Análise do líquido sinovial para identificar osteoartrite

Resumo

A análise do líquido sinovial sob microscopia de luz transmitida, polarizada e compensada é usada para avaliar a natureza inflamatória ou não inflamatória de uma amostra através de etapas simples. É particularmente útil na osteoartrite para detectar cristais de cálcio e identificar um subgrupo mais grave de osteoartrite.

Resumo

A análise do líquido sinovial (FS) é importante no diagnóstico da osteoartrite (OA). Características macroscópicas e microscópicas, incluindo contagem total e diferencial de leucócitos, ajudam a definir a natureza não inflamatória da FS, que é uma característica da OA. Em pacientes com OA, leucócitos em amostras de SF geralmente não excede 2000 células por microlitro, e a porcentagem de células inflamatórias, como neutrófilos, é muito baixa ou ausente. Cristais de cálcio são frequentes em FS coletadas de pacientes com OA. Embora seu papel na patogênese da OA ainda não esteja claro, eles têm sido associados a um processo inflamatório leve e a uma progressão mais grave da doença. Recentemente, cristais de cálcio têm sido descritos tanto na fase precoce quanto na tardia da OA, indicando que eles podem desempenhar um papel vital no diagnóstico de diferentes subgrupos clínicos de OA e no tratamento farmacológico. O objetivo geral da análise de DC na OA é duplo: verificar o grau não inflamatório de DC e destacar a presença de cristais de cálcio.

Introdução

A osteoartrite (OA) é uma doença articular crônica complexa e multifatorial, com prevalência global combinada estimada de 16% em indivíduos com 15 anos ou mais e 23% em indivíduos com 40 anos ou mais¹. Espera-se que a incidência de OA aumente devido ao envelhecimento da população e ao aumento de fatores de risco, como obesidade e síndrome^metabólica2.

Entre os principais problemas associados à OA estão a dificuldade no diagnóstico da doença em seus estágios iniciais e os tratamentos atualmente disponíveis limitados ao controle da dor e aos medicamentos sintomáticos de ação lenta (SYSADOAs), como os glicosaminoglicanos. O diagnóstico da OA baseia-se nos sintomas clínicos e nos achados de imagem. No entanto, a falta de correlação entre as duas avaliações pode causar anos de atraso no diagnóstico da OA e no início do tratamento². A OA é caracterizada por processos degenerativos e inflamação de baixo grau, que podem ser facilmente investigados por meio da análise do líquido sinovial (FS). A SF é um dialisato plasmático viscoso rico em ácido hialurônico, que lubrifica o espaço articular, fornece nutrientes e oxigênio à cartilagem e remove resíduos metabólicos. O SF também atua como amortecedor, protegendo as articulações durante o estresse e a deformação³.

A análise das DC é um método simples e confiável, que deve ser sempre realizado durante a avaliação inicial de pacientes com sintomas musculoesqueléticos e derrames^articulares3. Recomendações do American College of Rheumatology, da British Society for Rheumatology e outras incluem a análise de FS entre os testes diagnósticos para doenças reumáticas que devem ser realizados principalmente na avaliação da monoartrite^aguda4,5. As contagens totais e diferenciais de leucócitos obtidas a partir da análise de DC fornecem um instantâneo do processo patológico que ocorre na articulação, classificando assim o grau de inflamação. A identificação de cristais patogênicos, como urato monossódico (MSU) e pirofosfato de cálcio (CPP), sob luz polarizada, é vital no diagnóstico e tratamento da artrite cristalina (por exemplo, gota e pseudogota). Além disso, a presença de microrganismos sugere o diagnóstico de artrite séptica.

Cristais de cálcio são frequentes em amostras coletadas de pacientes com^OA6. Cristais básicos de fosfato de cálcio (BCP) e PPC foram relatados em aproximadamente 22% e 23% das amostras de SF, respectivamente, de pacientes com OA⁶. Embora seu papel ainda não esteja claro, esses cristais têm sido associados a formas mais graves de OA⁷ e são considerados um epifenômeno do próprio processo patológico. Cristais de cálcio foram detectados em 100% das amostras teciduais de pacientes com OA submetidos a artroplastia de joelho⁸. Além disso, foi levantada a hipótese de que cristais de cálcio possam estar envolvidos na patogênese da OA devido aos seus efeitos inflamatórios, demonstrados por vários estudos⁹ e mediados, pelo menos em parte, pelo inflamassoma NLRP3¹⁰.

Mais recentemente, cristais de cálcio têm sido descritos em estágios iniciais e tardios⁶ da OA, indicando que eles podem desempenhar um papel vital no diagnóstico de diferentes subgrupos clínicos de OA e no tratamento farmacológico.

O objetivo geral da análise de DC é duplo: determinar o grau inflamatório de DC e diagnosticar artrite cristalina ou séptica por meio da identificação de cristais ou micro-organismos específicos. É uma ferramenta particularmente útil, simples e confiável no diagnóstico da OA, devido ao padrão não inflamatório típico com uma porcentagem muito baixa ou ausência de neutrófilos.

Vantagens sobre técnicas alternativas
A análise de FF consiste em procedimentos simples que incluem contagem total e diferencial de leucócitos e busca de cristais. A contagem manual de células realizada por técnicos de laboratório especializados ^3,11 continua sendo o padrão-ouro para a análise citológica de fluidos sinoviais e outros fluidos corporais. No entanto, devido à limitação demorada e à variabilidade inter e intraobservador desse método, os contadores automáticos de células têm gradualmente substituído a contagem manual em grandes laboratórios clínicos de rotina, onde analisadores de sangue e urina foram adaptados para permitir a análise de FS^11,12. No entanto, a contagem manual apresenta algumas vantagens em configurações específicas: (1) no ambulatório, para obter um valor total e diferencial de leucócitos no tempo; (2) identificar tipos celulares como células mononucleares citofagocíticas (Reiter) ou células não hematopoiéticas como sinoviócitos, que contadores automatizados não conseguem reconhecer; (3) quando a amostra é muito pequena para ser manipulada pelo instrumento; (4) criar registros laboratoriais locais de fácil acesso para fins de pesquisa. Outra vantagem da contagem manual é a coloração insupravital, um método que permite a diferenciação das células de forma muito rápida e imediata após a preparação da lâmina de vidro. Por outro lado, colorações tradicionais, como as de Wright e May-Grünwald-Giemsa, requerem esfregaços de SF secos ao ar e tempo para corar as células¹³. Embora não sejam adequados para análises de rotina sensíveis ao tempo, esses métodos de coloração revelam populações celulares mais detalhadas na amostra, incluindo eritrócitos, basófilos, eosinófilos, leucócitos polimorfonucleares, linfócitos e plaquetas.

Finalmente, a análise rotineira de SF para cristais é realizada por meio de uma técnica simples baseada em microscopia de luz polarizada, que proporciona resultados rápidos¹⁴. Métodos alternativos, como a microscopia de varredura e a microscopia eletrônica, produzem resultados mais precisos e sensíveis, mas seu uso na prática clínica diária não é viável devido aos altos custos e ao demorado preparo e análise das amostras.

Protocolo

O presente protocolo está de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética do Hospital Universitário de Padova. A DC foi coletada com o consentimento do paciente das articulações do joelho de pacientes que receberam artrocentese terapêutica para derrame articular em sua apresentação inicial à clínica ou em resposta a um surto artrítico. As contraindicações ao procedimento foram: coagulopatia, medicações anticoagulantes, lesões cutâneas, dermatite ou celulite sobrejacente à articulação. Todas as amostras de DC foram desidentificadas.

1. Preparação do líquido sinovial

1. Transfira as amostras de FS coletadas durante a artrocentese de articulações inchadas¹⁵ para um tubo contendo anticoagulante (preferencialmente EDTA; ver Tabela de Materiais) e para um segundo tubo sem aditivo (Figura 1).
2. Em casos suspeitos de infecção, transferir assepticamente uma parte da amostra de SF (~ 1 mL) para frascos de cultura para testes microbiológicos.
   NOTA: A infecção pode ser suspeitada como resultado de ambas as características clínicas (tumor grave, dolor, calor, functio laesa e, às vezes, febre) e aparência macroscópica da SF (turbidez, cor). Neste caso, o médico prescreve uma análise microbiológica, que é realizada por um laboratório de microbiologia.
3. Realizar análise de SF (etapas 2-5) assim que a amostra for coletada.

2. Exame macroscópico

OBS: A avaliação macroscópica das amostras de DC consiste em avaliações subjetivas, qualitativas e semiquantitativas. Não existem escalas padrão de referência e não são utilizadas amostras-controle.

1. Anote o volume de DC expresso em mililitros. Defina a cor da amostra, que pode variar de amarelo pálido a amarelo escuro. Registre a presença de sangue.
2. Defina o grau de clareza observando a amostra na luz de fundo e determinando a facilidade de leitura de uma página impressa através do tubo de fluido (Figura 2A).
3. Avalie a viscosidade gotejando a amostra de uma pipeta descartável. Uma longa formação de corda ou gota indica boa ou baixa viscosidade, respectivamente (Figura 2B).
4. Avaliar a presença de materiais particulados, incluindo fragmentos de tecido ou fibrina, observando a amostra através do tubo e na luz de fundo.

3. Exame microscópico

NOTA: A análise microscópica do SF consiste em exame citológico, incluindo contagens totais e diferenciais de leucócitos e pesquisa de cristais.

1. Determine a contagem total de células seguindo as etapas abaixo.
   1. Determinar o número total de leucócitos nas FF coletadas no tubo de EDTA usando um hemocitômetro (ver Tabela de Materiais).
   2. Extrair 0,5 μL do SF do tubo de EDTA utilizando uma pipeta Malassez-Potain (marca 0.5; ver Tabela de Materiais) (Figura Suplementar 1). Com a mesma pipeta, extrair 9,5 μL de solução de azul de metileno a 0,1% (marca 11). A diluição final é de 20 vezes.
   3. Misture a pipeta por inversão suave, descarte as primeiras gotas e despeje o líquido sinovial + solução de azul de metileno na câmara de contagem.
   4. Conte as células em dois quadrados consecutivos de nove e multiplique o número obtido por 100 (fórmula simplificada; Figura Suplementar 2). Expresse leucócitos como o número de leucócitos por milímetro cúbico.
      NOTA: Fórmula simplificada: Leucócitos (N/mm³) = o número de células contadas em dois quadrados consecutivos x 100.
   5. Classificar as DC de acordo com o número total de leucócitos após relatos previamente publicados^16,17 (Tabela 1).
2. Execute a contagem diferencial de células.
   1. Determinar a porcentagem de células polimorfonucleares (PMN), monócitos e linfócitos usando coloração supravital ou tradicional^13,18.
   2. Para coloração supravital, colocar uma pequena gota de SF no centro de uma lâmina pronta para uso pré-revestida com violeta cresil e azul de metileno (Figura Suplementar 3; ver Tabela de Materiais).
   3. Cubra com uma lamínula e coloque uma gota de óleo de imersão do microscópio.
   4. Prepare um esfregaço SF seco ao ar para coloração tradicional (menos adequado para análise de rotina). Coloque uma pequena gota de SF no final de um slide limpo. Usando um segundo slide ou um deslizamento, espalhe-o ao longo do slide com um movimento para frente. Deixe a mancha secar ao ar.
   5. Manchar a amostra de acordo com um procedimento padrão de May-Grünwald-Giemsa¹⁸.
   6. Examine a lâmina sob a objetiva de imersão em óleo (1.000x).
   7. Contar 100 células consecutivas e distinguir entre polimorfonucleares, monócitos e linfócitos (Figura 3, Figura 4 Suplementar).
   8. Expresse o número total em cada categoria como uma porcentagem.
      NOTA: Para obter resultados precisos, os exames citológicos devem ser realizados assim que a DC é coletada ou dentro de 24-48 h da artrocentese quando adequadamente armazenada (4 °C).

4. Detecção de cristais

1. Determinar a presença de cristais patológicos usando um microscópio de luz polarizada equipado com um filtro polarizador adicional e um compensador vermelho¹⁹ (ver Tabela de Materiais).
2. Execute a preparação da lâmina para detecção de cristais.
   1. Limpe cuidadosamente uma lâmina de vidro com papel óptico ou papel macio embebido com etanol. Aplique uma pequena gota de SF sobre a lâmina de vidro.
   2. Cubra com uma lamínula e coloque a lâmina sob o microscópio.
3. Identifique os cristais.
   1. Focalize a lâmina sob o microscópio usando uma objetiva de ampliação de baixa potência. Examine cuidadosamente o slide sob um campo brilhante com uma objetiva de 40x. Olhe para dentro e para fora das celas.
   2. Identifique os cristais de acordo com seu tamanho e forma (por exemplo, romboidal, em forma de agulha, em forma de haste).
   3. Insira o filtro polarizador entre a fonte de luz e a amostra. Gire o polarizador até que seu eixo óptico esteja perpendicular ao analisador (colocado acima das objetivas) para criar um fundo escuro.
   4. Uma vez identificado um cristal birrefringente, insira o compensador entre o polarizador e o espécime e mova-o paralelo ou perpendicularmente ao eixo óptico do cristal.
   5. Observe a cor revelada pelo cristal (Tabela 2).
      NOTA: Os cristais MSU aparecem em forma de agulha, brilhantemente birrefringentes no campo escuro e exibem uma cor amarela/laranja quando seu eixo é paralelo ao compensador. Por outro lado, são azuis quando posicionadas perpendicularmente (sinal negativo) (Tabela 2; Gráfico 4). Os cristais de PPC são cristais em bastonete ou romboides, fracamente birrefringentes sob luz polarizada, e apresentam coloração azul ou amarela quando alinhados paralelos ou perpendiculares ao eixo do compensador (sinal positivo), respectivamente (Tabela 2; Gráfico 5).

5. Coloração vermelha de alizarina

1. Preparar uma solução a 2% de vermelho de alizarina S (pH 4,1-4,3), filtrar a solução através de um filtro de 0,22 μm e armazená-la longe da luz.
   1. Para preparar a lâmina, misture uma gota de SF com o mesmo volume de solução vermelha de alizarina (1:1) em uma lâmina limpa. Cubra com uma lamínula e examine com uma ampliação de 400x.
   2. Identifique os cristais ao microscópio.
      NOTA: O teste é positivo quando precipitados vermelho-escuros brilhantes são visíveis sob luz transmitida, com uma forma redonda e camadas concêntricas. Sob luz polarizada, apresentam-se fortemente birrefringentes20 (Figura 6).

Resultados

Grandes articulações afetadas pela OA são frequentemente inchadas e produzem quantidades significativas de FS, que são drenadas por artrocentese¹⁵. As características macroscópicas das DC avaliadas imediatamente após a artrocentese incluem essencialmente a quantidade, cor, claridade e viscosidade¹⁷. Apesar de sua baixa especificidade, eles fornecem dados preliminares sobre o grau de inflamação. A cor depende da celularidade do SF e do grau de fragmentaçã...

Discussão

Na OA, a análise das DC ajuda a definir as características da doença por meio de etapas simples: contagem total e diferencial de leucócitos e pesquisa de cristais, incluindo PPC e BCP. Além disso, a detecção de cristais de MSU pode evidenciar comorbidades importantes.

Apesar dos baixos custos e da simples execução, a sensibilidade dos testes e a confiabilidade dos resultados podem ser afetadas devido à inexperiência dos analistas, principalmente no que se refere à identificação d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin red S	Merck	A5533	For BCP crystal search
Burker chamber	Merck	BR718905	For total white blood cell count
Cover glasses	Merck	C7931	For microscopic examination
EDTA tubes	BD	368861	For SF collection
Glass slides	Merck	S8902	For crystal search
Lambda filter (compensator)	Any	Refer to microscope company	For crystal identification
Malassez-Potain pipette	Artiglass	54830000	For dilution of synovial fluid
Methylene blue solution	Merck	3978	For total white blood cell count
Polarized microscope	Leica, Nikon, others	Depending on the model and company	For complete synovial fluid analysis
Polarizing lens	Any	Refer to microscope company	For crystal identification
Testsimplet	Waldeck	14386	Supravital staining for cell differentiation