Analisi del liquido sinoviale per identificare l'osteoartrite

Riepilogo

L'analisi del liquido sinoviale al microscopio a luce trasmessa, polarizzata e compensata viene utilizzata per valutare la natura infiammatoria o non infiammatoria di un campione attraverso semplici passaggi. È particolarmente utile nell'osteoartrite per rilevare cristalli di calcio e identificare un sottogruppo più grave di osteoartrite.

Abstract

L'analisi del liquido sinoviale (SF) è importante nella diagnosi dell'osteoartrite (OA). Le caratteristiche macroscopiche e microscopiche, tra cui la conta totale e differenziale dei globuli bianchi (WBC), aiutano a definire la natura non infiammatoria della SF, che è un segno distintivo dell'OA. Nei pazienti con OA, il WBC nei campioni di SF di solito non supera le 2000 cellule per microlitro e la percentuale di cellule infiammatorie, come i neutrofili, è molto bassa o assente. I cristalli di calcio sono frequenti nella SF raccolta da pazienti con OA. Sebbene il loro ruolo nella patogenesi dell'OA rimanga poco chiaro, sono stati associati a un lieve processo infiammatorio e a una progressione della malattia più grave. Recentemente, i cristalli di calcio sono stati descritti sia nelle fasi iniziali che in quelle finali dell'OA, indicando che possono svolgere un ruolo vitale nella diagnosi di diversi sottogruppi clinici di OA e trattamento farmacologico. L'obiettivo generale dell'analisi della SF nell'OA è duplice: accertare il grado non infiammatorio di SF ed evidenziare la presenza di cristalli di calcio.

Introduzione

L'osteoartrite (OA) è una malattia articolare cronica complessa e multifattoriale, con una prevalenza globale aggregata stimata del 16% nei soggetti di età pari o superiore a 15 anni e del 23% nei soggetti di età pari o superiore a 40 anni¹. Si prevede che l'incidenza di OA aumenterà a causa dell'invecchiamento della popolazione e di un aumento dei fattori di rischio, come l'obesità e la sindrome metabolica².

Tra i principali problemi associati all'OA vi sono la difficoltà di diagnosticare la malattia nelle sue fasi iniziali e i trattamenti attualmente disponibili limitati alla gestione del dolore e ai farmaci sintomatici ad azione lenta (SYSADOA) come i glicosaminoglicani. La diagnosi di OA si basa sui sintomi clinici e sui risultati di imaging. Tuttavia, la mancanza di correlazione tra le due valutazioni può causare anni di ritardo nella diagnosi di OA e nell'inizio del trattamento². L'OA è caratterizzata da processi degenerativi e infiammazione di basso grado, che possono essere facilmente studiati tramite l'analisi del liquido sinoviale (SF). SF è un dializzato plasmatico viscoso ricco di acido ialuronico, che lubrifica lo spazio articolare, fornisce nutrienti e ossigeno alla cartilagine e rimuove le scorie metaboliche. SF agisce anche come ammortizzatore, proteggendo così le articolazioni durante lo stress e lo sforzo³.

L'analisi SF è un metodo semplice e affidabile che deve essere sempre eseguito durante la valutazione iniziale di pazienti con sintomi muscoloscheletrici e versamenti articolari³. Le raccomandazioni dell'American College of Rheumatology, della British Society for Rheumatology e di altri includono l'analisi SF tra i test diagnostici per le malattie reumatiche che devono essere intrapresi principalmente nella valutazione della monoartrite acuta ^4,5. La conta totale e differenziale dei leucociti ottenuta dall'analisi SF fornisce un'istantanea del processo patologico che si verifica nell'articolazione, classificando così il grado di infiammazione. L'identificazione di cristalli patogeni, come i cristalli di urato monosodico (MSU) e pirofosfato di calcio (CPP), sotto luce polarizzata, è vitale nella diagnosi e nel trattamento dell'artrite cristallina (ad esempio, gotta e pseudogotta). Inoltre, la presenza di microrganismi suggerisce una diagnosi di artrite settica.

I cristalli di calcio sono frequenti nei campioni raccolti da pazienti con OA⁶. Cristalli basici di fosfato di calcio (BCP) e CPP sono stati riportati in circa il 22% e il 23% dei campioni di SF, rispettivamente, da pazienti con OA⁶. Sebbene il loro ruolo rimanga poco chiaro, questi cristalli sono stati associati a forme più gravi di OA⁷ e sono considerati un epifenomeno del processo patologico stesso. I cristalli di calcio sono stati rilevati nel 100% dei campioni di tessuto di pazienti con OA sottoposti a sostituzione del ginocchio⁸. Inoltre, è stato ipotizzato che i cristalli di calcio possano essere coinvolti nella patogenesi dell'OA a causa dei loro effetti infiammatori, dimostrati da diversi studi⁹ e mediati, almeno in parte, dall'inflammasoma NLRP3¹⁰.

Più recentemente, i cristalli di calcio sono stati descritti sia nella fase iniziale che in quella tardiva⁶ dell'OA, indicando che possono svolgere un ruolo vitale nella diagnosi di diversi sottogruppi clinici di OA e trattamento farmacologico.

L'obiettivo generale dell'analisi della SF è duplice: determinare il grado infiammatorio di SF e diagnosticare l'artrite cristallina o settica identificando cristalli o microrganismi specifici. Si tratta di uno strumento particolarmente utile, semplice e affidabile nella diagnosi di OA, grazie al tipico pattern non infiammatorio con una percentuale molto bassa o assenza di neutrofili.

Vantaggi rispetto alle tecniche alternative
L'analisi SF consiste in semplici procedure che includono la conta totale e differenziale dei leucociti e la ricerca dei cristalli. Il conteggio manuale delle cellule eseguito da tecnici di laboratorio esperti ^3,11 rimane il gold standard per l'analisi citologica dei fluidi sinoviali e di altri fluidi corporei. Tuttavia, a causa della limitazione temporale e della variabilità inter- e intra-osservatore di questo metodo, i contatori cellulari automatizzati hanno gradualmente sostituito il conteggio manuale nei grandi laboratori clinici di routine in cui gli analizzatori di sangue e urina sono stati adattati per consentire l'analisi SF^11,12. Tuttavia, il conteggio manuale presenta alcuni vantaggi in contesti specifici: (1) in ambulatorio, per ottenere un valore totale e differenziale di WBC in tempo; (2) identificare tipi cellulari come le cellule mononucleate citofagocitiche (Reiter) o cellule non ematopoietiche come i sinoviociti, che i contatori automatici non possono riconoscere; 3) quando il campione è troppo piccolo per essere manipolato dallo strumento; (4) creare registri di laboratorio locali facilmente accessibili a fini di ricerca. Un altro vantaggio del conteggio manuale è visto colorazione insupravitale, un metodo che consente la differenziazione delle cellule molto rapidamente e immediatamente dopo la preparazione del vetrino. Al contrario, le colorazioni tradizionali, come le procedure di Wright e May-Grünwald-Giemsa, richiedono strisci di SF essiccati all'aria e tempo per macchiare le cellule¹³. Sebbene non adatti per analisi di routine sensibili al tempo, questi metodi di colorazione rivelano popolazioni cellulari più dettagliate nel campione, inclusi eritrociti, basofili, eosinofili, leucociti polimorfonucleati, linfociti e piastrine.

Infine, l'analisi SF di routine per i cristalli viene eseguita utilizzando una semplice tecnica basata sulla microscopia a luce polarizzata, che fornisce risultati rapidi¹⁴. Metodi alternativi, come la scansione e la microscopia elettronica, producono risultati più accurati e sensibili, ma il loro uso nella pratica clinica quotidiana non è fattibile a causa dei costi elevati e della lunga preparazione e analisi dei campioni.

Protocollo

Il presente protocollo è conforme alle linee guida del comitato etico dell'Azienda Ospedaliero-Universitaria di Padova. La SF è stata raccolta con il consenso del paziente dalle articolazioni del ginocchio dei pazienti sottoposti a artrocentesi terapeutica per versamento articolare alla loro presentazione iniziale alla clinica o in risposta a una riacutizzazione artritica. Le controindicazioni alla procedura erano: coagulopatia, farmaci anticoagulanti, lesioni cutanee, dermatiti o cellulite sovrastante l'articolazione. Tutti i campioni di SF sono stati deidentificati.

1. Preparazione del liquido sinoviale

1. Trasferire i campioni di SF raccolti durante l'artrocentesi delle articolazioni gonfie¹⁵ in una provetta contenente anticoagulante (preferibilmente EDTA; vedi Tabella dei materiali) e in una seconda provetta che non contiene additivi (Figura 1).
2. Nei casi sospetti di infezione, trasferire asetticamente una porzione del campione di SF (~ 1 ml) in flaconi di coltura per test microbiologici.
   NOTA: L'infezione può essere sospettata a causa sia dei segni clinici (tumore grave, dolor, calor, functio laesa, e talvolta febbre) che dell'aspetto macroscopico della SF (torbidità, colore). In questo caso, il medico prescrive un'analisi microbiologica, che viene eseguita da un laboratorio di microbiologia.
3. Effettuare l'analisi SF (fasi 2-5) non appena il campione viene raccolto.

2. Esame macroscopico

NOTA: La valutazione macroscopica dei campioni di SF consiste in valutazioni soggettive, qualitative e semiquantitative. Non esistono scale standard di riferimento e non vengono utilizzati campioni di controllo.

1. Annotare il volume SF espresso in millilitri. Definire il colore del campione, che può variare dal giallo pallido al giallo scuro. Registra la presenza di sangue.
2. Definire il grado di chiarezza osservando il campione in controluce e determinando la facilità di lettura di una pagina stampata attraverso il tubo fluido (Figura 2A).
3. Valutare la viscosità gocciolando il campione da una pipetta usa e getta. Una lunga formazione di stringhe o gocce indica rispettivamente una viscosità buona o scarsa (Figura 2B).
4. Valutare la presenza di materiali particolati, inclusi frammenti di tessuto o fibrina, osservando il campione attraverso il tubo e nella retroilluminazione.

3. Esame microscopico

NOTA: L'analisi microscopica SF consiste nell'esame citologico, compresa la conta totale e differenziale dei globuli bianchi (WBC) e la ricerca di cristalli.

1. Determinare il numero totale di celle seguendo i passaggi seguenti.
   1. Determinare il numero totale di leucociti nel SF raccolti nel tubo EDTA utilizzando un emocitometro (vedere Tabella dei materiali).
   2. Prelevare 0,5 μL di SF dalla provetta EDTA utilizzando una pipetta Malassez-Potain (segno 0,5; vedi Tabella dei materiali) (figura supplementare 1). Con la stessa pipetta, aspirare 9,5 μL di soluzione di blu di metilene allo 0,1% (punto 11). La diluizione finale è di 20 volte.
   3. Mescolare la pipetta mediante inversione delicata, eliminare le prime gocce e versare il liquido sinoviale + soluzione di blu di metilene nella camera di conteggio.
   4. Contare le celle in due quadrati consecutivi su nove e moltiplicare il numero ottenuto per 100 (formula semplificata; Figura supplementare 2). Esprimere i globuli bianchi come numero di leucociti per millimetro cubo.
      NOTA: Formula semplificata: Leucociti (N/mm³) = il numero di cellule contate in due quadrati consecutivi x 100.
   5. Classificare i SF in base al numero totale di WBC a seguito di rapporti precedentemente pubblicati^16,17 (Tabella 1).
2. Eseguire il conteggio differenziale delle cellule.
   1. Determinare la percentuale di cellule polimorfonucleate (PMN), monociti e linfociti utilizzando la colorazione sopravitale o tradizionale^13,18.
   2. Per la colorazione sopravitale, posizionare una piccola goccia di SF al centro di un vetrino pronto all'uso preverniciato con viola cresilico e blu di metilene (Figura supplementare 3; vedi Tabella dei materiali).
   3. Coprire con un coprivetrino e posizionare una goccia di olio per immersione al microscopio.
   4. Preparare uno striscio SF essiccato all'aria per la colorazione tradizionale (meno adatto per le analisi di routine). Metti una piccola goccia di SF alla fine di una diapositiva pulita. Utilizzando una seconda diapositiva o una copertina, distribuiscila lungo la diapositiva con un movimento in avanti. Lasciare asciugare lo striscio all'aria.
   5. Colorare il campione secondo una procedura standard di May-Grünwald-Giemsa¹⁸.
   6. Esaminare il vetrino sotto l'obiettivo di immersione in olio (1.000x).
   7. Contare 100 cellule consecutive e distinguere tra cellule polimorfonucleate, monociti e linfociti (Figura 3, Figura supplementare 4).
   8. Esprimere il numero totale di ogni categoria in percentuale.
      NOTA: Per ottenere risultati accurati, gli esami citologici devono essere eseguiti non appena il SF viene raccolto o entro 24-48 h dall'artrocentesi se correttamente conservato (4 °C).

4. Rilevamento dei cristalli

1. Determinare la presenza di cristalli patologici utilizzando un microscopio a luce polarizzata dotato di un filtro polarizzatore aggiuntivo e di un compensatore rosso¹⁹ (vedere Tabella dei materiali).
2. Eseguire la preparazione dei vetrini per il rilevamento dei cristalli.
   1. Pulire accuratamente un vetrino con carta ottica o carta morbida imbevuta di etanolo. Applicare una piccola goccia di SF sul vetrino.
   2. Coprire con un coprivetrino e posizionare il vetrino sotto il microscopio.
3. Identifica i cristalli.
   1. Focalizzare il vetrino sotto il microscopio utilizzando un obiettivo di ingrandimento a bassa potenza. Esaminare attentamente la diapositiva sotto un campo luminoso con un obiettivo 40x. Guarda dentro e fuori le celle.
   2. Identificare i cristalli in base alle loro dimensioni e forma (ad esempio, romboidale, aghiforme, a forma di bastoncello).
   3. Inserire il filtro polarizzatore tra la sorgente luminosa e il campione. Ruotare il polarizzatore fino a quando il suo asse ottico è perpendicolare all'analizzatore (posizionato sopra gli obiettivi) per creare uno sfondo scuro.
   4. Una volta identificato un cristallo birifrangente, inserire il compensatore tra il polarizzatore e il campione e spostarlo parallelamente o perpendicolarmente all'asse ottico del cristallo.
   5. Osservare il colore rivelato dal cristallo (Tabella 2).
      NOTA: i cristalli MSU appaiono aghiformi, brillantemente birifrangenti nel campo scuro e mostrano un colore giallo/arancione quando il loro asse è parallelo al compensatore. Al contrario, sono blu se posizionati perpendicolarmente (segno negativo) (Tabella 2; Figura 4). I cristalli CPP sono cristalli simili a bastoncelli o romboidi, debolmente birifrangenti sotto luce polarizzata, e mostrano un colore blu o giallo quando sono allineati parallelamente o perpendicolarmente all'asse del compensatore (segno positivo), rispettivamente (Tabella 2; Figura 5).

5. Colorazione rosso alizarina

1. Preparare una soluzione al 2% di alizarina rossa S (pH 4,1-4,3), filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm e conservarla lontano dalla luce.
   1. Per preparare il vetrino, mescolare una goccia di SF con lo stesso volume di soluzione di rosso alizarina (1:1) su un vetrino pulito. Coprire con un coprivetrino ed esaminare con un ingrandimento di 400x.
   2. Identificare i cristalli al microscopio.
      NOTA: Il test è positivo quando precipitati rossi brillanti e scuri sono visibili sotto luce trasmessa, con una forma rotonda e strati concentrici. Sotto luce polarizzata, appaiono fortemente birifrangenti²⁰ (Figura 6).

Risultati

Le grandi articolazioni colpite da OA sono spesso gonfie e producono quantità significative di SF, che vengono drenate tramite artrocentesi¹⁵. Le caratteristiche macroscopiche della SF valutate immediatamente dopo l'artrocentesi includono essenzialmente la quantità, il colore, la chiarezza e la viscosità¹⁷. Nonostante la loro bassa specificità, forniscono dati preliminari sul grado di infiammazione. Il colore dipende dalla cellularità della SF e dal grado di f...

Discussione

Nell'OA, l'analisi della SF aiuta a definire le caratteristiche della malattia attraverso semplici passaggi: conta leucocitaria totale e differenziale e ricerca di cristalli, inclusi CPP e BCP. Inoltre, la rilevazione di cristalli MSU può evidenziare importanti comorbidità.

Nonostante i bassi costi e la semplicità di esecuzione, la sensibilità dei test e l'affidabilità dei risultati possono essere influenzate da analisti inesperti, principalmente per quanto riguarda l'identificazione dei ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin red S	Merck	A5533	For BCP crystal search
Burker chamber	Merck	BR718905	For total white blood cell count
Cover glasses	Merck	C7931	For microscopic examination
EDTA tubes	BD	368861	For SF collection
Glass slides	Merck	S8902	For crystal search
Lambda filter (compensator)	Any	Refer to microscope company	For crystal identification
Malassez-Potain pipette	Artiglass	54830000	For dilution of synovial fluid
Methylene blue solution	Merck	3978	For total white blood cell count
Polarized microscope	Leica, Nikon, others	Depending on the model and company	For complete synovial fluid analysis
Polarizing lens	Any	Refer to microscope company	For crystal identification
Testsimplet	Waldeck	14386	Supravital staining for cell differentiation