Настоящий протокол описывает оптимизированный метод гистологического наблюдения галлов, индуцированных Plasmodiophora brassicae. Вибратомные участки гипокотилов очищаются перед флуоресцентной визуализацией для изучения участия факторов транскрипции и фитогормонов во время прогрессирования заболевания. Этот протокол преодолевает ограничения по встраиванию смолы, позволяя в растении визуализировать флуоресцентные белки.
Заражение культур Brassica почвенным протистом Plasmodiophora brassicae приводит к образованию галла на подземных органах. Образование галлов требует клеточного перепрограммирования и изменения метаболизма зараженного растения. Это необходимо для установления патогенно-ориентированного физиологического поглотителя, к которому перенаправляются питательные вещества хозяина. Для полного понимания этого конкретного взаимодействия растений и патогенов и механизмов, с помощью которых рост и развитие хозяина подрываются и перестраиваются, важно отслеживать и наблюдать внутренние изменения, сопровождающие образование желчи с клеточным разрешением. Методы, сочетающие флуоресцентные пятна и флуоресцентные белки, часто используются для изучения анатомических и физиологических реакций у растений. К сожалению, большой размер галлов и их низкая прозрачность действуют как основные препятствия при выполнении наблюдений под микроскопом. Кроме того, низкая прозрачность ограничивает использование флуоресцентной микроскопии для изучения прогрессирования клубневого заболевания и образования желчи. В этой статье представлен оптимизированный метод фиксации и очистки галлов для облегчения эпифлуоресценции и конфокальной микроскопии для осмотра P. brassicae-инфицированных галлов. Был использован протокол очистки тканей для быстрой оптической очистки с последующим вибратомным сечением для обнаружения анатомических изменений и локализации экспрессии генов с помощью промоторных слияний и репортерных линий, помеченных флуоресцентными белками. Этот метод окажется полезным для изучения клеточных и физиологических реакций в других патогенных структурах растений, таких как нематода-индуцированная синцития и корневые узлы, а также галлы листьев и деформации, вызванные насекомыми.
Растения, пораженные патогенами или насекомыми, могут развивать аномальные структуры (деформации органов или галлы), которые позволяют захватчику глотать питательные вещества иразмножаться 1. Здесь был предпринят эффективный гистопатологический подход для изучения изменений, происходящих в галлах, которые развиваются на подземных частях растений, зараженных протистом Plasmodiophora brassicae (рисунок 1). Незначительная нить, связанная с этим патогеном, возникает из того факта, что споры покоя P. brassicae могут сохранять свою способность вторгаться в растения в течение многих лет. В случае масштабного выращивания масличного рапса (Brassica napus) это серьезная проблема, поскольку экономические факторы ограничивают севооборот, приводя к накоплению спор в почве2. Устойчивость масличного рапса к булавой болезни, вызванной P. brassicae , генетически детерминирована. К сожалению, патоген часто перехитрил резистентность из-за своей биологии и узкого генетического пула, из которого произошел рапс. Поэтому стало актуальным изучение постинфекционных реакций у растений-хозяев и их способности замедлять прогрессирование заболевания или предотвращать развитие определенных симптомов.
При клубневых заболеваниях тяжесть обычно оценивается на основе развития галлов и степени повреждения корневой системы. Это называется индексом заболеваний-DI3. Однако он не в полной мере отражает истинную оценку этого взаимодействия растений и патогенов. В частности, в нем не рассматривается, как патоген распределяется внутри корней и может ли растение сдерживать P. brassicae движение внутри его тканей. Кроме того, нелегко предвидеть, в какой степени P. brassicae перепрограммирует подземную анатомию органа. Исследования на модельном заводе Arabidopsis thaliana показали, что P. brassicae инфекция приводит к ингибированию ксилогенеза (как на стадии инициации, так и на стадии созревания) и усилению дифференцировки флоэмы в галлах4,5. Более того, в корнях и гипокотилах зараженных растений потомство камбиальных клеток не выходит из митотического состояния и размножается дольше, чем у здоровых растений.6. Этот процесс управляет конечным размером галла и определяет количество спор патогена, находящихся в состоянии покоя, продуцируемых внутри зараженного растения. P. brassicae-управляемое развитие, метаболическое и физиологическое перепрограммирование у хозяина очень сложно7; поэтому применение инструментов, позволяющих контролировать внутренние изменения в галлах, имеет решающее значение для правильной оценки этого взаимодействия. Прогрессия жизненного цикла P. brassicae сопровождается перепрограммированием клеточного метаболизма хозяина, который может наблюдаться в виде крахмала или липидного отложения7,8. Основным препятствием для успешной микроскопии галлов является их низкая прозрачность. Из-за этого большинство гистологических образцов, представляющих клубневые изменения в галлах, происходят от методов фиксации-встраивания (воск или смола) с последующим сечением микротомов. Такие подходы были успешно использованы для определения активности промотора для многочисленных генов, активных в клубневых галлах.4,5 или различные методы окрашивания, облегчающие наблюдение P. brassicae прогрессирование жизненного цикла9. Однако следует отметить, что этапы фиксации и встраивания являются трудоемкими и приводят к частичному или полному вымыванию важных биомолекул (например, липидов), что значительно затрудняет некоторые наблюдения. Недавно P. brassicae прогрессирование жизненного цикла у хозяина визуализировали с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), в которой метилтрансфераза типа SABATH (PbBSMT) генно-специфический зонд был использован для маркировки образования спор в состоянии покоя10. Хорошей альтернативой является использование других методов на основе флуоресценции, где можно увидеть автофлуоресценцию некоторых клеточных компонентов, активность 5'-восходящих регуляторных областей генов, слитых с флуоресцентными белковыми маркерами, и накопление определенных флуоресцентно помеченных белков. Однако, помимо низкой прозрачности образцов, основным недостатком, связанным с такими объектами, является работа с нефиксированными образцами, что значительно сокращает время, в течение которого изображения хорошего качества могут быть задокументированы. В 2015 году Курихара и др.11 разработан очищающий реагент, который позволяет сохранять флуоресцентные белки и повышает прозрачность образцов растительной ткани. Кроме того, он совместим с многочисленными гистологическими пятнами. Недавно эта же методика была успешно применена для визуализации различных компонентов клеточной стенки в тканях растений.12,13. Здесь этот протокол был использован для анализа различных аспектов развития булавой желчи. Рабочий процесс начинается с фиксации галлов, сечения вибратома, очистки тканей, окрашивания и флуоресцентной визуализации. В зависимости от потребностей, непосредственно или после конкретного окрашивания, полученные участки могут быть подвергнуты осмотру под эпифлуоресцентным или конфокальным микроскопом. Этот метод обеспечивает эффективное решение для изучения локальных изменений экспрессии генов и физиологических реакций, включая фитогормональный баланс и передачу сигналов. Прогрессирование заболевания можно отследить, посмотрев на структуру распределения спор покоя и динамику созревания. Кроме того, протокол может быть легко применен для визуализации изменений характеристик в пределах P. brassicae зараженные растения, включая ингибирование ксилогенеза или защитные реакции растений-хозяев, видимых как локальная лигнификация в резистентных генотипах. Примеры в этом протоколе взяты из изображений, проведенных на Arabidopsis thaliana модель; однако протокол может также применяться к другим видам сельскохозяйственных культур, принадлежащим к Brassicaceae семья. Метод, описанный ниже, облегчит будущие детальные исследования клеточных структур и молекулярных изменений, сопровождающих образование желчи в P. brassicae-зараженные растения.
Общий рабочий процесс протокола довольно прост, и все этапы развития желчи можно легко сфотографировать и охарактеризовать (рисунок 2). Поскольку P. brassicae является почвенным патогеном, все эксперименты должны проводиться в почвенных системах. Возбудитель предпочитает кислые условия; поэтому необходимо использовать почвенные субстраты, не обработанные известью. Хотя P. brassicae не представляет угрозы для человека, он является строго растительным патогеном, который может распространяться через почву и воду. Поэтому все части зараженного растения, а также почву нужно уничтожить после эксперимента автоклавированием или обработкой отбеливателем.
1. Условия роста растений
2. Приготовление спорового инокулята
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную информацию см. в Fuchs et al.14.
3. Подготовка и фиксация тканей
4. Встраивание и сечение тканей
5. Вибратомное секционирование
ПРИМЕЧАНИЕ: Вибратом оснащен вибрирующим лезвием бритвы для разрезания органов / тканей растений. Скорость вибрации, амплитуда, угол наклона лезвия и толщина сечения — все это параметры, которые можно регулировать (см. Таблицу материалов).
6. Очистка образцов
7. Процедура окрашивания
8. Микроскопия
С nile Red, который окрашивает липиды и суберины, можно увидеть возбудителя покоящиеся споры, содержащие липиды (рисунок 3A, B). Следовательно, используя двойное окрашивание, можно получить четкие изображения, чтобы посмотреть на картину распространения патогенов в галлах. Контрокрашивание с помощью Calcofluor white создает контраст и помогает одновременно отслеживать развитие ксилемы с созреванием P. brassicae (рисунок 3B).
Образование и развитие ксилемы также может быть проверено путем наблюдения автофлуоресценции в незапятнанных образцах (рисунок 4A) или с использованием пятен, таких как Базовый фуксин, которые позволяют флуоресцентную визуализацию лигнина (рисунок 4B).
Используя этот метод, можно отслеживать изменения экспрессии генов или реакции на регуляторы роста. Прекрасным примером является то, что растения Arabidopsis с конструкцией pHCA2: erRFP были использованы для визуализации экспрессии гена HIGH CAMBIAL ACTIVITY 2 (HCA2) в ткани флоэмы в клубневых галлах. Активность гена HCA2 ранее была обнаружена в меристематически активных клетках камбия и флоэмы15. Здесь он совместно локализуется с флоэмой на поздних стадиях развития галла, управляемого P. brassicae, и его активность отражает то, как P. brassicae увеличивает сложность флоэмы (рисунок 5). Полученное изображение показывает пролиферацию флоэмы на поздней стадии развития желчи, когда камбий фрагментируется. На рисунке 5A показан неочищенный участок желчи, тогда как на рисунке 5B показаны более четкие и локализованные флуоресцентные сигналы, полученные путем сечения вибратома с последующим очищением тканей. Объекты были увлажнены калькофторовым белым цветом. На рисунке 6 сравнивается это изображение (рисунок 6B) с аналогичной областью, изображенной в галлах, встроенных в смолу и микротомов (рисунок 6A) при 21 DPI. Дифференциальные реакции цитокинина между инфицированными и неинфицированными растениями оценивали путем проверки экспрессии маркера TCS:GFP (Two Component Signalling)16 у развивающихся галлов (рисунок 7). При визуализации слабых сигналов GFP в галлах и тканях с вторичными утолщениями важно отметить, что дополнительный фоновый сигнал за счет автофлуоресценции зрелых клеток ксилемы также фиксируется во время визуализации.
Рисунок 1: Симптомы клубневой болезни на масличных культурах рапса (B. napus) и Arabidopsis thaliana (Columbia-0) при 26 DPI со спорами Plasmodiophora brassicae . Во время течения болезни на всей корневой системе развиваются крупные галлы, что делает ее крайне хрупкой. Он завершается высвобождением спор в окружающую почву для стимулирования будущих инфекций. Верхние части тела растения также показывают признаки плохого роста и развития. Наконец, зараженные растения поддаются разрушительному воздействию на метаболизм и развитие роста, как только корневая система полностью повреждается, и растение больше не может справиться с болезнью. Шкала представляет собой 1 см. -INF расшифровывается как имитация-инокулированная, тогда как +INF расшифровывается как P. brassicae-inoculateed plants. По этому случаю перед удалением почвы дается фотография растений масличного рапса, чтобы представить здоровую корневую систему. После промывки собирают только гипокотил и верхнюю часть корня. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Общий рабочий процесс. Промытые корневые системы Arabidopsis (A) рассечены, (B) фиксированы, (C) агароза встроены, (D) установлены и (E) разделены на вибратоме. Полученные предметы подвергают очистке тканей (от 3 дней до нескольких недель при РТ в темное время суток, в зависимости от типа и толщины ткани). (F) Очищенные объекты затем могут быть окрашены и проверены под микроскопом. G) Резюме рабочего процесса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Маркировка спор патогена пятном Nile Red. (A,B) Nile Red окрашивает липиды в покоящихся спорах, что отлично работает для отслеживания созревания P. brassicae. (A) Увеличенные клетки, колонизированные P. brassicae и заполненные спорами патогенов. (B) Зрелые клетки ксилемы также окрашиваются Красным Нилом. Секция была покрыта calcofluor белым цветом, чтобы увидеть расходы клеток-хозяев (A: объектив = 20x и толщина секции = 60 мкм; B: Объектив = 5x и толщина сечения = 60 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Отслеживание степени развития и созревания ксилемы. (А) Лигнин дает сильную автофлуоресценцию при возбуждении УФ-излучением; поэтому зрелую ксилему можно относительно легко дискриминировать. (B) Двойное окрашивание базовым фуксином и калькофтором дает лучшие результаты, поскольку все клетки окрашиваются последним красителем, в то время как зрелая ксилема отчетливо окрашивается основным фуксином. Таким образом, двойное окрашивание обеспечивает изображениям улучшенную контрастность, изображая заметное ингибирование ксилогенеза (A: объектив = 10x и толщина сечения = 60 мкм; B: Объектив = 10x и толщина сечения = 60 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Флоэм-специфический сигнал для гена HCA2 в гипокотилах растений, инфицированных P. brassicae, при 21 DPI. Промоутерная активность для proHCA2::erRFP , укрывающая трансгенный Arabidopsis thaliana , может быть замечена в (A) и (B). Различия можно наблюдать между неочищенной секцией руки на панели (A), где сигнал erRFP кажется рассеянным из-за наложения и перекрывающихся слоев ячеек, особенно в неровных секциях рук. С другой стороны, (B) показывает вибратомный участок после очистки тканей, где сигнал эрРФП точно отмечает клетки флоэмы в зрелом сосудистом пучке (объектив = 20x и толщина сечения = 60 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Сравнение туберкулеза, смоляных и микротомовых рассеченных галлов с помощью флуоресценции. (A) Сравнение изображений толуидиновых голубых (TB), смоляных и микротомовых рассеченных галлов и (B) репрезентативного объекта (также представленного на рисунке 5B), полученного с помощью флуоресценции. Клетки ксилемы помечены желтыми звездочками, камбиальная область — ярко-зелеными скобками, флоэма — голубыми звездочками, а клетки Plasmodiophora brassicae — белым символом PB. Покрытые смолой срезы (А) обеспечивают хорошее разрешение для изучения распределения спор покоя в гипертрофированных органах, степени прогрессирования заболевания и других процессов, таких как локальное одреценение у резистентных растений. Однако протокол, описанный здесь (B), позволяет чувствительно наблюдать экспрессию генов или накопление белка и визуализировать другие физиологические изменения и важные молекулы, такие как липиды (в спорах). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Отслеживание сигнальных реакций цитокинина в гипокотилах неинфицированных (-INF) и P. brassicae-инфицированных (+INF) растений Arabidopsis при 16 DPI. Маркер TCS::GFP использовался для характеристики реакций на цитокинин растений. Вибратомные срезы подвергались очищающей обработке с последующим окрашиванием калькофторовым белым цветом. Основываясь на изображении, при 16 DPI реакции цитокинина, по-видимому, в значительной степени уменьшаются в инфицированных галлах (правая панель), в то время как они остаются сильными, особенно в пуле флоэм (клетки, которые в конечном итоге дифференцируются с образованием ткани флоэмы), в неинфицированных растениях (левая панель) (объективная линза = 5x и толщина = 30 мкм). Также могут быть видны определенные уровни автофлуоресценции ксилемы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Очищающий раствор (токсичный) | ||
Компоненты | Процент (%) | в дистиллированной воде 100 мл |
Ксилит | 10% | 10г |
Дезоксихолат натрия | 15% | 15г |
Мочевина | 25% | 25г |
10x PBS (фосфатно-буферный физиологический раствор) | 1x PBS (100 мл) | |
НаКл | 8 г | 10 мл 10x PBS + 90 мл дистиллированной воды |
ККл | 0.2 г | |
KH2PO4 | 0,24 г | |
На2ХПО4 · 2Ч2О | 1,81 г | |
дистиллированная вода | 100 мл | |
рН | pH, скорректированный до 7,4 с использованием HCl | |
Автоклав и хранить при 4 °C. |
Таблица 1: Состав клирингового раствора и фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
Флуоресцентное пятно/ Тег | Длины волн возбуждения/излучения | Используемый набор фильтров микроскопа |
Красный Нил | 553/636 морских миль | набор фильтров 43 |
Ксилема Автофлуоресценция | 380/475 нм | набор фильтров 49 |
Кальцифтор Белый | 405/475 нм | набор фильтров 49 |
Базовый Фуксин | 561/650 нм | набор фильтров 43 |
эрРФП | 585/608 морских миль | набор фильтров 43 |
ГФП | 488/509 морских миль | набор фильтров 38 |
Таблица 2: Спектры возбуждения/излучения, отобранные для настоящего исследования.
Нанесение очищающего раствора на вибратомные срезы галлов, безусловно, повышает способность изучать биотрофное взаимодействие между P. brassicae и растением-хозяином. Хотя протокол очистки применяется даже к ручным секциям, он лучше работает с секциями вибратома. Фиксация образцов в фиксаторе PFA действует как критический шаг в протоколе, поскольку образцы затем могут храниться при 4 ° C в течение нескольких дней, прежде чем приступить к разделению. Это обеспечивает гибкость для хранения образцов в течение ограниченного периода времени без ущерба для экспрессии и сохранения флуоресцентных белков во время фиксации.
Красный нил (в ДМСО или метаноле) несовместим со смоляными срезами из-за своей гидрофобности, которая растворяет смолу и разрушает встроенные в смолу участки17. Таким образом, вибратомные участки оказываются полезными для изучения распространения патогена и его жизненного цикла в развивающихся галлах, при этом окрашивание в красный нил может быть легко использовано.
Очищающий раствор, используемый в этом протоколе, является очень универсальным12, что позволяет использовать различные флуоресцентные пятна в различных комбинациях для окрашивания различных биомолекул / компонентов клеточных стенок (суберин, лигнин, целлюлоза и хитин в грибковых взаимодействиях). Также можно противодействовать участкам флуоресцентных маркерных линий GFP и тем самым коррелировать промоторную активность или паттерн накопления белка с присутствием патогена в конкретных клетках или областях желчи. Однако фоновая автофлуоресценция от ксилемы и заполненных патогенами гигантских клеток не могла быть устранена даже после протокола очистки. Это представляет собой ограничение для изучения флуоресцентных маркеров на более поздних стадиях образования желчи, особенно при использовании эпифлуоресцентного микроскопа и визуализации слабых сигналов.
Из-за низкого уровня экспрессии/накопления флуоресцентных сигналов факторы транскрипции трудно обнаружить, но с помощью этого метода можно получить удовлетворительные изображения для них. В целом, сочетание вибратомного сечения с подходом очистки тканей расширяет инструментарий для гистологических наблюдений сложных желчных тканей. Гибкость этого протокола облегчает процесс фиксации тканей и сокращает время, необходимое для разрезания и визуализации свежих образцов тканей для наблюдения флуоресцентных белков и промоторной активности. С дальнейшими улучшениями и использованием других флуоресцентных красителей, специфичных для различных биомолекул, этот метод будет означать большие успехи в гистологических исследованиях и анализе изображений плотных, непрозрачных тканей со сложной организацией тканей. В последнее время представленный метод очистки тканей стал популярным и широко используемым протоколом для объединения и обеспечения возможности одновременного получения различных флуоресцентных сигналов 11,12,13. Будущее развитие и модификации таких методов значительно улучшат разрешение изображения для наблюдения за взаимодействиями растений и патогенов на клеточном уровне.
Авторам нечего раскрывать.
Работа была поддержана грантом Национального научного центра Польши OPUS17 No 2019/33/B/NZ9/00751 «Междугородняя сосудистая координация у растений, инфицированных Plasmodiophora brassicae». Мы благодарим профессора Юрьо Хелариутту (Sainsbury Laboratory, Кембриджский университет) за то, что он поделился линией proHCA2::erRFP .
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2N Sulfuric acid (H2SO4) | Roth | UN2796 | pH adjustment |
Agarose | PRONA | BGQT100 | Embedding |
Basic Fuchsin | BIOSHOP | BSF410.5 | Fluorescent dye |
Calcofluor White | Sigma Aldrich | 18909-100ML-F | Fluorescent dye |
Commercial Bleach | Domestos | ||
Cyanoacrylate/ Instant glue | Kropelka | Adhesive | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | BIOSHOP | DMS555.500 | Solvent |
Epifluorescence microscope | Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system | Carl Zeiss M2 | Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used |
Fully automated Vibratome | Leica | VT1200 S | |
Lightmeter /Photometer | LI-COR Biosciences | LI-250A + LI-190R quantum sensor | For measuring light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband |
Masking tape | For sticking agarose block on mould | ||
Murashige & Skoog Medium (MS Medium) | Duchefa Biochemie | MO222.0050 | Plant Growth Medium |
Nile Red | Sigma Aldrich | N3013-100MG | Fluorescent dye |
Paraformaldehyde PFA | Sigma Aldrich | 158127-100G | Fixative |
Potassium Chloride (KCl) | POCH | 739740114 | PBS component |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | P1767-250G | pH adjustment |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | BIOSHOP | PPM302.500 | PBS component |
Sodium chloride (NaCl) | BIOSHOP | SOD001.1 | PBS component |
Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-25G | Clearing Solution |
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O) | POCH | 799490116 | PBS component |
Triton X-100 | BIOSHOP | TRX506.100 | Fixative |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-100G | Clearing Solution |
Vacuum/Pressure pump and Dessicator | Welch by Gardner Denver | 2522C-02 | For Vacuum Infilteration |
Xylitol | Sigma Aldrich | X3375-25G | Clearing Solution (componenet) |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены