Osteoartriti Tanımlamak için Sinovyal Sıvı Analizi

Özet

İletilen, polarize ve kompanse ışık mikroskobu altındaki sinovyal sıvı analizi, bir numunenin enflamatuar veya enflamatuar olmayan doğasını basit adımlarla değerlendirmek için kullanılır. Osteoartritte kalsiyum kristallerini tespit etmek ve osteoartritin daha ciddi bir alt kümesini tanımlamak için özellikle yararlıdır.

Özet

Sinovyal sıvı (SF) analizi osteoartrit (OA) tanısında önemlidir. Toplam ve diferansiyel beyaz kan hücresi (WBC) sayısı da dahil olmak üzere makroskobik ve mikroskobik özellikler, OA'nın ayırt edici özelliği olan SF'nin enflamatuar olmayan doğasını tanımlamaya yardımcı olur. OA'lı hastalarda, SF örneklerinde WBC genellikle mikrolitre başına 2000 hücreyi geçmez ve nötrofiller gibi enflamatuar hücrelerin yüzdesi çok düşüktür veya yoktur. OA hastalarından toplanan SF'lerde kalsiyum kristalleri sık görülür. OA patogenezindeki rolleri tam olarak bilinmemekle birlikte, hafif inflamatuar süreç ve daha ciddi hastalık progresyonu ile ilişkilendirilmişlerdir. Son zamanlarda, kalsiyum kristalleri OA'nın hem erken hem de geç evrelerinde tanımlanmıştır, bu da OA'nın farklı klinik alt kümelerinin ve farmakolojik tedavinin teşhisinde hayati bir rol oynayabileceklerini göstermektedir. OA'da SF analizinin genel amacı iki yönlüdür: SF'nin enflamatuar olmayan derecesini belirlemek ve kalsiyum kristallerinin varlığını vurgulamak.

Giriş

Osteoartrit (OA) kompleks ve multifaktöriyel kronik eklem hastalığıdır ve 15 yaş ve üstü kişilerde %16, 40 yaş^{ve üstü} kişilerde %23 gibi tahmini bir küresel prevalansı vardır. OA insidansının yaşlanan bir popülasyon ve obezite ve metabolik sendrom gibi risk faktörlerindeki artışa bağlı olarak artması beklenmektedir².

OA ile ilişkili başlıca sorunlar arasında, hastalığın erken evrelerinde teşhis edilmesindeki zorluk ve şu anda mevcut tedaviler, ağrı yönetimi ve glikozaminoglikanlar gibi semptomatik yavaş etkili ilaçlar (SYSADOA'lar) ile sınırlıdır. OA tanısı klinik semptomlara ve görüntüleme bulgularına dayanır. Bununla birlikte, iki değerlendirme arasındaki korelasyon eksikliği, OA tanısında ve tedaviye başlamada yıllarca gecikmeye neden olabilir². OA, sinovyal sıvı (SF) analizi ile kolayca araştırılabilen dejeneratif süreçler ve düşük dereceli inflamasyon ile karakterizedir. SF, eklem boşluğunu yağlayan, kıkırdağa besin ve oksijen sağlayan ve metabolik atıkları gideren hyaluronik asit bakımından zengin viskoz plazmatik bir diyalizattır. SF ayrıca bir amortisör görevi görür, böylece stres ve gerinim 3 sırasında eklemleri^korur.

SF analizi, kas-iskelet sistemi semptomları ve eklem efüzyonları olan hastaların ilk değerlendirilmesi sırasında her zaman yapılması gereken basit ve güvenilir bir yöntemdir³. Amerikan Romatoloji Koleji, İngiliz Romatoloji Derneği ve diğerlerinin önerileri, esas olarak akut monoartritin değerlendirilmesinde yapılması gereken romatizmal hastalıklar için tanısal testler arasında SF analizini içerir ^4,5. SF analizinden elde edilen toplam ve diferansiyel lökosit sayımları, eklemde meydana gelen patolojik sürecin anlık görüntüsünü sağlar, böylece inflamasyon derecesini sınıflandırır. Polarize ışık altında monosodyum ürat (MSU) ve kalsiyum pirofosfat (CPP) kristalleri gibi patojenik kristallerin tanımlanması, kristal artritin (örneğin, gut ve psödogut) tanı ve tedavisinde hayati öneme sahiptir. Ayrıca, mikroorganizmaların varlığı septik artrit tanısını düşündürmektedir.

OA^6'lı hastalardan toplanan örneklerde kalsiyum kristalleri sık görülür. Temel kalsiyum fosfat (BCP) kristalleri ve CPP, OA^6'lı hastalardan alınan SF örneklerinin sırasıyla yaklaşık% 22 ve% 23'ünde bildirilmiştir. Rolleri belirsizliğini korusa da, bu kristaller OA^7'nin daha şiddetli formlarıyla ilişkilendirilmiştir ve patolojik sürecin kendisinin bir epifenomeni olarak kabul edilir. Diz protezi uygulanan OA hastalarından alınan doku örneklerinin %100'ünde kalsiyum kristalleri tespit edilmiştir⁸. Ayrıca, kalsiyum kristallerinin, enflamatuar etkileri nedeniyle OA patogenezinde rol oynayabileceği,^{çeşitli çalışmalarla} gösterilen 9 ve en azından kısmen NLRP3 enflamatuar¹⁰ tarafından aracılık edildiği varsayılmıştır.

Daha yakın zamanlarda, kalsiyum kristalleri OA'nın hem erken hem de geç evre^6'sında tanımlanmıştır, bu da OA'nın farklı klinik alt kümelerinin ve farmakolojik tedavinin teşhisinde hayati bir rol oynayabileceklerini göstermektedir.

SF analizinin genel amacı iki yönlüdür: SF'nin enflamatuar derecesini belirlemek ve spesifik kristalleri veya mikroorganizmaları tanımlayarak kristal veya septik artriti teşhis etmek. Çok düşük bir nötrofil yüzdesi veya yokluğu olan tipik enflamatuar olmayan patern nedeniyle OA tanısında özellikle yararlı, basit ve güvenilir bir araçtır.

Alternatif tekniklere göre avantajları
SF analizi, toplam ve diferansiyel lökosit sayımlarını ve kristal aramasını içeren basit prosedürlerden oluşur. Uzman laboratuvar teknisyenleri tarafından yapılan manuel hücre sayımı ^3,11, sinovyal ve diğer vücut sıvılarının sitolojik analizi için altın standart olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, zaman alıcı sınırlama ve bu yöntemin gözlemciler arası ve gözlemciler arası değişkenliği nedeniyle, otomatik hücre sayaçları, SF analizini sağlamak için kan ve idrar analizörlerinin uyarlandığı büyük rutin klinik laboratuvarlarda manuel sayımın yerini kademeli olarak almıştır^11,12. Bununla birlikte, manuel sayım, belirli ortamlarda bazı avantajlar sunar: (1) ambulatuvarda, zamanında toplam ve diferansiyel bir WBC değeri elde etmek için; (2) otomatik sayaçların tanıyamadığı sitofagositik mononükleer (Reiter) hücreler veya sinovyositler gibi hematopoetik olmayan hücreler gibi hücre tiplerini tanımlamak; (3) numune alet tarafından işlenemeyecek kadar küçük olduğunda; (4) Araştırma amaçları için kolayca erişilebilen yerel laboratuvar kayıtları oluşturmak. Manuel sayımın bir diğer avantajı, cam slayt hazırlığından hemen sonra hücrelerin çok hızlı ve hemen farklılaşmasını sağlayan bir yöntem olan insupravital boyama görülür. Buna karşılık, Wright ve May-Grünwald-Giemsa prosedürleri gibi geleneksel boyamalar, hava ile kurutulmuş SF yaymaları ve hücreleri boyamak için zaman gerektirir¹³. Zamana duyarlı rutin analizler için uygun olmasa da, bu boyama yöntemleri numunede eritrositler, bazofiller, eozinofiller, polimorfonükleer lökositler, lenfositler ve trombositler dahil olmak üzere daha ayrıntılı hücre popülasyonlarını ortaya koymaktadır.

Son olarak, kristaller için rutin SF analizi, hızlı sonuçlar veren polarize ışık mikroskobuna dayanan basit bir teknik kullanılarak gerçekleştirilir¹⁴. Tarama ve elektron mikroskobu gibi alternatif yöntemler daha doğru ve hassas sonuçlar verir, ancak yüksek maliyetler ve zaman alıcı numune hazırlama ve analizi nedeniyle günlük klinik pratikte kullanımları mümkün değildir.

Protokol

Bu protokol, Padova Üniversitesi Hastanesi Etik Kurulu'nun yönergelerine uygundur. SF, eklem efüzyonu için terapötik artrosentez alan hastaların diz eklemlerinden kliniğe ilk sunumlarında veya artritik bir alevlenmeye yanıt olarak hasta onayı ile toplandı. Prosedüre kontrendikasyonlar şunlardı: koagülopati, antikoagülan ilaçlar, cilt lezyonları, dermatit veya eklemin üzerinde bulunan selülit. Tüm SF örnekleri tanımlandı.

1. Sinovyal sıvı preparatı

1. Şişmiş eklemlerin artrosentezi sırasında toplanan SF örneklerini¹⁵ antikoagülan içeren bir tüpe (tercihen EDTA; bakınız Malzeme Tablosu) ve katkı maddesi içermeyen ikinci bir tüpe aktarın (Şekil 1).
2. Şüpheli enfeksiyon vakalarında, SF numunesinin bir kısmını (~ 1 mL) mikrobiyolojik testler için aseptik olarak kültür şişelerine aktarın.
   NOT: Enfeksiyon, hem klinik özelliklerin (şiddetli tümör, dolor, kalori, functio laesa ve bazen ateş) hem de SF'nin makroskopik görünümünün (bulanıklık, renk) bir sonucu olarak şüphelenilebilir. Bu durumda, doktor bir mikrobiyoloji laboratuvarı tarafından gerçekleştirilen bir mikrobiyolojik analiz reçete eder.
3. Numune toplanır toplanmaz SF analizi (adım 2-5) yapın.

2. Makroskopik inceleme

NOT: SF örneklerinin makroskopik değerlendirmesi subjektif, nitel ve yarı kantitatif değerlendirmelerden oluşur. Referans standart terazi yoktur ve kontrol numunesi kullanılmaz.

1. Mililitre cinsinden ifade edilen SF hacmine açıklama ekleyin. Numunenin soluk ila koyu sarı arasında değişebilen rengini tanımlayın. Kanın varlığını kaydedin.
2. Arka ışıktaki numuneyi gözlemleyerek ve basılı bir sayfayı sıvı tüpünden okuma kolaylığını belirleyerek netlik derecesini tanımlayın (Şekil 2A).
3. Numuneyi tek kullanımlık pipetten damlatarak viskoziteyi değerlendirin. Uzun bir dize veya damla oluşumu sırasıyla iyi veya zayıf viskoziteyi gösterir (Şekil 2B).
4. Doku parçaları veya fibrin de dahil olmak üzere partikül malzemelerin varlığını, numuneyi tüpten ve arka ışıkta gözlemleyerek değerlendirin.

3. Mikroskobik inceleme

NOT: SF mikroskobik analizi, toplam ve diferansiyel beyaz kan hücresi (WBC) sayımlarını ve kristallerin araştırılmasını içeren sitolojik incelemeden oluşur.

1. Aşağıdaki adımları izleyerek toplam hücre sayısını belirleyin.
   1. Bir hemositometre kullanarak EDTA tüpünde toplanan SF'deki toplam lökosit sayısını belirleyin (bkz.
   2. Bir Malassez-Potain pipeti kullanarak EDTA tüpünden SF'nin 0,5 μL'sini çekin (işaret 0,5; bkz. Malzeme Tablosu) (Ek Şekil 1). Aynı pipetle 9,5 μL'lik %0,1 metilen mavisi çözeltisi çekin (işaret 11). Son seyreltme 20 katıdır.
   3. Pipetleri hafifçe ters çevirerek karıştırın, ilk damlaları atın ve sinovyal sıvı + metilen mavisi çözeltisini sayım odasına dökün.
   4. Hücreleri dokuzdan iki ardışık karede sayın ve elde edilen sayıyı 100 ile çarpın (basitleştirilmiş formül; Ek Şekil 2). WBC'leri milimetreküp başına lökosit sayısı olarak ifade edin.
      NOT: Basitleştirilmiş formül: Lökositler (N/^mm3) = iki ardışık karede sayılan hücrelerin sayısı x 100.
   5. SF'yi daha önce yayınlanmış raporları takip eden WBC'lerin toplam sayısına göre sınıflandırın^16,17 (Tablo 1).
2. Diferansiyel hücre sayımı gerçekleştirin.
   1. Supravital veya geleneksel boyama kullanarak polimorfonükleer (PMN) hücrelerin, monositlerin ve lenfositlerin yüzdesini belirleyin^13,18.
   2. Supravital boyama için, kresil menekşe ve metilen mavisi ile önceden kaplanmış kullanıma hazır bir slaydın ortasına küçük bir damla SF yerleştirin (Ek Şekil 3; bkz.
   3. Bir kapak kayması ile örtün ve bir damla mikroskop daldırma yağı yerleştirin.
   4. Geleneksel boyama için hava ile kurutulmuş bir SF smear hazırlayın (rutin analiz için daha az uygundur). Temiz bir slaytın sonuna küçük bir damla SF koyun. İkinci bir slayt veya kapak kayması kullanarak, ileri doğru bir hareketle slayt boyunca yayın. Smear'ın havayla kurumasını bekleyin.
   5. Numuneyi standart bir May-Grünwald-Giemsa prosedürüne göre lekeleyin¹⁸.
   6. Yağ daldırma hedefinin (1.000x) altındaki sürgüyü inceleyin.
   7. Ardışık 100 hücreyi sayın ve polimorfonükleer hücreler, monositler ve lenfositler arasında ayrım yapın (Şekil 3, Ek Şekil 4).
   8. Her kategorideki toplam sayıyı yüzde olarak ifade edin.
      NOT: Doğru sonuçlar elde etmek için, sitolojik incelemeler SF toplanır toplanmaz veya uygun şekilde depolandığında artrosentezden sonraki 24-48 saat içinde (4 ° C) yapılmalıdır.

4. Kristal algılama

1. Ek bir polarize filtre ve kırmızı bir kompansatör¹⁹ ile donatılmış polarize bir ışık mikroskobu kullanarak patolojik kristallerin varlığını belirleyin (bkz.
2. Kristal algılama için slayt hazırlığı gerçekleştirin.
   1. Bir cam slaytı optik kağıtla veya etanol ile emilmiş yumuşak kağıtla dikkatlice temizleyin. Cam slayta küçük bir damla SF uygulayın.
   2. Bir kapak kayması ile örtün ve slaytı mikroskop altına yerleştirin.
3. Kristalleri tanımlayın.
   1. Düşük güçlü bir büyütme hedefi kullanarak slaytı mikroskop altına odaklayın. Slaytı 40x hedefiyle parlak bir alanın altında dikkatlice inceleyin. Hücrelerin içine ve dışına bakın.
   2. Kristalleri boyutlarına ve şekillerine göre tanımlayın (örneğin, eşkenar dörtgen, iğne şeklinde, çubuk şeklinde).
   3. Polarize filtreyi ışık kaynağı ile numune arasına yerleştirin. Koyu bir arka plan oluşturmak için polarizörü optik ekseni analizöre dik olana kadar (hedeflerin üzerine yerleştirilmiş) döndürün.
   4. Bir çift kırılımlı kristal tanımlandıktan sonra, kompansatörü polarizör ile numune arasına yerleştirin ve kristalin optik eksenine paralel veya dik olarak hareket ettirin.
   5. Kristalin ortaya çıkardığı rengi gözlemleyin (Tablo 2).
      NOT: MSU kristalleri karanlık alanda iğne şeklinde, parlak bir şekilde çift kırılımlı görünür ve eksenleri kompansatöre paralel olduğunda sarı/turuncu bir renk gösterir. Tersine, dik (negatif işaret) konumlandırıldığında mavidir (Tablo 2; Şekil 4). CPP kristalleri, polarize ışık altında zayıf bir şekilde çift kırılabilen çubuk veya eşkenar dörtgen benzeri kristallerdir ve sırasıyla kompansatörün eksenine paralel veya dik olarak hizalandıklarında mavi veya sarı bir renk gösterirler (pozitif işaret) (Tablo 2; Şekil 5).

5. Alizarin kırmızı boyama

1. % 2'lik bir alizarin kırmızı S çözeltisi (pH 4.1-4.3) hazırlayın, çözeltiyi 0.22 μm'lik bir filtreden süzün ve ışıktan uzak tutun.
   1. Slaytı hazırlamak için, temiz bir slayt üzerinde aynı hacimde alizarin kırmızı çözeltisi (1: 1) ile bir damla SF'yi karıştırın. Bir kapak fişi ile örtün ve 400x büyütmede inceleyin.
   2. Mikroskop altındaki kristalleri tanımlayın.
      NOT: Parlak, koyu kırmızı çökeltiler iletilen ışık altında, yuvarlak bir şekil ve eşmerkezli katmanlarla görülebildiğinde test pozitiftir. Polarize ışık altında, güçlü bir şekilde birefringent²⁰ görünürler (Şekil 6).

Sonuçlar

OA'dan etkilenen büyük eklemler sıklıkla şişer ve artrosentez¹⁵ yoluyla boşaltılan önemli miktarda SF üretir. Artrosentezden hemen sonra değerlendirilen SF'nin makroskopik özellikleri esas olarak miktar, renk, berraklık ve viskoziteyi içerir¹⁷. Düşük özgüllüklerine rağmen, inflamasyon derecesi hakkında ön veri sağlarlar. Renk, SF hücreselliğine ve hücre dışı matriks makromoleküllerinin parçalanma derecesine bağlıdır. OA'lı hastal...

Tartışmalar

OA'da, SF analizi basit adımlarla hastalık özelliklerini tanımlamaya yardımcı olur: toplam ve diferansiyel lökosit sayıları ve CPP ve BCP dahil olmak üzere kristallerin aranması. Ayrıca, MSU kristallerinin saptanması önemli komorbiditeleri vurgulayabilir.

Düşük maliyetlere ve basit uygulamaya rağmen, testlerin duyarlılığı ve sonuçların güvenilirliği, deneyimsiz analistler nedeniyle etkilenebilir - esas olarak kristal tanımlama ile ilgili olduğu için. Analistin eği...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin red S	Merck	A5533	For BCP crystal search
Burker chamber	Merck	BR718905	For total white blood cell count
Cover glasses	Merck	C7931	For microscopic examination
EDTA tubes	BD	368861	For SF collection
Glass slides	Merck	S8902	For crystal search
Lambda filter (compensator)	Any	Refer to microscope company	For crystal identification
Malassez-Potain pipette	Artiglass	54830000	For dilution of synovial fluid
Methylene blue solution	Merck	3978	For total white blood cell count
Polarized microscope	Leica, Nikon, others	Depending on the model and company	For complete synovial fluid analysis
Polarizing lens	Any	Refer to microscope company	For crystal identification
Testsimplet	Waldeck	14386	Supravital staining for cell differentiation