ניתוח נוזלים סינוביאלי לזיהוי דלקת מפרקים ניוונית

Summary

ניתוח נוזל סינוביאלי תחת מיקרוסקופ אור מועבר, מקוטב ומפוצה משמש להערכת האופי הדלקתי או הלא דלקתי של דגימה באמצעות צעדים פשוטים. זה שימושי במיוחד בדלקת מפרקים ניוונית כדי לזהות גבישי סידן ולזהות תת-קבוצה חמורה יותר של דלקת מפרקים ניוונית.

Abstract

ניתוח נוזל סינוביאלי (SF) חשוב באבחון דלקת מפרקים ניוונית (OA). מאפיינים מקרוסקופיים ומיקרוסקופיים, כולל ספירה כוללת ודיפרנציאלית של תאי דם לבנים (WBC), עוזרים להגדיר את האופי הלא דלקתי של SF, שהוא סימן ההיכר של OA. בחולים עם OA, WBC בדגימות SF בדרך כלל אינו עולה על 2000 תאים למיקרוליטר, ואחוז התאים הדלקתיים, כגון נויטרופילים, נמוך מאוד או נעדר. גבישי סידן שכיחים ב- SF שנאספו מחולי OA. למרות שתפקידם בפתוגנזה של OA נותר לא ברור, הם נקשרו לתהליך דלקתי קל ולהתקדמות מחלה חמורה יותר. לאחרונה, גבישי סידן תוארו הן בשלבים המוקדמים והן בשלבים המאוחרים של OA, מה שמצביע על כך שהם עשויים למלא תפקיד חיוני באבחון תת-קבוצות קליניות שונות של OA וטיפול תרופתי. המטרה הכוללת של ניתוח SF ב- OA היא כפולה: לוודא את הדרגה הלא דלקתית של SF ולהדגיש את נוכחותם של גבישי סידן.

Introduction

דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא מחלת מפרקים כרונית מורכבת ורב-גורמית, עם שכיחות עולמית מאוגדת של 16% בנבדקים בני 15 ומעלה, ו-23% בנבדקים בני 40^ומעלה. התחלואה ב-OA צפויה לעלות עקב הזדקנות האוכלוסייה ועלייה בגורמי סיכון, כגון השמנת יתר ותסמונת מטבולית².

בין הבעיות העיקריות הקשורות ל- OA הם הקושי באבחון המחלה בשלביה המוקדמים והטיפולים הזמינים כיום המוגבלים לניהול כאב ותרופות סימפטומטיות איטיות (SYSADOAs) כגון גליקוזאמינוגליקנים. האבחנה של OA מבוססת על תסמינים קליניים וממצאי הדמיה. עם זאת, חוסר המתאם בין שתי ההערכות עלול לגרום לעיכוב של שנים באבחון OA ובהתחלת הטיפול². OA מאופיין בתהליכים ניווניים ודלקת בדרגה נמוכה, אשר ניתן לחקור בקלות באמצעות ניתוח נוזל סינוביאלי (SF). SF הוא דיאליזה פלסמטית צמיגה עשירה בחומצה היאלורונית, המשמנת את חלל המפרק, מספקת חומרים מזינים וחמצן לסחוס ומסירה פסולת מטבולית. SF פועל גם כבולם זעזועים, ובכך מגן על המפרקים במהלך מתח^{ומתח 3}.

ניתוח SF הוא שיטה פשוטה ואמינה כי תמיד חייב להתבצע במהלך ההערכה הראשונית של חולים עם סימפטומים שריר ושלד ו השתפכות משותפת³. המלצות של המכללה האמריקאית לראומטולוגיה, האגודה הבריטית לראומטולוגיה ואחרים כוללות ניתוח SF בין בדיקות האבחון למחלות ראומטיות שיש לבצע בעיקר בהערכת דלקת מפרקים חריפה ^4,5. ספירת לויקוציטים כוללת ודיפרנציאלית המתקבלת מניתוח SF מספקת תמונת מצב של התהליך הפתולוגי המתרחש במפרק, ובכך מסווגת את מידת הדלקת. זיהוי גבישים פתוגניים, כגון גבישי מונוסודיום אוראט (MSU) וסידן פירופוספט (CPP), תחת אור מקוטב, חיוני לאבחון וטיפול בדלקת מפרקים גבישית (למשל, שיגדון ופסאודוגאוט). יתר על כן, נוכחותם של מיקרואורגניזמים מצביעה על אבחנה של דלקת מפרקים ספיגה.

גבישי סידן שכיחים בדגימות שנאספו מחולים עם OA⁶. גבישי סידן פוספט בסיסיים (BCP) ו-CPP דווחו בכ-22% ו-23% מדגימות SF, בהתאמה, מחולים עם OA⁶. למרות שתפקידם נותר לא ברור, גבישים אלה נקשרו לצורות חמורות יותר של OA⁷ ונחשבים לאפיתופעה של התהליך הפתולוגי עצמו. גבישי סידן התגלו ב-100% מדגימות הרקמה של חולי OA שעברו החלפת ברך⁸. יתר על כן, הועלתה השערה כי גבישי סידן עשויים להיות מעורבים בפתוגנזה של OA בשל ההשפעות הדלקתיות שלהם, שהודגמו על ידי מספר מחקרים⁹ ותווך, לפחות בחלקו, על ידי NLRP3 inflammasome¹⁰.

לאחרונה, גבישי סידן תוארו הן בשלב מוקדם והן בשלבים מאוחרים⁶ של OA, מה שמצביע על כך שהם עשויים למלא תפקיד חיוני באבחון תת-קבוצות קליניות שונות של OA וטיפול תרופתי.

המטרה הכוללת של ניתוח SF היא כפולה: לקבוע את מידת הדלקת של SF ולאבחן דלקת מפרקים גבישית או ספטית על ידי זיהוי גבישים או מיקרואורגניזמים ספציפיים. זהו כלי שימושי, פשוט ואמין במיוחד באבחון OA, בשל דפוס לא דלקתי טיפוסי עם אחוז נמוך מאוד או היעדר נויטרופילים.

יתרונות על פני טכניקות חלופיות
ניתוח SF מורכב מהליכים פשוטים הכוללים ספירת לויקוציטים כוללת ודיפרנציאלית וחיפוש גבישי. ספירת תאים ידנית המבוצעת על ידי טכנאי מעבדה מומחים ^3,11 נותרה תקן הזהב לניתוח ציטולוגי של נוזלי גוף סינוביאליים ואחרים. עם זאת, בשל מגבלת הזמן והשונות הבין-צופה והתוך-צופה של שיטה זו, מוני תאים אוטומטיים החליפו בהדרגה את הספירה הידנית במעבדות קליניות שגרתיות גדולות שבהן הותאמו מנתחי דם ושתן כדי לאפשר ניתוח SF^11,12. עם זאת, ספירה ידנית מציגה כמה יתרונות בהגדרות ספציפיות: (1) באמבולטורי, כדי לקבל ערך WBC כולל ודיפרנציאלי בזמן; (2) לזהות סוגי תאים כגון תאים חד-גרעיניים ציטופגוציטיים (רייטר) או תאים לא המטופויטיים כגון סינוביוציטים, שמונים אוטומטיים אינם יכולים לזהות; (3) כאשר הדגימה קטנה מכדי שניתן יהיה לטפל בה על ידי המכשיר; (4) ליצור רישומי מעבדות מקומיים שיהיו נגישים בקלות למטרות מחקר. יתרון נוסף של ספירה ידנית הוא צביעה בלתי נתפסת, שיטה המאפשרת התמיינות של תאים במהירות רבה ומיד לאחר הכנת מגלשת זכוכית. לעומת זאת, כתמים מסורתיים, כגון הליכי רייט ומאי-גרינוולד-גימסה, דורשים מריחות SF מיובשות באוויר וזמן להכתים את התאים¹³. למרות שאינן מתאימות לניתוחים שגרתיים תלויי זמן, שיטות צביעה אלה חושפות אוכלוסיות תאים מפורטות יותר בדגימה, כולל אריתרוציטים, בזופילים, אאוזינופילים, לויקוציטים פולימורפוגרעיניים, לימפוציטים וטסיות דם.

לבסוף, ניתוח SF שגרתי עבור גבישים מבוצע בטכניקה פשוטה המבוססת על מיקרוסקופ אור מקוטב, המספק תוצאות מהירות¹⁴. שיטות חלופיות, כגון סריקה ומיקרוסקופ אלקטרונים, מניבות תוצאות מדויקות ורגישות יותר, אך השימוש בהן בפרקטיקה הקלינית היומיומית אינו אפשרי בשל עלויות גבוהות והכנת דגימה וניתוח גוזלים זמן.

Protocol

הפרוטוקול הנוכחי תואם את הנחיות ועדת האתיקה של בית החולים האוניברסיטאי פדובה. SF נאסף בהסכמת המטופל ממפרקי הברך של חולים שקיבלו ארתרוסנטזיס טיפולי לשיוף מפרקים בהצגתם הראשונית למרפאה או בתגובה להתלקחות דלקת פרקים. התוויות נגד להליך היו: קרישת דם, תרופות נוגדות קרישה, נגעים בעור, דרמטיטיס או צלוליטיס מעל המפרק. כל דגימות SF לא זוהו.

1. הכנת נוזל סינוביאלי

1. העבירו את דגימות SF שנאספו במהלך ארתרוסנטזיס של מפרקים^{נפוחים 15} לתוך צינור המכיל נוגדי קרישה (רצוי EDTA; ראו טבלת חומרים) ולצינור שני שאינו מכיל תוסף (איור 1).
2. במקרים חשודים של זיהום, יש להעביר חלק מדגימת SF (~ 1 מ"ל) לבקבוקי תרבית לצורך בדיקה מיקרוביולוגית.
   הערה: ניתן לחשוד בזיהום כתוצאה הן ממאפיינים קליניים (גידול חמור, דולר, קלור, functio laesa, ולעיתים חום) והן ממראה מקרוסקופי של SF (עכירות, צבע). במקרה זה, הרופא קובע ניתוח מיקרוביולוגי, המבוצע על ידי מעבדה מיקרוביולוגית.
3. בצע ניתוח SF (שלבים 2-5) ברגע שהדגימה נאספת.

2. בדיקה מקרוסקופית

הערה: הערכה מקרוסקופית של דגימות SF מורכבת מהערכות סובייקטיביות, איכותיות וכמותיות למחצה. אין סולמות סטנדרטיים ייחוס, ולא נעשה שימוש בדגימות בקרה.

1. הוסף ביאורים לנפח SF המתבטא במיליליטרים. הגדירו את צבע הדגימה, שיכול לנוע בין צהוב בהיר לצהוב כהה. רשום את נוכחות הדם.
2. הגדירו את מידת הבהירות על-ידי התבוננות בדגימה בתאורה האחורית וקביעת קלות הקריאה של דף מודפס דרך צינור הנוזל (איור 2A).
3. להעריך את הצמיגות על ידי טפטוף הדגימה פיפטה חד פעמית. היווצרות מיתר או טיפה ארוכה מצביעה על צמיגות טובה או ירודה, בהתאמה (איור 2B).
4. להעריך את נוכחותם של חומרים חלקיקיים, כולל שברי רקמות או פיברין, על ידי התבוננות בדגימה דרך הצינור ובתאורה האחורית.

3. בדיקה מיקרוסקופית

הערה: הניתוח המיקרוסקופי SF מורכב מבדיקה ציטולוגית, כולל ספירה כוללת ודיפרנציאלית של תאי דם לבנים (WBC) וחיפוש אחר גבישים.

1. קבע את ספירת התאים הכוללת לפי השלבים הבאים.
   1. לקבוע את המספר הכולל של לויקוציטים ב- SF שנאסף בצינור EDTA באמצעות hemocytometer (ראה טבלה של חומרים).
   2. ציירו 0.5 μL של SF מצינור EDTA באמצעות פיפטה Malassez-Potain (סימון 0.5; ראו טבלת חומרים) (איור משלים 1). עם אותה פיפטה, ציירו 9.5 μL של תמיסה כחולה 0.1% מתילן (סימן 11). הדילול הסופי הוא פי 20.
   3. מערבבים את הפיפטה בהיפוך עדין, משליכים את הטיפות הראשונות ויוצקים את הנוזל הסינוביאלי + תמיסה כחולה מתילן לתא הספירה.
   4. ספור את התאים בשני ריבועים עוקבים מתוך תשעה, והכפל את המספר המתקבל ב- 100 (נוסחה פשוטה; תרשים משלים 2). אקספרס WBCs כמספר לויקוציטים למילימטר מעוקב.
      הערה: נוסחה פשוטה: לויקוציטים (N/mm³) = מספר התאים שנספרו בשני ריבועים עוקבים x 100.
   5. סווג את SF לפי המספר הכולל של WBCs בעקבות דוחות שפורסמו בעבר^16,17 (טבלה 1).
2. בצע ספירת תאים דיפרנציאלית.
   1. קבע את אחוז התאים הפולימורפוגרעיניים (PMN), מונוציטים ולימפוציטים באמצעות צביעה על-חיונית או מסורתית^13,18.
   2. עבור צביעה על-חיונית, הניחו טיפה אחת קטנה של SF במרכז שקופית מוכנה לשימוש המצופה מראש בסגול קרסיל ובכחול מתילן (איור משלים 3; ראו טבלת חומרים).
   3. מכסים בכיסוי, ומניחים טיפה של שמן טבילה במיקרוסקופ.
   4. הכינו משטח SF מיובש באוויר לכתמים מסורתיים (פחות מתאים לניתוח שגרתי). שים טיפה קטנה של SF בסוף שקופית נקייה. באמצעות שקופית שנייה או החלקת כיסוי, פרוש אותה לאורך השקופית בתנועה קדימה. תנו למריחה להתייבש באוויר.
   5. מכתימים את הדגימה לפי נוהל מאי-גרינוולד-גימסה^{סטנדרטי 18}.
   6. בדוק את השקופית מתחת למטרה טבילת שמן (1,000x).
   7. ספרו 100 תאים עוקבים והבחינו בין תאים פולימורפו-גרעיניים, מונוציטים ולימפוציטים (איור 3, איור משלים 4).
   8. בטא את המספר הכולל בכל קטגוריה באחוזים.
      הערה: כדי להשיג תוצאות מדויקות, בדיקות ציטולוגיות חייבות להתבצע ברגע SF נאסף או בתוך 24-48 שעות של arthrocentesis כאשר מאוחסן כראוי (4 ° C).

4. זיהוי קריסטלים

1. לקבוע את נוכחותם של גבישים פתולוגיים באמצעות מיקרוסקופ אור מקוטב מצויד מסנן מקטב נוסף ומפצה אדום¹⁹ (ראה טבלת חומרים).
2. בצע הכנת שקופיות לזיהוי קריסטלים.
   1. נקו בזהירות שקופית זכוכית עם נייר אופטי או נייר רך טבול באתנול. החל טיפה קטנה של SF על מגלשת הזכוכית.
   2. מכסים בכיסוי ומניחים את המגלשה מתחת למיקרוסקופ.
3. זהה את הגבישים.
   1. מקדו את השקופית מתחת למיקרוסקופ באמצעות מטרת הגדלה בהספק נמוך. בחן בזהירות את השקופית מתחת לשדה בהיר עם מטרה של 40x. הסתכלו פנימה והחוצה על התאים.
   2. זהה את הגבישים על פי גודלם וצורתם (למשל, רומבואידים, בצורת מחט, בצורת מוט).
   3. הכניסו את המסנן המקטב בין מקור האור לדגימה. סובבו את המקטב עד שהציר האופטי שלו מאונך לאנלייזר (ממוקם מעל המטרות) ליצירת רקע כהה.
   4. לאחר זיהוי גביש דו-צדדי, הכניסו את המפצה בין המקטב לדגימה והזיזו אותו במקביל או בניצב לציר האופטי של הגביש.
   5. התבוננו בצבע שהגביש מגלה (טבלה 2).
      הערה: גבישי MSU מופיעים בצורת מחט, דו-צדדיים בהירים בשדה הכהה, ומציגים צבע צהוב/כתום כאשר צירם מקביל למפצה. לעומת זאת, הם כחולים כאשר הם ממוקמים בניצב (סימן שלילי) (טבלה 2; איור 4). גבישי CPP הם גבישים דמויי מוט או רומבואיד, דו-צדדיים חלשים תחת אור מקוטב, ומציגים צבע כחול או צהוב כאשר הם מיושרים במקביל או בניצב לציר המפצה (סימן חיובי), בהתאמה (טבלה 2; איור 5).

5. כתמים אדומים של אליזרין

1. הכינו תמיסה של 2% אליזרין אדום S (pH 4.1-4.3), סננו את התמיסה דרך מסנן 0.22 מיקרומטר, ואחסנו אותה הרחק מאור.
   1. להכנת השקופית, ערבבו טיפה של SF עם אותו נפח של תמיסה אדומה אליזרין (1:1) על שקופית נקייה. מכסים בכיסוי ובודקים בהגדלה של פי 400.
   2. זהו את הגבישים מתחת למיקרוסקופ.
      הערה: הבדיקה חיובית כאשר משקעים בהירים בצבע אדום כהה נראים תחת אור משודר, עם צורה עגולה ושכבות קונצנטריות. תחת אור מקוטב הם נראים דו-צדדיים חזקים²⁰ (איור 6).

תוצאות

מפרקים גדולים המושפעים על ידי OA הם לעתים קרובות נפוחים לייצר כמויות משמעותיות של SF, אשר מנוקזים באמצעות arthrocentesis¹⁵. המאפיינים המקרוסקופיים של SF המוערכים מיד לאחר arthrocentesis כוללים למעשה את הכמות, צבע, בהירות, צמיגות¹⁷. למרות הספציפיות הנמוכה שלהם, הם מספקים נתונים...

Discussion

ב- OA, ניתוח SF מסייע להגדיר מאפייני מחלה באמצעות צעדים פשוטים: ספירת לויקוציטים כוללת ודיפרנציאלית וחיפוש גבישים, כולל CPP ו- BCP. יתר על כן, זיהוי של גבישי MSU עשוי להדגיש תחלואה נלווית חשובה.

למרות עלויות נמוכות וביצוע פשוט, רגישות הבדיקות ואמינות התוצאות עשויות להיפגע בשל אנליס?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin red S	Merck	A5533	For BCP crystal search
Burker chamber	Merck	BR718905	For total white blood cell count
Cover glasses	Merck	C7931	For microscopic examination
EDTA tubes	BD	368861	For SF collection
Glass slides	Merck	S8902	For crystal search
Lambda filter (compensator)	Any	Refer to microscope company	For crystal identification
Malassez-Potain pipette	Artiglass	54830000	For dilution of synovial fluid
Methylene blue solution	Merck	3978	For total white blood cell count
Polarized microscope	Leica, Nikon, others	Depending on the model and company	For complete synovial fluid analysis
Polarizing lens	Any	Refer to microscope company	For crystal identification
Testsimplet	Waldeck	14386	Supravital staining for cell differentiation