滑液分析以识别骨关节炎

摘要

透射、偏振和补偿光学显微镜下的滑液分析用于通过简单的步骤评估样品的炎症或非炎症性质。在骨关节炎中，检测钙晶体和识别更严重的骨关节炎亚群特别有用。

摘要

滑液 （SF） 分析对于诊断骨关节炎 （OA） 很重要。宏观和微观特征，包括总白细胞和分类白细胞 （WBC） 计数，有助于确定 SF 的非炎症性质，这是 OA 的标志。在OA患者中，SF样本中的WBC通常不超过每微升2000个细胞，并且炎症细胞（如中性粒细胞）的百分比非常低或不存在。钙晶体常见于从OA患者收集的SF。尽管它们在OA发病机制中的作用尚不清楚，但它们与轻度炎症过程和更严重的疾病进展有关。最近，钙晶体在OA的早期和晚期都有描述，表明它们可能在诊断OA的不同临床亚群和药物治疗中发挥重要作用。OA中SF分析的总体目标是双重的:确定SF的非炎症程度和突出钙晶体的存在。

引言

骨关节炎 （OA） 是一种复杂的多因素慢性关节疾病，估计 15 岁及以上受试者的全球综合患病率为 16%，40 岁^{及以上受试者}的汇总患病率为 23%。由于人口老龄化和肥胖和代谢综合征等危险因素的增加，OA的发病率预计将^增加2。

与OA相关的主要问题包括在早期阶段诊断疾病的困难，以及目前可用的治疗方法仅限于疼痛管理和症状性慢效药物（SYSADOA），如糖胺聚糖。骨关节炎的诊断基于临床症状和影像学表现。然而，两项评估之间缺乏相关性可能导致OA诊断和治疗开始延迟数^年2。OA的特征是退行性过程和低度炎症，可以通过滑液（SF）分析 轻松 研究。SF是一种富含透明质酸的粘性血浆透析液，可润滑关节空间，为软骨提供营养和氧气，并清除代谢废物。SF还充当减震器，从而在应力和应变期间保护接头³。

SF分析是一种简单可靠的方法，在对有肌肉骨骼症状和关节积液的患者进行初始评估时必须始终进行^3。美国风湿病学会、英国风湿病学会等的建议包括 SF 分析，包括风湿性疾病诊断测试，必须主要在评估急性单关节炎时进行^4，5。从SF分析中获得的总白细胞计数和差异白细胞计数提供了关节中发生的病理过程的快照，从而对炎症程度进行分类。在偏振光下鉴定致病晶体，例如尿酸单钠 （MSU） 和焦磷酸钙 （CPP） 晶体，对于晶体性关节炎（例如痛风和假痛风）的诊断和治疗至关重要。此外，微生物的存在提示化脓性关节炎的诊断。

钙晶体在^OA6患者采集的样本中很常见。据报道，在 OA⁶ 患者的约 22% 和 23% 的 SF 样本中分别存在碱式磷酸钙 （BCP） 晶体和 CPP。虽然它们的作用尚不清楚，但这些晶体与更严重的^OA7 形式有关，并且被认为是病理过程本身的附带现象。在接受膝关节置换术的OA患者的组织样本中100%检测到钙晶体⁸。此外，据推测，钙晶体可能因其炎症作用而参与OA的发病机制，^{几项研究9} 证明了这一点，并且至少部分介导了NLRP3炎症小体¹⁰。

最近，钙晶体在OA的早期和晚期6中都有描述，表明它们可能在^诊断OA 的不同临床亚群和药物治疗中发挥重要作用。

SF分析的总体目标是双重的:确定SF的炎症程度，并通过鉴定特定的晶体或微生物来诊断晶体或化脓性关节炎。它是诊断OA的一种特别有用，简单和可靠的工具，因为典型的非炎症模式，中性粒细胞的百分比非常低或没有。

相对于替代技术的优势
SF分析包括简单的程序，包括总白细胞计数和差异白细胞计数以及晶体搜索。由专业实验室技术人员进行的手动细胞计数^3，11 仍然是滑液和其他体液细胞学分析的黄金标准。然而，由于该方法的时间限制以及观察者之间和观察者内部的可变性，自动细胞计数仪已逐渐取代大型常规临床实验室中的手动计数，其中血液和尿液分析仪已被调整为SF分析^11，12。然而，手动计数在特定环境中具有一些优势:（1）在门诊中，按时获得总和差异WBC值;（2）识别自动计数器无法识别的细胞类型，例如噬细胞单核（Reiter）细胞或滑膜细胞等非造血细胞;（3）当样品太小而无法用仪器处理时;（4） 建立易于用于研究目的的本地实验室登记册。手动计数的另一个优点是活体上染色，这种方法可以在载玻片制备后立即非常快速地分化细胞。相比之下，传统的染色，如Wright和May-Grünwald-Giimsa程序，需要风干的SF涂片和时间来染色细胞¹³。虽然不适合时间敏感的常规分析，但这些染色方法揭示了样品中更详细的细胞群，包括红细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、多形核白细胞、淋巴细胞和血小板。

最后，使用基于偏振光显微镜的简单技术对晶体进行常规SF分析，该技术可提供快速结果¹⁴。替代方法，如扫描和电子显微镜，产生更准确和灵敏的结果，但由于成本高且耗时的样品制备和分析，它们在日常临床实践中的使用是不可行的。

研究方案

本协议符合帕多瓦大学医院伦理委员会的指导方针。SF是在患者同意下从接受治疗性关节穿刺术的患者的膝关节中收集的，以便在他们首次到诊所就诊时或对关节炎发作做出反应。该手术的禁忌症是:凝血功能障碍，抗凝药物，皮肤病变，皮炎或关节上的蜂窝织炎。所有SF样品均已去识别化。

1.滑液准备

1. 将肿胀关节¹⁵ 关节穿刺术期间收集的SF样品转移到含有抗凝剂（最好是EDTA;参见 材料表）的管中，并转移到不含添加剂的第二管中（图1）。
2. 在疑似感染病例中，无菌将部分SF样品（~1mL）转移到培养瓶中进行微生物检测。
   注意:由于临床特征（严重肿瘤，多洛尔，卡路里，功能laesa，有时发热）和SF的宏观外观（浑浊，颜色），可以怀疑感染。在这种情况下，医生开出微生物分析，由微生物实验室进行。
3. 收集样品后立即进行SF分析（步骤2-5）。

2. 宏观检查

注意:SF样品的宏观评估包括主观，定性和半定量评估。没有参考标准秤，也没有使用对照样品。

1. 注释以毫升表示的SF体积。定义样本的颜色，范围可以从浅黄色到深黄色。记录血液的存在。
2. 通过观察背光中的样品并确定通过流体管读取打印页面的难易程度来定义清晰度（图2A）。
3. 通过从一次性移液器滴下样品来评估粘度。长串或液滴形成分别表示粘度良好或较差（图2B）。
4. 通过观察试管和背光中的样品，评估颗粒材料（包括组织碎片或纤维蛋白）的存在。

3. 显微镜检查

注意:SF显微镜分析包括细胞学检查，包括总和分类白细胞（WBC）计数以及寻找晶体。

1. 按照以下步骤确定总细胞计数。
   1. 使用血细胞计数器确定EDTA管中收集的SF中白细胞的总数（参见 材料表）。
   2. 使用 Malassez-Potain 移液管从 EDTA 管中吸取 0.5 μL SF（标记 0.5;参见 材料表）（补充图 1）。使用相同的移液器，吸取 9.5 μL 0.1% 亚甲蓝溶液（标记 11）。最终稀释度为20倍。
   3. 通过轻轻倒置混合移液器，丢弃第一滴，然后将滑液+亚甲蓝溶液倒入计数室中。
   4. 从九个中计算两个连续正方形中的单元格，然后将获得的数字乘以 100（简化公式; 补充图2）。将白细胞表示为每立方毫米的白细胞数量。
      注意:简化公式:白细胞（N /^{mm 3}）=两个连续平方中的计数细胞数x 100。
   5. 根据先前发表的报告^{16，17，根据} WBC的总数对SF进行分类（表1）。
2. 执行差异细胞计数。
   1. 使用活体上或传统染色确定多形核 （PMN） 细胞、单核细胞和淋巴细胞的百分比^13，18。
   2. 对于活体上染色，将一小滴SF放在预涂有甲酚紫和亚甲蓝的即用型载玻片的中心（补充图3;见 材料表）。
   3. 盖上盖玻片，并放置一滴显微镜浸油。
   4. 准备风干的SF涂片用于传统染色（不太适合常规分析）。在干净的幻灯片末端放一小滴SF。使用第二张载玻片或盖玻片，沿载玻片向前移动。让涂抹物风干。
   5. 根据标准的May-Grünwald-Giimsa程序对样品进行染色¹⁸。
   6. 检查油浸物镜（1，000x）下的滑块。
   7. 计数100个连续细胞并区分多形核细胞，单核细胞和淋巴细胞（图3， 补充图4）。
   8. 以百分比表示每个类别中的总数。
      注意:为了获得准确的结果，必须在收集SF后立即或在正确储存（4°C）的关节穿刺术后24-48小时内进行细胞学检查。

4. 晶体检测

1. 使用配备有附加偏振滤光片和红色补偿器¹⁹ 的偏振光显微镜确定病理晶体的存在（参见 材料表）。
2. 进行玻片制备以进行晶体检测。
   1. 用光学纸或吸收乙醇的软纸仔细清洁载玻片。在载玻片上滴一小滴SF。
   2. 盖上盖玻片并将载玻片放在显微镜下。
3. 识别晶体。
   1. 使用低倍放大镜将载玻片聚焦在显微镜下。用40倍物镜在明场下仔细检查载玻片。查看细胞内外。
   2. 根据晶体的大小和形状（例如菱形、针状、杆状）识别晶体。
   3. 在光源和标本之间插入偏振滤光片。旋转偏振片，直到其光轴垂直于分析仪（放置在物镜上方）以创建深色背景。
   4. 一旦确定了双折射晶体，将补偿器插入偏振器和试样之间，并将其平行或垂直于晶体的光轴移动。
   5. 观察晶体显示的颜色（表2）。
      注意:MSU晶体在暗场中呈针状，明亮的双折射，当它们的轴平行于补偿器时显示黄色/橙色。相反，当垂直放置时，它们是蓝色的（负号）（表2; 图4）。CPP晶体是棒状或菱形晶体，在偏振光下弱双折射，当它们分别平行或垂直于补偿器轴线（正号）对齐时显示蓝色或黄色（表2; 图5）。

5.茜素红染色

1. 制备2%的茜素红S（pH 4.1-4.3）溶液，通过0.22μm过滤器过滤溶液，并避光保存。
   1. 为了准备载玻片，在干净的载玻片上将一滴SF与相同体积的茜素红溶液（1:1）混合。盖上盖玻片，以400倍放大倍率检查。
   2. 在显微镜下识别晶体。
      注意:当在透射光下可见明亮的深红色沉淀物时，测试呈阳性，呈圆形和同心层。在偏振光下，它们出现强烈的双折射²⁰（图6）。

结果

受OA影响的大关节经常肿胀并产生大量的SF，这些SF通过关节穿刺术 引 流¹⁵。关节穿刺术后立即评估的SF的宏观特征主要包括数量，颜色，清晰度和粘度¹⁷。尽管它们的特异性低，但它们提供了关于炎症程度的初步数据。颜色取决于SF细胞和细胞外基质大分子的碎裂程度。从OA患者收集的SF为淡黄色，这种阴影通常与非炎症样本有关，而深黄色与炎性积液有?...

讨论

在OA中，SF分析通过简单的步骤帮助确定疾病特征:白细胞总数和差异白细胞计数以及搜索晶体，包括CPP和BCP。此外，MSU 晶体的检测可能突出重要的合并症。

尽管成本低且执行简单，但由于分析师经验不足，测试的敏感性和结果的可靠性可能会受到影响 - 主要是因为它与晶体鉴定有关。分析师的培训和经验对于区分CPP和MSU晶体的形状和双折射以及将其形状与其双折射程度相匹?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin red S	Merck	A5533	For BCP crystal search
Burker chamber	Merck	BR718905	For total white blood cell count
Cover glasses	Merck	C7931	For microscopic examination
EDTA tubes	BD	368861	For SF collection
Glass slides	Merck	S8902	For crystal search
Lambda filter (compensator)	Any	Refer to microscope company	For crystal identification
Malassez-Potain pipette	Artiglass	54830000	For dilution of synovial fluid
Methylene blue solution	Merck	3978	For total white blood cell count
Polarized microscope	Leica, Nikon, others	Depending on the model and company	For complete synovial fluid analysis
Polarizing lens	Any	Refer to microscope company	For crystal identification
Testsimplet	Waldeck	14386	Supravital staining for cell differentiation