Synovialflüssigkeitsanalyse zur Erkennung von Arthrose

Zusammenfassung

Die Synovialflüssigkeitsanalyse unter Durchlicht-, Polarisations- und Kompensationslichtmikroskopie wird verwendet, um die entzündliche oder nicht-entzündliche Natur einer Probe in einfachen Schritten zu bewerten. Es ist besonders nützlich bei Arthrose, um Kalziumkristalle zu erkennen und eine schwerere Untergruppe der Arthrose zu identifizieren.

Zusammenfassung

Die Analyse der Synovialflüssigkeit (SF) ist wichtig für die Diagnose von Arthrose (OA). Makroskopische und mikroskopische Merkmale, einschließlich der Gesamtzahl und der Differentialzahl der weißen Blutkörperchen (WBC), tragen dazu bei, die nicht-entzündliche Natur der SF zu definieren, die ein Kennzeichen von Arthrose ist. Bei Patienten mit Arthrose überschreitet der Leukozytengehalt in SF-Proben in der Regel nicht 2000 Zellen pro Mikroliter, und der Anteil an Entzündungszellen, wie z. B. Neutrophilen, ist sehr gering oder fehlt. Kalziumkristalle sind häufig in SF von Arthrose-Patienten enthalten. Obwohl ihre Rolle in der Pathogenese der Arthrose noch unklar ist, wurden sie mit einem milden Entzündungsprozess und einem schwereren Krankheitsverlauf in Verbindung gebracht. In jüngster Zeit wurden Kalziumkristalle sowohl im Früh- als auch im Spätstadium der Arthrose beschrieben, was darauf hindeutet, dass sie eine wichtige Rolle bei der Diagnose verschiedener klinischer Untergruppen von Arthrose und der pharmakologischen Behandlung spielen können. Das übergeordnete Ziel der SF-Analyse bei Arthrose ist zweierlei: die Bestimmung des nicht-entzündlichen Grades der SF und die Hervorhebung des Vorhandenseins von Kalziumkristallen.

Einleitung

Arthrose (OA) ist eine komplexe und multifaktorielle chronische Gelenkerkrankung mit einer geschätzten Gesamtprävalenz von 16 % bei Personen ab 15 Jahren und 23 % bei Personen ab 40 Jahren¹. Es wird erwartet, dass die Inzidenz von Arthrose aufgrund einer alternden Bevölkerung und einer Zunahme von Risikofaktoren wie Fettleibigkeit und metabolischem Syndrom^{zunehmen wird 2}.

Zu den Hauptproblemen im Zusammenhang mit Arthrose gehören die Schwierigkeit, die Krankheit in ihren frühen Stadien zu diagnostizieren, und die derzeit verfügbaren Behandlungen, die sich auf die Schmerzbehandlung und symptomatische langsam wirkende Medikamente (SYSADOAs) wie Glykosaminoglykane beschränken. Die Diagnose einer Arthrose basiert auf klinischen Symptomen und bildgebenden Befunden. Die fehlende Korrelation zwischen den beiden Beurteilungen kann jedoch zu einer jahrelangen Verzögerung der OA-Diagnose und des Behandlungsbeginns führen². Arthrose ist gekennzeichnet durch degenerative Prozesse und geringgradige Entzündungen, die durch eine Synovialflüssigkeitsanalyse (SF) leicht untersucht werden können. SF ist ein viskoses plasmatisches Dialysat, das reich an Hyaluronsäure ist, die den Gelenkspalt schmiert, den Knorpel mit Nährstoffen und Sauerstoff versorgt und Stoffwechselabfälle entfernt. SF wirkt auch als Stoßdämpfer und schützt so die Gelenke bei Belastung und Beanspruchung³.

Die SF-Analyse ist eine einfache und zuverlässige Methode, die bei der Erstabklärung von Patienten mit muskuloskelettalen Symptomen und Gelenkergüssen immer durchgeführt werden muss³. Zu den Empfehlungen des American College of Rheumatology, der British Society for Rheumatology und anderer gehört die SF-Analyse zu den diagnostischen Tests für rheumatische Erkrankungen, die hauptsächlich bei der Beurteilung der akuten Monoarthritis durchgeführt werden müssen ^4,5. Die Gesamt- und Differentialleukozytenzahlen aus der SF-Analyse liefern eine Momentaufnahme des pathologischen Prozesses im Gelenk und klassifizieren so den Grad der Entzündung. Die Identifizierung von pathogenen Kristallen wie Mononatriumurat (MSU) und Calciumpyrophosphat (CPP)-Kristallen unter polarisiertem Licht ist für die Diagnose und Behandlung von Kristallarthritis (z. B. Gicht und Pseudogicht) von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus deutet das Vorhandensein von Mikroorganismen auf die Diagnose einer septischen Arthritis hin.

Kalziumkristalle sind häufig in Proben, die von Patienten mit Arthrose⁶ entnommen werden. Basische Calciumphosphat (BCP)-Kristalle und CPP wurden in etwa 22 % bzw. 23 % der SF-Proben von Patienten mit Arthrose⁶ berichtet. Obwohl ihre Rolle noch unklar ist, wurden diese Kristalle mit schwereren Formen von OA⁷ in Verbindung gebracht und gelten als Epiphänomen des pathologischen Prozesses selbst. Kalziumkristalle wurden in 100 % der Gewebeproben von OA-Patienten nachgewiesen, die sich einer Knieprothese unterzogen haben⁸. Darüber hinaus wurde die Hypothese aufgestellt, dass Kalziumkristalle aufgrund ihrer entzündlichen Wirkung an der Pathogenese der Arthrose beteiligt sein könnten, was durch mehrere Studien⁹ nachgewiesen und zumindest teilweise durch das NLRP3-Inflammasom¹⁰ vermittelt wurde.

In jüngerer Zeit wurden Kalziumkristalle sowohl im Früh- als auch im Spätstadium⁶ der Arthrose beschrieben, was darauf hindeutet, dass sie eine wichtige Rolle bei der Diagnose verschiedener klinischer Untergruppen von Arthrose und der pharmakologischen Behandlung spielen könnten.

Das übergeordnete Ziel der SF-Analyse ist zweierlei: die Bestimmung des Entzündungsgrades der SF und die Diagnose von Kristall- oder septischer Arthritis durch die Identifizierung spezifischer Kristalle oder Mikroorganismen. Es ist ein besonders nützliches, einfaches und zuverlässiges Werkzeug bei der Diagnose von Arthrose, da es ein typisches nicht-inflammatorisches Muster mit einem sehr geringen Prozentsatz oder Abwesenheit von Neutrophilen aufweist.

Vorteile gegenüber alternativen Techniken
Die SF-Analyse besteht aus einfachen Verfahren, die die Gesamt- und Differentialleukozytenzahl und die Kristallsuche umfassen. Die manuelle Zellzählung durch erfahrene Labortechniker ^3,11 ist nach wie vor der Goldstandard für die zytologische Analyse von Synovialflüssigkeiten und anderen Körperflüssigkeiten. Aufgrund der zeitaufwändigen Beschränkung und der Variabilität zwischen und innerhalb der Beobachter dieser Methode haben automatisierte Zellzähler jedoch nach und nach die manuelle Zählung in großen klinischen Routinelabors ersetzt, in denen Blut- und Urinanalysatoren für die SF-Analyse angepasst wurden^11,12. Nichtsdestotrotz bietet die manuelle Zählung in bestimmten Situationen einige Vorteile: (1) im ambulanten Bereich, um rechtzeitig einen Gesamt- und differentiellen Leukozytenwert zu erhalten; (2) Zelltypen wie zytophagozytäre mononukleäre (Reiter) Zellen oder nicht-hämatopoetische Zellen wie Synoviozyten zu identifizieren, die automatisierte Zähler nicht erkennen können; (3) wenn die Probe zu klein ist, um vom Gerät gehandhabt zu werden; (4) Einrichtung von lokalen Laborregistern, die für Forschungszwecke leicht zugänglich sind. Ein weiterer Vorteil der manuellen Zählung ist die Insupravital-Färbung, eine Methode, die eine sehr schnelle und unmittelbare Differenzierung von Zellen nach der Glasobjektträgerpräparation ermöglicht. Im Gegensatz dazu erfordern herkömmliche Färbeverfahren, wie z. B. das Wright- und das May-Grünwald-Giemsa-Verfahren, luftgetrocknete SF-Abstriche und Zeit zum Färben der Zellen¹³. Obwohl diese Färbemethoden nicht für zeitkritische Routineanalysen geeignet sind, zeigen sie detailliertere Zellpopulationen in der Probe, darunter Erythrozyten, Basophile, Eosinophile, polymorphkernige Leukozyten, Lymphozyten und Blutplättchen.

Schließlich wird die routinemäßige SF-Analyse für Kristalle mit einer einfachen Technik durchgeführt, die auf der Polarisationsmikroskopie basiert und schnelle Ergebnisse liefert¹⁴. Alternative Methoden wie Raster- und Elektronenmikroskopie liefern genauere und empfindlichere Ergebnisse, deren Einsatz im klinischen Alltag jedoch aufgrund der hohen Kosten und der zeitaufwändigen Probenvorbereitung und -analyse nicht realisierbar ist.

Protokoll

Das vorliegende Protokoll entspricht den Richtlinien der Ethikkommission des Universitätskrankenhauses Padua. SF wurde mit Einverständnis des Patienten aus den Kniegelenken von Patienten entnommen, die eine therapeutische Arthrozentese für Gelenkergüsse bei der Erstvorstellung in der Klinik oder als Reaktion auf einen arthritischen Schub erhielten. Kontraindikationen für den Eingriff waren: Gerinnungsstörungen, gerinnungshemmende Medikamente, Hautläsionen, Dermatitis oder Cellulitis über dem Gelenk. Alle SF-Proben wurden deidentifiziert.

1. Vorbereitung der Synovialflüssigkeit

1. Die bei der Arthrozentese der geschwollenen Gelenke¹⁵ entnommenen SF-Proben werden in ein Röhrchen mit Antikoagulans (vorzugsweise EDTA; siehe Materialtabelle) und in ein zweites Röhrchen ohne Zusatzstoffe überführt (1).
2. Bei Verdacht auf eine Infektion wird ein Teil der SF-Probe (~ 1 ml) zur mikrobiologischen Untersuchung aseptisch in Kulturflaschen umgefüllt.
   HINWEIS: Der Verdacht auf eine Infektion kann sowohl aufgrund klinischer Merkmale (schwerer Tumor, Dolor, Calor, functio laesa und manchmal Fieber) als auch aufgrund des makroskopischen Erscheinungsbildes der SF (Trübung, Farbe) bestehen. In diesem Fall verordnet der Arzt eine mikrobiologische Analyse, die von einem mikrobiologischen Labor durchgeführt wird.
3. Führen Sie eine SF-Analyse (Schritte 2-5) durch, sobald die Probe entnommen ist.

2. Makroskopische Untersuchung

HINWEIS: Die makroskopische Bewertung von SF-Proben besteht aus subjektiven, qualitativen und semiquantitativen Bewertungen. Es gibt keine Referenzstandardskalen und es werden keine Kontrollproben verwendet.

1. Kommentieren Sie das SF-Volumen, ausgedrückt in Millilitern. Definieren Sie die Farbe des Musters, die von blass bis dunkelgelb reichen kann. Zeichnen Sie das Vorhandensein von Blut auf.
2. Definieren Sie den Grad der Klarheit, indem Sie die Probe im Gegenlicht beobachten und bestimmen, wie leicht eine gedruckte Seite durch den Flüssigkeitsschlauch gelesen werden kann (Abbildung 2A).
3. Beurteilen Sie die Viskosität, indem Sie die Probe aus einer Einwegpipette tropfen lassen. Eine lange Faden- oder Tropfenbildung weist auf eine gute bzw. schlechte Viskosität hin (Abbildung 2B).
4. Beurteilen Sie das Vorhandensein von partikulären Materialien, einschließlich Gewebefragmenten oder Fibrin, indem Sie die Probe durch das Röhrchen und im Gegenlicht beobachten.

3. Mikroskopische Untersuchung

HINWEIS: Die mikroskopische SF-Analyse besteht aus einer zytologischen Untersuchung, einschließlich der Gesamt- und Differentialzahl der weißen Blutkörperchen (WBC) und der Suche nach Kristallen.

1. Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Leukozyten in der SF, die im EDTA-Röhrchen gesammelt wurden, mit einem Hämozytometer (siehe Materialtabelle).
   2. Entnahme von 0,5 μl SF aus dem EDTA-Röhrchen mit einer Malassez-Potain-Pipette (Markierung 0,5; siehe Materialtabelle) (ergänzende Abbildung 1). Entnehmen Sie mit derselben Pipette 9,5 μl 0,1%ige Methylenblaulösung (Markierung 11). Die Endverdünnung beträgt das 20-fache.
   3. Mischen Sie die Pipette durch sanfte Inversion, verwerfen Sie die ersten Tropfen und gießen Sie die Synovialflüssigkeit + Methylenblaulösung in die Zählkammer.
   4. Zählen Sie die Zellen in zwei aufeinanderfolgenden Quadraten von neun und multiplizieren Sie die erhaltene Zahl mit 100 (vereinfachte Formel; Ergänzende Abbildung 2). Drücken Sie Leukozyten als Anzahl der Leukozyten pro Kubikmillimeter aus.
      HINWEIS: Vereinfachte Formel: Leukozyten (N/mm³) = die Anzahl der gezählten Zellen in zwei aufeinanderfolgenden Quadraten x 100.
   5. Klassifizieren Sie die SF nach der Gesamtzahl der Leukozyten nach den zuvor veröffentlichten Berichten^16,17 (Tabelle 1).
2. Führen Sie eine differentielle Zellzählung durch.
   1. Bestimmen Sie den prozentualen Anteil an polymorphkernigen (PMN) Zellen, Monozyten und Lymphozyten mittels supravitaler oder herkömmlicher Färbung^13,18.
   2. Für die supravitale Färbung geben Sie einen kleinen Tropfen SF in die Mitte eines gebrauchsfertigen Objektträgers, der mit Kresylviolett und Methylenblau vorbeschichtet ist (ergänzende Abbildung 3; siehe Materialtabelle).
   3. Mit einem Deckglas abdecken und einen Tropfen Mikroskop-Immersionsöl aufgeben.
   4. Bereiten Sie einen luftgetrockneten SF-Abstrich für die herkömmliche Färbung vor (weniger geeignet für die Routineanalyse). Geben Sie einen kleinen Tropfen SF an das Ende einer sauberen Folie. Verteilen Sie es mit einem zweiten Objektträger oder einem Deckglas mit einer Vorwärtsbewegung entlang des Objektträgers. Lassen Sie den Abstrich an der Luft trocknen.
   5. Färben Sie die Probe nach einem Standardverfahren von May-Grünwald-Giemsa¹⁸.
   6. Untersuchen Sie den Objektträger unter dem Ölimmersionsobjektiv (1.000x).
   7. Zählen Sie 100 aufeinanderfolgende Zellen und unterscheiden Sie zwischen polymorphkernigen Zellen, Monozyten und Lymphozyten (Abbildung 3, ergänzende Abbildung 4).
   8. Geben Sie die Gesamtzahl in jeder Kategorie als Prozentsatz an.
      Anmerkungen: Um genaue Ergebnisse zu erhalten, müssen zytologische Untersuchungen durchgeführt werden, sobald die SF entnommen wird, oder innerhalb von 24-48 Stunden nach der Arthrozentese, wenn sie ordnungsgemäß gelagert wird (4 °C).

4. Kristall-Detektion

1. Bestimmen Sie das Vorhandensein pathologischer Kristalle mit einem Polarisationsmikroskop, das mit einem zusätzlichen Polarisationsfilter und einem Rotkompensator¹⁹ ausgestattet ist (siehe Materialtabelle).
2. Führen Sie die Objektträgervorbereitung für die Kristalldetektion durch.
   1. Reinigen Sie einen Objektträger vorsichtig mit optischem Papier oder weichem Papier, das mit Ethanol getränkt ist. Tragen Sie einen kleinen Tropfen SF auf den Objektträger auf.
   2. Decken Sie den Objektträger mit einem Deckglas ab und legen Sie ihn unter das Mikroskop.
3. Identifiziere die Kristalle.
   1. Fokussieren Sie den Objektträger unter dem Mikroskop mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung. Untersuchen Sie den Objektträger sorgfältig unter einem hellen Feld mit einem 40x-Objektiv. Schauen Sie innerhalb und außerhalb der Zellen.
   2. Identifizieren Sie die Kristalle anhand ihrer Größe und Form (z. B. rautenförmig, nadelförmig, stäbchenförmig).
   3. Setzen Sie den Polarisationsfilter zwischen der Lichtquelle und der Probe ein. Drehen Sie den Polarisator, bis seine optische Achse senkrecht zum Analysator steht (über den Objektiven), um einen dunklen Hintergrund zu erzeugen.
   4. Sobald ein doppelbrechender Kristall identifiziert wurde, setzen Sie den Kompensator zwischen Polarisator und Probe ein und bewegen Sie ihn parallel oder senkrecht zur optischen Achse des Kristalls.
   5. Beobachten Sie die Farbe, die der Kristall zeigt (Tabelle 2).
      HINWEIS: MSU-Kristalle erscheinen nadelförmig, hell doppelbrechend im Dunkelfeld und zeigen eine gelbe/orange Farbe, wenn ihre Achse parallel zum Kompensator verläuft. Umgekehrt sind sie blau, wenn sie senkrecht positioniert sind (negatives Vorzeichen) (Tabelle 2; Abbildung 4). CPP-Kristalle sind stäbchen- oder rautenartige Kristalle, die unter polarisiertem Licht schwach doppelbrechend sind und eine blaue oder gelbe Farbe aufweisen, wenn sie parallel bzw. senkrecht zur Achse des Kompensators ausgerichtet sind (positives Vorzeichen) (Tabelle 2; Abbildung 5).

5. Alizarin-Rotfärbung

1. Bereiten Sie eine 2%ige Lösung von Alizarinrot S (pH 4,1-4,3) vor, filtern Sie die Lösung durch einen 0,22-μm-Filter und lagern Sie sie lichtgeschützt.
   1. Mischen Sie zur Vorbereitung des Objektträgers einen Tropfen SF mit dem gleichen Volumen Alizarinrotlösung (1:1) auf einem sauberen Objektträger. Mit einem Deckglas abdecken und bei 400-facher Vergrößerung untersuchen.
   2. Identifiziere die Kristalle unter dem Mikroskop.
      Anmerkungen: Der Test ist positiv, wenn helle, dunkelrote Ausscheidungen unter Durchlicht mit runder Form und konzentrischen Schichten sichtbar sind. Unter polarisiertem Licht erscheinen sie stark doppelbrechend²⁰ (Abbildung 6).

Ergebnisse

Große Gelenke, die von Arthrose betroffen sind, sind oft geschwollen und produzieren erhebliche Mengen an SF, die über eine Arthrozentese abgeleitet werden¹⁵. Zu den makroskopischen Merkmalen der SF, die unmittelbar nach der Arthrozentese ausgewertet werden, gehören im Wesentlichen die Menge, Farbe, Klarheit und Viskosität¹⁷. Trotz ihrer geringen Spezifität liefern sie vorläufige Daten über den Grad der Entzündung. Die Farbe hängt von der SF-Zellularität ...

Diskussion

Bei der Arthrose hilft die SF-Analyse bei der Definition von Krankheitsmerkmalen durch einfache Schritte: Gesamt- und Differentialleukozytenzahl und Suche nach Kristallen, einschließlich CPP und BCP. Darüber hinaus kann der Nachweis von MSU-Kristallen wichtige Komorbiditäten aufzeigen.

Trotz der geringen Kosten und der einfachen Ausführung kann die Sensibilität der Tests und die Zuverlässigkeit der Ergebnisse durch unerfahrene Analysten beeinträchtigt werden - vor allem, wenn es um die ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin red S	Merck	A5533	For BCP crystal search
Burker chamber	Merck	BR718905	For total white blood cell count
Cover glasses	Merck	C7931	For microscopic examination
EDTA tubes	BD	368861	For SF collection
Glass slides	Merck	S8902	For crystal search
Lambda filter (compensator)	Any	Refer to microscope company	For crystal identification
Malassez-Potain pipette	Artiglass	54830000	For dilution of synovial fluid
Methylene blue solution	Merck	3978	For total white blood cell count
Polarized microscope	Leica, Nikon, others	Depending on the model and company	For complete synovial fluid analysis
Polarizing lens	Any	Refer to microscope company	For crystal identification
Testsimplet	Waldeck	14386	Supravital staining for cell differentiation