempo y dan como resultado un lavado parcial o completo de biomoléculas importantes (por ejemplo, lípidos), lo que dificulta significativamente ciertas observaciones. Recientemente P. brassicae La progresión del ciclo de vida en el huésped se visualizó con la ayuda de la hibridación fluorescente in situ (FISH), en la que una metiltransferasa tipo SABATH (PbBSMT) se utilizó una sonda específica del gen para marcar la formación de esporas en reposo¹⁰. Una buena alternativa es el uso de otros métodos basados en fluorescencia donde se puede ver la autofluorescencia de algunos componentes celulares, la actividad de las regiones reguladoras 5'- aguas arriba de genes fusionados con marcadores de proteínas fluorescentes y la acumulación de proteínas marcadas con fluorescencia particulares. Sin embargo, además de la baja transparencia de las muestras, un inconveniente importante asociado con tales objetos es trabajar con especímenes no fijados, lo que disminuye significativamente el tiempo en el que se pueden documentar imágenes de buena calidad. En 2015, Kurihara et al.¹¹ desarrolló un reactivo de limpieza, que permite la preservación de proteínas fluorescentes y aumenta la transparencia de las muestras de tejido vegetal. Además, es compatible con numerosas tinciones histológicas. Recientemente, la misma técnica se aplicó con éxito para visualizar diferentes componentes de la pared celular en tejidos vegetales.^12,13. Aquí, este protocolo se ha utilizado para analizar varios aspectos del desarrollo de la agalla clubroot. El flujo de trabajo comienza con la fijación de agallas, la sección de vibratomo, la limpieza de tejidos, la tinción y las imágenes de fluorescencia. Dependiendo de las necesidades de cada uno, directamente o después de una tinción particular, las secciones resultantes pueden someterse a inspección bajo un microscopio de epifluorescencia o confocal. Este método proporciona una solución eficaz para estudiar los cambios locales en la expresión génica y las respuestas fisiológicas, incluyendo el equilibrio fitohormonal y la señalización. La progresión de la enfermedad se puede rastrear observando el patrón de distribución de las esporas en reposo y la dinámica de maduración. Además, el protocolo se puede aplicar fácilmente para cambios característicos de imagen dentro de P. brassicae plantas infectadas, incluida la inhibición de la xilogénesis o las respuestas de defensa de la planta huésped visibles como lignificación local en genotipos resistentes. Los ejemplos en este protocolo provienen de imágenes realizadas en el Arabidopsis thaliana modelo; Sin embargo, el Protocolo también puede aplicarse a otras especies de cultivos pertenecientes a la Brassicaceae familia. El método descrito a continuación facilitará futuros estudios detallados de las estructuras celulares y los cambios moleculares que acompañan a la formación de agallas en P. brassicae-plantas infectadas.

El flujo de trabajo general del protocolo es bastante sencillo, y todas las etapas del desarrollo de la agalla se pueden visualizar y caracterizar fácilmente (Figura 2). Dado que P. brassicae es un patógeno transmitido por el suelo, todos los experimentos deben llevarse a cabo en sistemas basados en el suelo. El patógeno prefiere condiciones ácidas; Por lo tanto, se deben utilizar sustratos de suelo no tratados con cal. Aunque P. brassicae no representa una amenaza para los humanos, es estrictamente un patógeno de plantas que puede propagarse a través del suelo y el agua. Por lo tanto, todas las partes de la planta infectada, así como el suelo, deben destruirse después del experimento mediante autoclave o mediante tratamiento con lejía.

Protocolo

1. Condiciones de crecimiento de las plantas

1. Cultivar plantas de Arabidopsis thaliana en un régimen de luz de día corto con 9 h de luz a 22 °C y 15 h de oscuridad a 20 °C y una irradiancia de 120 μmol·m−²s⁻¹ (medida como la radiación fotosintéticamente activa, PAR a nivel del dosel, ver Tabla de materiales).

2. Preparación del inóculo de esporas

NOTA: Para más detalles, véase Fuchs et ^al.14.

1. Homogeneizar de dos a tres agallas congeladas de plantas de col china (Brassica rapa var. pekinensis cultivar "Granaat") en una licuadora que contenga 300 ml de agua destilada esterilizada en autoclave y filtrar a través de cuatro capas de gasa estéril.
2. Centrifugar el filtrado (a 6.000 x g, durante 5 min, y a 4 °C) y retirar mecánicamente la capa de almidón del pellet de esporas utilizando una espátula. Repita este proceso hasta que se elimine la mayor parte del almidón.
3. Determine la concentración de esporas usando un hemocitómetro¹³ contando el número de esporas en 20 áreas de campo diferentes.
4. Asegúrese de que la concentración final de la suspensión de esporas utilizada para inocular sea de 1 x 10⁶ esporas·mL⁻¹ para Arabidopsis thaliana. Inocular cada planta 20 días después de la germinación con 2 mL de suspensión de esporas calibrada.

3. Preparación y fijación de tejidos

1. Preparar el tejido vegetal.
   1. Retire cuidadosamente la suciedad de los sistemas de raíces de las plantas infectadas y no infectadas. Limpie bien con agua y recoja los hipocótilos y agallas (longitud entre 0,5-2 cm) en tubos de microcentrífuga.
2. Realice la fijación de PFA (4% paraformaldehído, PFA en 1x PBS + 0.01% Triton X-100) siguiendo los pasos a continuación.
   1. Añadir 4 g de PFA en polvo (ver Tabla de materiales) a 100 ml de PBS (solución salina tamponada con fosfato, pH 7.4, Tabla 1) agitando a 65 °C (no hervir). Use KOH (10 M y 1M) gota a gota para obtener una solución transparente con un pH de alrededor de 11.
   2. Ajuste el pH con_H2SO4 para reducirlo a 6.9 y agregue 0.01% (v / v) Triton X-100 para mejorar la fijación. Alícuota la solución para conservar a −20 °C (no volver a congelar) o conservar a 4 °C.
3. Realizar la fijación de tejidos.
   1. Fijar las muestras en 200-500 μL de fijador de PFA durante 1 h a temperatura ambiente aplicando un vacío constante (700 mbar) utilizando una bomba de vacío. Asegúrese de que el objeto esté completamente sumergido en la solución PFA.
      NOTA: Las muestras pueden almacenarse durante algunas semanas a 4 °C (nevera) y utilizarse posteriormente para seccionarlas.

4. Incrustación y seccionamiento de tejidos

1. Use agarosa al 4% p/v para la incrustación de agarosa de hipocótilos no infectados y agallas infectadas. Hervir la solución para disolver la agarosa y verterla cuando se enfríe mientras aún está viscosa.
2. Seque el objeto ligeramente sobre un pañuelo de papel durante unos segundos para eliminar el exceso de PFA.
3. Use palillos de dientes / pinzas para incrustar y orientar cuidadosamente el objeto de la planta en agarosa. Para evitar secciones oblicuas, asegúrese de que el objeto esté orientado y moldeado correctamente para que su eje sea perpendicular al plano de la hoja de vibratomo (para secciones radiales).
4. Para acelerar la solidificación de la agarosa, coloque la placa de Petri o multicultivo a 4 °C durante 10 min.
   NOTA: Si el objeto es demasiado grande (como en el caso de agallas más grandes de Arabidopsis a los 21 días posteriores a la inoculación [DPI]), el objeto se puede seccionar incluso sin incrustar en agarosa.

5. Sección de vibratoré

NOTA: El vibratomo está equipado con una cuchilla de afeitar vibratoria para cortar órganos / tejidos vegetales. La velocidad de vibración, la amplitud, el ángulo de la cuchilla y el grosor de la sección son parámetros que se pueden ajustar (consulte la Tabla de materiales).

1. Con una cuchilla, corte y moldee cuidadosamente el objeto dentro de un bloque de agarosa, anotando la orientación preferida para la sección.
2. Pegue el bloque de agarosa/agalla grande para montarlo correctamente en el portamuestras con cianoacrilato/pegamento instantáneo y cinta adhesiva (consulte la Tabla de materiales).
3. Para los hipocótilos y agallas de Arabidopsis (etapas tempranas ), mantenga el grosor de las secciones entre 30-40 μm para obtener imágenes de buena calidad.
   NOTA: Para analizar las etapas posteriores de la progresión de la vesícula, el grosor de las secciones puede estar entre 50-80 μm.
4. Absténgase de cortar secciones más delgadas, ya que puede destruir la muestra de agalla debido a las vibraciones de la cuchilla móvil.
5. Ajuste el grosor de las secciones, la velocidad y la amplitud de vibración de acuerdo con el grosor y el tamaño de la agalla (40 μm o 60 μm).
6. Agregue agua destilada al baño de agua y comience con la sección.
7. Recoja cuidadosamente las secciones con pinzas o cepillo y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga que contenga 1 ml de 1x tampón PBS (pH 7.4).
   NOTA: Normalmente, cuanto mayor sea la amplitud de vibración, mejor será la calidad de la sección. Para hipocótilos o agallas no infectadas que no contienen esporas maduras en reposo, la amplitud de vibración se puede mantener a 1,2 mm con una velocidad de 0,60 mm·s⁻¹ . En caso de agallas grandes con pérdida parcial de la integridad celular y signos visibles de maduración de esporas, la amplitud de vibración debe reducirse a 0,55 mm con una velocidad de 0,45 mm·s⁻¹ .

6. Limpieza de muestras

1. Retire 1x PBS del tubo de microcentrífuga y agregue 200-500 μL de solución de limpieza (Tabla 1).
2. A partir de ahora, almacene las muestras a temperatura ambiente en la oscuridad. Asegúrese de que los objetos estén siempre sumergidos en la solución de limpieza en todo momento.
3. Reemplace la solución de limpieza por la nueva si su color cambia después de algún tiempo durante el procesamiento de la muestra.
   NOTA: El color de la solución de limpieza puede volverse amarillento debido al procesamiento de la muestra. En tal caso, se recomienda reemplazar la solución para mejorar la limpieza de los tejidos.

7. Procedimiento de tinción

1. Para la tinción de blanco de Calcofluor para las paredes celulares (para extraer células vegetales), prepare 5% v/v de tinción blanca de Calcofluor (ver Tabla de materiales) en la solución de aclaramiento. Manche durante al menos 5 minutos en la oscuridad.
2. Para teñir lípidos con Rojo del Nilo (para teñir esporas en reposo y gotas de aceite en células infectadas), prepare 1 mg/ml de la cepa (ver Tabla de materiales) en solución de limpieza. Diluir aún más para obtener 1:99. Manche durante al menos 10 minutos en la oscuridad.
3. Para la tinción básica de lignina Fuchsin, prepare 0.2% p/v de la tinción (ver Tabla de materiales) en solución de limpieza. Manche durante al menos 10 minutos en la oscuridad.
   NOTA: Durante la tinción doble, las muestras se tiñen primero con Nile Red durante 10 minutos antes de la aplicación de Calcofluor white. El exceso de soluciones de tinción se eliminó después de cada paso. Si el objeto parece estar sobremanchado, retire el exceso de mancha lavándolo con la solución de aclaración. Diluya las manchas con la solución de aclaración, si es necesario. Siempre tiñe la muestra con Nile Red/Basic Fuchsin antes de la tinción de Calcofluor. La tinción primero con Calcofluor puede prevenir la tinción adecuada de las esporas por Nile Red.

8. Microscopía

1. Monte secciones despejadas en el portaobjetos de microscopía y observe bajo un microscopio de epifluorescencia o confocal (consulte la Tabla de materiales). Utilice una solución de limpieza como medio de montaje para evitar el secado de la muestra.
2. Utilice múltiples modos de adquisición para obtener imágenes de más de un espectro de fluorescencia simultáneamente.
   NOTA: Los espectros de excitación/emisión utilizados en el protocolo presentado son los siguientes: para Nile Red 553/636 nm, para autofluorescencia de xilema 380/475 nm, para Basic Fuchsin 561/650 nm, para Calcofluor white 405/475 nm, para erRFP 585/608 nm, y para GFP 488/509 nm (Tabla 2).

Resultados

Con Nile Red que tiñe los lípidos y la suberina, es posible ver las esporas en reposo del patógeno que contienen lípidos (Figura 3A, B). Por lo tanto, utilizando la tinción doble, se pueden obtener imágenes nítidas para observar el patrón de distribución de patógenos dentro de las agallas. La contratinción con blanco de Calcofluor crea contraste y ayuda a rastrear simultáneamente el desarrollo del xilema con la maduración de P. brassicae (Figura 3B).

La formación y el desarrollo del xilema también podrían verificarse observando la autofluorescencia en muestras no teñidas (Figura 4A) o utilizando tinciones como la Fuchsin básica que permiten obtener imágenes de lignina basadas en fluorescencia (Figura 4B).

Mediante el uso de este método, se podría rastrear los cambios en la expresión génica o las respuestas a los reguladores del crecimiento. Un ejemplo perfecto es cuando las plantas de Arabidopsis que albergan la construcción pHCA2: erRFP se utilizaron para visualizar la expresión génica de ALTA ACTIVIDAD CAMBIAL 2 (HCA2) en el tejido del floema dentro de las agallas de la raíz club. La actividad del gen HCA2 se ha encontrado previamente en células meristemáticamente activas de cambium y floema de linaje¹⁵. Aquí, se co-localiza con el floema en las últimas etapas del desarrollo de la agalla impulsada por P. brassicae, y su actividad refleja cómo P. brassicae aumenta la complejidad del floema (Figura 5). La imagen resultante muestra la proliferación del floema en la última etapa del desarrollo de la agalla cuando el cambium se fragmenta. La Figura 5A muestra una sección de la vesícula no despejada de la vesícula, mientras que la Figura 5B muestra señales fluorescentes más nítidas y localizadas obtenidas por la sección de vibratomo seguida de la limpieza del tejido. Los objetos fueron contrastados con blanco Calcofluor. La Figura 6 compara esta imagen (Figura 6B) con una región similar representada en agallas incrustadas en resina y seccionadas con microtomo (Figura 6A) a 21 DPI. Las respuestas diferenciales de citoquinina entre plantas infectadas y no infectadas se evaluaron comprobando la expresión del marcador TCS:GFP (Two Component Signalling)¹⁶ en agallas en desarrollo (Figura 7). Al obtener imágenes de señales débiles de GFP en agallas y tejidos con engrosamientos secundarios, es importante tener en cuenta que la señal de fondo adicional debido a la autofluorescencia de las células maduras del xilema también se captura durante la obtención de imágenes.

Figura 1: Síntomas de la enfermedad de la raíz del club en colza (B. napus) y Arabidopsis thaliana (Columbia-0) a 26 DPI con esporas de Plasmodiophora brassicae . Durante el curso de la enfermedad, se desarrollan agallas grandes en todo el sistema radicular, lo que lo hace extremadamente frágil. Concluye liberando esporas en el suelo circundante para promover futuras infecciones. Las partes superiores del cuerpo de la planta también muestran signos de crecimiento y desarrollo deficientes. Finalmente, las plantas infectadas sucumben a los efectos devastadores sobre el metabolismo y el desarrollo del crecimiento una vez que el sistema radicular se daña por completo y la planta ya no puede hacer frente a la enfermedad. La barra de escala representa 1 cm. El -INF significa simulacro de inoculado, mientras que +INF significa plantas inoculadas por P. brassicae. En esta ocasión, se proporciona una imagen de las plantas de colza oleaginosa antes de la remoción del suelo para presentar sistemas radiculares sanos. Después del lavado, solo se recolectan el hipocótilo y la parte superior de la raíz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: El flujo de trabajo general. Los sistemas radiculares de Arabidopsis lavados son (A) diseccionados, (B) fijos, (C) agarosa incrustados, (D) montados y (E) seccionados en el vibratomo. Los objetos resultantes se someten a limpieza tisular (3 días a varias semanas en RT en la oscuridad, dependiendo del tipo de tejido y grosor). (F) Los objetos despejados pueden ser teñidos e inspeccionados bajo el microscopio. (G) Resumen del flujo de trabajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Marcado de esporas de patógenos con tinción de Rojo del Nilo. (A,B) El rojo del Nilo tiñe los lípidos en las esporas en reposo, lo que funciona perfectamente para rastrear la maduración de P. brassicae. (A) Células agrandadas colonizadas por P. brassicae y llenas de esporas de patógenos. (B) Las células maduras del xilema también se tiñen con el rojo del Nilo. La sección ha sido contrateñida con blanco de Calcofluor para ver el desembolso de las células huésped (A: Lente objetivo = 20x y espesor de sección = 60 μm; B: Lente del objetivo = 5x y grosor de sección = 60 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Seguimiento de la extensión del desarrollo y maduración del xilema. (A) La lignina proporciona una fuerte autofluorescencia tras la excitación con UV; Por lo tanto, el xilema maduro se puede discriminar con relativa facilidad. (B) La tinción doble con Fuchsin básico y Calcofluor da mejores resultados ya que todas las células se tiñen con este último tinte, mientras que el xilema maduro se tiñe claramente con Fuchsin básico. De esta manera, la tinción doble proporciona imágenes con un contraste mejorado que representa una inhibición notable de la xilogénesis (A: Lente objetivo = 10x y grosor de sección = 60 μm; B: Lente del objetivo = 10x y grosor de sección = 60 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Señal específica del floema para el gen HCA2 en hipocótilos de plantas infectadas con P. brassicae a 21 DPI. La actividad promotora de proHCA2::erRFP que alberga Arabidopsis thaliana transgénica se puede ver en (A) y (B). Se pueden observar diferencias entre una sección de mano no despejada en el panel (A) donde la señal erRFP aparece difusa debido a la superposición y la superposición de capas celulares, especialmente en secciones de mano desiguales. Por otro lado, (B) muestra una sección de vibratomo después de la limpieza del tejido donde la señal erRFP marca con precisión las células del floema en un haz vascular maduro (lente objetivo = 20x y grosor de sección = 60 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Comparación entre agallas TB, incrustadas en resina y seccionadas con micrótomo con la ayuda de fluorescencia. (A) Una comparación entre imágenes de azul de toluidina (TB), agallas incrustadas en resina y seccionadas con microtomos, y (B) un objeto representativo (también presentado en la Figura 5B) adquirido con la ayuda de fluorescencia. Las células de xilema están marcadas con asteriscos amarillos, el área cambial con corchetes verdes vivos, el floema con asteriscos cian y las células colonizadas por Plasmodiophora brassicae con un símbolo blanco de PB. Las secciones incrustadas en resina (A) proporcionan una buena resolución para estudiar la distribución de las esporas en reposo en órganos hipertrofiados, el grado de progresión de la enfermedad y otros procesos como la lignificación local en plantas resistentes. Sin embargo, el protocolo descrito aquí (B) permite la observación sensible de la expresión génica o la acumulación de proteínas y la visualización de otros cambios fisiológicos y moléculas importantes como los lípidos (en esporas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Seguimiento de las respuestas de señalización de citoquinina en hipocótilos de plantas de Arabidopsis no infectadas (-INF) y infectadas por P. brassicae (+INF) a 16 DPI. El marcador TCS::GFP se utilizó para caracterizar las respuestas de citoquinina en planta. Las secciones de vibratomo se sometieron a un tratamiento de aclaramiento seguido de tinción con blanco de Calcofluor. Según la imagen, a 16 DPI, las respuestas de citoquinina parecen estar disminuidas en gran medida en las agallas infectadas (panel derecho), mientras que permanecen fuertes, especialmente en el grupo de floema (células que eventualmente se diferenciarán para formar tejido del floema), en plantas no infectadas (panel izquierdo) (lente objetivo = 5x y grosor = 30 μm). Ciertos niveles de autofluorescencia del xilema también pueden ser visibles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Solución de limpieza (tóxico)
Componentes	Porcentaje (%)	en 100 ml de agua destilada
Xilitol	10%	10g
Desoxicolato de sodio	15%	15g
Urea	25%	25g
10x PBS (solución salina tamponada con fosfato)		1x PBS (100 ml)
NaCl	8 g	10 mL 10x PBS + 90 mL de agua destilada
Kcl	0,2 g
KH2PO4	0,24 g
Na2HPO4 · 2H2O	1,81 g
agua destilada	100 ml
pH	pH ajustado a 7,4 mediante HCl
Autoclave y conservar a 4 °C.

Tabla 1: Composición de la solución de limpieza y solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Mancha fluorescente / Etiqueta	Longitudes de onda de excitación/emisión	Conjunto de filtros de microscopio utilizado
Rojo del Nilo	553/636 nm	Conjunto de filtros 43
Autofluorescencia de xilema	380/475 nm	Conjunto de filtros 49
Calcofluor Blanco	405/475 nm	Conjunto de filtros 49
Fuchsin básico	561/650 nm	Conjunto de filtros 43
erRFP	585/608 nm	Conjunto de filtros 43
GFP	488/509 nm	Conjunto de filtros 38

Tabla 2: Espectros de excitación/emisión seleccionados para el presente estudio.

Discusión

La aplicación de la solución de limpieza en secciones de agallas cortadas por vibratomos seguramente mejora la capacidad de estudiar la interacción biotrófica entre P. brassicae y la planta huésped. Aunque el protocolo de limpieza se aplica incluso a las secciones de la mano, funciona mejor con las secciones de vibratomo. La fijación de muestras en fijador de PFA actúa como un paso crítico en el protocolo, ya que las muestras se pueden almacenar a 4 ° C durante unos días antes de proceder con la sección. Esto proporciona flexibilidad para almacenar muestras durante un período limitado sin comprometer la expresión y preservación de proteínas fluorescentes durante la fijación.

El rojo del Nilo (en DMSO o metanol) es incompatible con las secciones de resina debido a su hidrofobicidad, que disuelve la resina y destruye las secciones¹⁷ incrustadas en resina. Por lo tanto, las secciones de vibratomo resultan fundamentales para estudiar la distribución de patógenos y su ciclo de vida dentro de las agallas en desarrollo, en las que la tinción de rojo del Nilo se puede usar fácilmente.

La solución de limpieza utilizada en este protocolo es altamente versátil¹², lo que permite utilizar una variedad de tinciones fluorescentes en diferentes combinaciones para teñir varias biomoléculas/componentes de las paredes celulares (suberina, lignina, celulosa y quitina en interacciones fúngicas). También es posible contrarrestar secciones de líneas marcadoras fluorescentes de GFP y, por lo tanto, correlacionar la actividad promotora o el patrón de acumulación de proteínas con la presencia del patógeno en células o regiones particulares de la vesícula. Sin embargo, la autofluorescencia de fondo del xilema y las células gigantes llenas de patógenos no se pudo eliminar incluso después del protocolo de limpieza. Esto presenta una limitación para observar los marcadores fluorescentes durante las últimas etapas de la formación de la vesícula, especialmente cuando se usa un microscopio de epifluorescencia y se obtienen imágenes de señales débiles.

Debido a los bajos niveles de expresión/acumulación de señales fluorescentes, los factores de transcripción son difíciles de detectar, pero, con esta técnica, es posible obtener imágenes satisfactorias para ellos. En general, la combinación de la sección de vibratomo con el enfoque de limpieza de tejidos amplía el conjunto de herramientas para observaciones histológicas de tejidos biliares complejos. La flexibilidad de este protocolo facilita el proceso de fijación de tejidos y reduce el tiempo requerido para cortar y obtener imágenes de muestras de tejido fresco para observar proteínas fluorescentes y actividades promotoras. Con mejoras adicionales y mediante la utilización de otros colorantes fluorescentes específicos para diversas biomoléculas, este método marcará mayores avances en estudios histológicos y análisis de imágenes de tejidos densos y opacos con una organización tisular compleja. En los últimos tiempos, el método de depuración tisular presentado se ha convertido en un protocolo popular y ampliamente utilizado para combinar y permitir la adquisición simultánea de diferentes señales fluorescentes^11,12,13. El desarrollo futuro y las modificaciones en tales técnicas mejorarán en gran medida la resolución de la imagen para observar las interacciones planta-patógeno a nivel celular.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2N Sulfuric acid (H2SO4)	Roth	UN2796	pH adjustment
Agarose	PRONA	BGQT100	Embedding
Basic Fuchsin	BIOSHOP	BSF410.5	Fluorescent dye
Calcofluor White	Sigma Aldrich	18909-100ML-F	Fluorescent dye
Commercial Bleach	Domestos
Cyanoacrylate/ Instant glue	Kropelka		Adhesive
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	BIOSHOP	DMS555.500	Solvent
Epifluorescence microscope	Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system	Carl Zeiss M2	Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used
Fully automated Vibratome	Leica	VT1200 S
Lightmeter /Photometer	LI-COR Biosciences	LI-250A + LI-190R quantum sensor	For measuring  light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband
Masking tape			For sticking agarose block on mould
Murashige & Skoog Medium (MS Medium)	Duchefa Biochemie	MO222.0050	Plant Growth Medium
Nile Red	Sigma Aldrich	N3013-100MG	Fluorescent dye
Paraformaldehyde PFA	Sigma Aldrich	158127-100G	Fixative
Potassium Chloride (KCl)	POCH	739740114	PBS component
Potassium Hydroxide (KOH)	Sigma Aldrich	P1767-250G	pH adjustment
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	BIOSHOP	PPM302.500	PBS component
Sodium chloride (NaCl)	BIOSHOP	SOD001.1	PBS component
Sodium Deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750-25G	Clearing Solution
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O)	POCH	799490116	PBS component
Triton X-100	BIOSHOP	TRX506.100	Fixative
Urea	Sigma Aldrich	U5378-100G	Clearing Solution
Vacuum/Pressure pump and Dessicator	Welch by Gardner Denver	2522C-02	For Vacuum Infilteration
Xylitol	Sigma Aldrich	X3375-25G	Clearing Solution (componenet)