Analyse du liquide synovial pour identifier l’arthrose

Résumé

L’analyse du liquide synovial sous microscopie optique transmise, polarisée et compensée est utilisée pour évaluer la nature inflammatoire ou non inflammatoire d’un échantillon par des étapes simples. Il est particulièrement utile dans l’arthrose pour détecter les cristaux de calcium et identifier un sous-ensemble plus grave de l’arthrose.

Résumé

L’analyse du liquide synovial (SF) est importante dans le diagnostic de l’arthrose. Les caractéristiques macroscopiques et microscopiques, y compris le nombre total et différentiel de globules blancs (GB), aident à définir la nature non inflammatoire de la SF, qui est une caractéristique de l’arthrose. Chez les patients atteints d’arthrose, les globules blancs dans les échantillons de SF ne dépassent généralement pas 2000 cellules par microlitre, et le pourcentage de cellules inflammatoires, telles que les neutrophiles, est très faible ou absent. Les cristaux de calcium sont fréquents dans les SF prélevés chez les patients atteints d’arthrose. Bien que leur rôle dans la pathogenèse de l’arthrose reste incertain, ils ont été associés à un processus inflammatoire léger et à une progression plus sévère de la maladie. Récemment, des cristaux de calcium ont été décrits aux stades précoce et avancé de l’arthrose, ce qui indique qu’ils peuvent jouer un rôle essentiel dans le diagnostic de différents sous-ensembles cliniques de l’arthrose et du traitement pharmacologique. L’objectif global de l’analyse du SF dans l’arthrose est double: déterminer le degré non inflammatoire de SF et mettre en évidence la présence de cristaux de calcium.

Introduction

L’arthrose est une maladie articulaire chronique complexe et multifactorielle, avec une prévalence mondiale combinée estimée à 16% chez les sujets âgés de 15 ans et plus, et à 23% chez les sujets âgés de 40 ans et plus¹. L’incidence de l’arthrose devrait augmenter en raison du vieillissement de la population et de l’augmentation des facteurs de risque, comme l’obésité et le syndrome métabolique².

Parmi les principaux problèmes associés à l’arthrose figurent la difficulté à diagnostiquer la maladie à ses débuts et les traitements actuellement disponibles limités à la gestion de la douleur et aux médicaments symptomatiques à action lente (SYSADOA) tels que les glycosaminoglycanes. Le diagnostic de l’arthrose est basé sur les symptômes cliniques et les résultats d’imagerie. Cependant, l’absence de corrélation entre les deux évaluations peut entraîner des années de retard dans le diagnostic de l’arthrose et l’initiation du traitement². L’arthrose est caractérisée par des processus dégénératifs et une inflammation de bas grade, qui peuvent être facilement étudiées par analyse du liquide synovial (SF). SF est un dialysat plasmatique visqueux riche en acide hyaluronique, qui lubrifie l’espace articulaire, fournit des nutriments et de l’oxygène au cartilage et élimine les déchets métaboliques. Le SF agit également comme un amortisseur, protégeant ainsi les articulations pendant les contraintes et les contraintes³.

L’analyse SF est une méthode simple et fiable qui doit toujours être effectuée lors de l’évaluation initiale des patients présentant des symptômes musculo-squelettiques et des épanchements articulaires³. Les recommandations de l’American College of Rheumatology, de la British Society for Rheumatology et d’autres incluent l’analyse SF parmi les tests diagnostiques des maladies rhumatismales qui doivent être entrepris principalement pour évaluer la monoarthrite aiguë ^4,5. Les numérations leucocytaires totales et différentielles obtenues à partir de l’analyse SF fournissent un instantané du processus pathologique se produisant dans l’articulation, classant ainsi le degré d’inflammation. L’identification des cristaux pathogènes, tels que les cristaux d’urate monosodique (MSU) et de pyrophosphate de calcium (CPP), sous lumière polarisée, est essentielle au diagnostic et au traitement de l’arthrite cristalline (par exemple, la goutte et la pseudogoutte). De plus, la présence de micro-organismes suggère un diagnostic d’arthrite septique.

Les cristaux de calcium sont fréquents dans les échantillons prélevés chez les patients atteints d’arthrose⁶. Des cristaux de phosphate de calcium basique (BCP) et du CPP ont été rapportés dans environ 22 % et 23 % des échantillons de SF, respectivement, de patients atteints d’arthrose⁶. Bien que leur rôle reste incertain, ces cristaux ont été associés à des formes plus sévères d’OA⁷ et sont considérés comme un épiphénomène du processus pathologique lui-même. Des cristaux de calcium ont été détectés dans 100 % des échantillons de tissus de patients atteints d’arthrose subissant une arthroplastie^{du genou 8}. En outre, il a été émis l’hypothèse que les cristaux de calcium peuvent être impliqués dans la pathogenèse de l’arthrose en raison de leurs effets inflammatoires, démontrés par plusieurs études⁹ et médiés, au moins en partie, par l’inflammasome NLRP3¹⁰.

Plus récemment, des cristaux de calcium ont été décrits^{aux stades} 6 précoces et avancés de l’arthrose, ce qui indique qu’ils peuvent jouer un rôle essentiel dans le diagnostic de différents sous-ensembles cliniques de l’arthrose et du traitement pharmacologique.

L’objectif global de l’analyse SF est double: déterminer le degré inflammatoire de SF et diagnostiquer l’arthrite cristalline ou septique en identifiant des cristaux ou des micro-organismes spécifiques. C’est un outil particulièrement utile, simple et fiable dans le diagnostic de l’arthrose, en raison du schéma non inflammatoire typique avec un pourcentage très faible ou l’absence de neutrophiles.

Avantages par rapport aux techniques alternatives
L’analyse SF consiste en des procédures simples qui incluent le nombre total et différentiel de leucocytes et la recherche de cristaux. Le comptage cellulaire manuel effectué par des techniciens de laboratoire experts ^3,11 demeure l’étalon-or pour l’analyse cytologique des fluides synoviaux et autres fluides corporels. Cependant, en raison de la limitation du temps et de la variabilité inter- et intra-observateur de cette méthode, les compteurs cellulaires automatisés ont progressivement remplacé le comptage manuel dans les grands laboratoires cliniques de routine où les analyseurs de sang et d’urine ont été adaptés pour permettre l’analyse SF^11,12. Néanmoins, le comptage manuel présente certains avantages dans des contextes spécifiques: (1) dans le ambulatoire, pour obtenir une valeur WBC totale et différentielle dans le temps; (2) identifier des types cellulaires tels que les cellules mononucléées cytophagocytaires (Reiter) ou les cellules non hématopoïétiques telles que les synoviocytes, que les compteurs automatisés ne peuvent pas reconnaître; 3° lorsque l’échantillon est trop petit pour être manipulé par l’instrument; (4) créer des registres de laboratoires locaux facilement accessibles à des fins de recherche. Un autre avantage du comptage manuel est la coloration insupravitale, une méthode qui permet la différenciation des cellules très rapidement et immédiatement après la préparation de la lame de verre. En revanche, les colorations traditionnelles, telles que les procédures Wright et May-Grünwald-Giemsa, nécessitent des frottis de SF séchés à l’air et du temps pour colorer les cellules¹³. Bien qu’elles ne conviennent pas aux analyses de routine sensibles au facteur temps, ces méthodes de coloration révèlent des populations cellulaires plus détaillées dans l’échantillon, notamment des érythrocytes, des basophiles, des éosinophiles, des leucocytes polymorphonucléaires, des lymphocytes et des plaquettes.

Enfin, l’analyse SF de routine pour les cristaux est réalisée à l’aide d’une technique simple basée sur la microscopie à lumière polarisée, qui donne des résultats rapides¹⁴. Les méthodes alternatives, telles que le balayage et la microscopie électronique, donnent des résultats plus précis et plus sensibles, mais leur utilisation dans la pratique clinique quotidienne n’est pas réalisable en raison des coûts élevés et de la préparation et de l’analyse des échantillons qui prennent beaucoup de temps.

Protocole

Le présent protocole est conforme aux directives du comité d’éthique de l’hôpital universitaire de Padoue. Le SF a été recueilli avec le consentement du patient sur les articulations du genou des patients recevant une arthrocentèse thérapeutique pour épanchement articulaire lors de leur présentation initiale à la clinique ou en réponse à une poussée arthritique. Les contre-indications à la procédure étaient: coagulopathie, médicaments anticoagulants, lésions cutanées, dermatite ou cellulite recouvrant l’articulation. Tous les échantillons de SF ont été dépersonnalisés.

1. Préparation du liquide synovial

1. Transfère les échantillons de SF prélevés lors de l’arthrocentèse des articulations enflées¹⁵ dans un tube contenant un anticoagulant (de préférence EDTA; voir le tableau des matériaux) et dans un deuxième tube ne contenant aucun additif (figure 1).
2. En cas soupçonné d’infection, transférer de façon aseptique une partie de l’échantillon de SF (~ 1 mL) dans des flacons de culture pour des tests microbiologiques.
   REMARQUE: L’infection peut être suspectée à la fois en raison de caractéristiques cliniques (tumeur sévère, dolor, calor, fonctio laesa et parfois fièvre) et de l’aspect macroscopique du SF (turbidité, couleur). Dans ce cas, le médecin prescrit une analyse microbiologique, qui est effectuée par un laboratoire de microbiologie.
3. Effectuer l’analyse SF (étapes 2 à 5) dès que l’échantillon est prélevé.

2. Examen macroscopique

NOTE : L’évaluation macroscopique des échantillons de FS consiste en des évaluations subjectives, qualitatives et semi-quantitatives. Il n’y a pas d’échelle étalon de référence et aucun échantillon témoin n’est utilisé.

1. Annoter le volume SF exprimé en millilitres. Définissez la couleur de l’échantillon, qui peut aller du jaune pâle au jaune foncé. Notez la présence de sang.
2. Définissez le degré de clarté en observant l’échantillon dans le rétroéclairage et en déterminant la facilité de lecture d’une page imprimée à travers le tube de fluide (Figure 2A).
3. Évaluer la viscosité en égoutteant l’échantillon à partir d’une pipette jetable. Une longue ficelle ou une formation de goutte indique une bonne ou une mauvaise viscosité, respectivement (Figure 2B).
4. Évaluer la présence de matières particulaires, y compris des fragments de tissu ou de la fibrine, en observant l’échantillon à travers le tube et dans le rétroéclairage.

3. Examen microscopique

NOTE: L’analyse microscopique SF consiste en un examen cytologique, y compris le nombre total et différentiel de globules blancs (GB) et la recherche de cristaux.

1. Déterminez le nombre total de cellules en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Déterminer le nombre total de leucocytes dans le SF prélevés dans le tube EDTA à l’aide d’un hémocytomètre (voir le tableau des matériaux).
   2. Prélever 0,5 μL de SF du tube EDTA à l’aide d’une pipette Malassez-Potain (marque 0,5; voir le tableau des matériaux) (figure supplémentaire 1). Avec la même pipette, prélever 9,5 μL de solution de bleu de méthylène à 0,1 % (marque 11). La dilution finale est de 20 fois.
   3. Mélanger la pipette par inversion douce, jeter les premières gouttes et verser le liquide synovial + solution de bleu de méthylène dans la chambre de comptage.
   4. Comptez les cellules dans deux carrés consécutifs sur neuf, et multipliez le nombre obtenu par 100 (formule simplifiée; Figure supplémentaire 2). Exprimez les globules blancs en nombre de leucocytes par millimètre cube.
      NOTE: Formule simplifiée: Leucocytes (N/mm³) = le nombre de cellules comptées dans deux carrés consécutifs x 100.
   5. Classer le FS en fonction du nombre total de WBC suite aux rapports publiés précédemment^16,17 (tableau 1).
2. Effectuer le comptage différentiel des cellules.
   1. Déterminer le pourcentage de cellules polymorphonucléaires (PMN), de monocytes et de lymphocytes en utilisant une coloration supravitale ou traditionnelle^13,18.
   2. Pour la coloration supravitale, placer une petite goutte de SF au centre d’une lame prête à l’emploi pré-enduite de violet de crésyl et de bleu de méthylène (figure supplémentaire 3; voir le tableau des matériaux).
   3. Couvrir avec un couvercle et placer une goutte d’huile d’immersion au microscope.
   4. Préparez un frottis SF séché à l’air pour la coloration traditionnelle (moins approprié pour l’analyse de routine). Mettez une petite goutte de SF à la fin d’une diapositive propre. À l’aide d’une deuxième diapositive ou d’une lame, étalez-la le long de la glissière avec un mouvement vers l’avant. Laissez le frottis sécher à l’air.
   5. Colorer l’échantillon selon une procédure standard May-Grünwald-Giemsa¹⁸.
   6. Examinez la diapositive sous l’objectif d’immersion dans l’huile (1 000x).
   7. Comptez 100 cellules consécutives et faites la distinction entre les cellules polymorphonucléaires, les monocytes et les lymphocytes (Figure 3, Figure supplémentaire 4).
   8. Exprimez le nombre total dans chaque catégorie en pourcentage.
      NOTE: Pour obtenir des résultats précis, des examens cytologiques doivent être effectués dès que le SF est prélevé ou dans les 24-48 heures suivant l’arthrocentèse lorsqu’il est correctement stocké (4 ° C).

4. Détection des cristaux

1. Déterminer la présence de cristaux pathologiques à l’aide d’un microscope à lumière polarisée muni d’un filtre polarisant supplémentaire et d’un compensateur rouge¹⁹ (voir Tableau des matériaux).
2. Effectuez la préparation des lames pour la détection des cristaux.
   1. Nettoyez soigneusement une lame de verre avec du papier optique ou du papier souple imbibé d’éthanol. Appliquez une petite goutte de SF sur la lame de verre.
   2. Couvrir avec un bordereau de couverture et placer la lame sous le microscope.
3. Identifiez les cristaux.
   1. Faites la mise au point de la lame au microscope à l’aide d’un objectif d’agrandissement de faible puissance. Examinez attentivement la diapositive sous un champ lumineux avec un objectif 40x. Regardez à l’intérieur et à l’extérieur des cellules.
   2. Identifier les cristaux en fonction de leur taille et de leur forme (p. ex., rhomboïdal, en forme d’aiguille, en forme de bâtonnet).
   3. Insérez le filtre polarisant entre la source lumineuse et l’échantillon. Faites pivoter le polariseur jusqu’à ce que son axe optique soit perpendiculaire à l’analyseur (placé au-dessus des objectifs) pour créer un arrière-plan sombre.
   4. Une fois qu’un cristal biréfringent a été identifié, insérer le compensateur entre le polariseur et l’échantillon et le déplacer parallèlement ou perpendiculairement à l’axe optique du cristal.
   5. Observez la couleur révélée par le cristal (tableau 2).
      REMARQUE: Les cristaux MSU apparaissent en forme d’aiguille, biréfringent brillant dans le champ sombre et affichent une couleur jaune / orange lorsque leur axe est parallèle au compensateur. À l’inverse, ils sont bleus lorsqu’ils sont positionnés perpendiculairement (signe négatif) (tableau 2; Graphique 4). Les cristaux CPP sont des cristaux de type bâtonnet ou rhomboïde, faiblement biréfringents sous lumière polarisée, et affichent une couleur bleue ou jaune lorsqu’ils sont alignés parallèlement ou perpendiculairement à l’axe du compensateur (signe positif), respectivement (tableau 2; Graphique 5).

5. Coloration rouge Alizarin

1. Préparez une solution à 2% de rouge d’alizarine S (pH 4,1-4,3), filtrez la solution à travers un filtre de 0,22 μm et conservez-la à l’abri de la lumière.
   1. Pour préparer la lame, mélanger une goutte de SF avec le même volume de solution de rouge d’alizarine (1:1) sur une lame propre. Couvrir avec une lamelle de couverture et examiner à un grossissement de 400x.
   2. Identifiez les cristaux au microscope.
      NOTE: Le test est positif lorsque des précipités rouge foncé brillants sont visibles sous la lumière transmise, avec une forme ronde et des couches concentriques. Sous lumière polarisée, ils apparaissent fortement biréfringents²⁰ (Figure 6).

Résultats

Les grosses articulations touchées par l’arthrose sont souvent enflées et produisent des quantités importantes de SF, qui sont drainées par arthrocentèse¹⁵. Les caractéristiques macroscopiques du SF évaluées immédiatement après arthrocentèse comprennent essentiellement la quantité, la couleur, la clarté et la viscosité¹⁷. Malgré leur faible spécificité, ils fournissent des données préliminaires sur le degré d’inflammation. La couleur dépend...

Discussion

Dans l’arthrose, l’analyse SF aide à définir les caractéristiques de la maladie par des étapes simples: numération totale et différentielle des leucocytes et recherche de cristaux, y compris CPP et BCP. De plus, la détection de cristaux MSU peut mettre en évidence d’importantes comorbidités.

Malgré des coûts faibles et une exécution simple, la sensibilité des tests et la fiabilité des résultats peuvent être affectées par des analystes inexpérimentés, principalement en ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin red S	Merck	A5533	For BCP crystal search
Burker chamber	Merck	BR718905	For total white blood cell count
Cover glasses	Merck	C7931	For microscopic examination
EDTA tubes	BD	368861	For SF collection
Glass slides	Merck	S8902	For crystal search
Lambda filter (compensator)	Any	Refer to microscope company	For crystal identification
Malassez-Potain pipette	Artiglass	54830000	For dilution of synovial fluid
Methylene blue solution	Merck	3978	For total white blood cell count
Polarized microscope	Leica, Nikon, others	Depending on the model and company	For complete synovial fluid analysis
Polarizing lens	Any	Refer to microscope company	For crystal identification
Testsimplet	Waldeck	14386	Supravital staining for cell differentiation