変形性関節症を特定するための滑液分析

要約

透過光、偏光顕微鏡、および補償光顕微鏡下での滑液分析は、サンプルの炎症性または非炎症性を簡単なステップで評価するために使用されます。変形性関節症において、カルシウム結晶を検出し、変形性関節症のより重篤なサブセットを特定することは特に有用である。

要約

滑液(SF)分析は、変形性関節症(OA)の診断に重要です。白血球(WBC)の総数および差次数を含む巨視的および微視的特徴は、OAの特徴であるSFの非炎症性を定義するのに役立ちます。OA患者では、SFサンプル中のWBCは通常、マイクロリットルあたり2000細胞を超えず、好中球などの炎症細胞の割合は非常に低いか存在しない。カルシウム結晶は、OA患者から採取されたSFにおいて頻繁に存在する。OAの病因におけるそれらの役割は不明のままであるが、それらは軽度の炎症過程およびより重篤な疾患進行と関連している。最近、カルシウム結晶はOAの初期段階と後期段階の両方で報告されており、OAおよび薬理学的治療のさまざまな臨床サブセットの診断に重要な役割を果たす可能性があることを示しています。OAにおけるSF分析の全体的な目標は、SFの非炎症度を確認することと、カルシウム結晶の存在を強調することの2つです。

概要

変形性関節症(OA)は複雑で多因子性の慢性関節疾患であり、15歳以上の被験者では16%、40歳以上の被験者では23%と推定^{されています1。}高齢化や肥満やメタボリックシンドロームなどの危険因子の増加により、OAの発生率は増加すると予想されます²。

OAに関連する主な問題の中には、病気の初期段階での診断の難しさと、現在利用可能な治療法は、疼痛管理とグリコサミノグリカンなどの対症療法遅効薬(SYSADOA)に限定されています。OAの診断は、臨床症状と画像所見に基づいています。ただし、2つの評価の間に相関関係がないため、OA診断と治療開始が何年も遅れ^{る可能性があります2。}OAは、変性プロセスと軽度の炎症を特徴とし、滑液(SF)分析 によって 簡単に調査できます。SFは、ヒアルロン酸が豊富な粘性のある血漿透析液で、関節腔を滑らかにし、軟骨に栄養素と酸素を供給し、代謝老廃物を取り除きます。SFはショックアブソーバーとしても機能し、応力とひずみ³の間に関節を保護します。

SF分析はシンプルで信頼性の高い方法であり、筋骨格系症状と関節滲出液のある患者の初期評価中に常に実行する必要があります³。米国リウマチ学会、英国リウマチ学会などからの提言には、主に急性単関節炎の評価で行わなければならないリウマチ性疾患の診断検査の中にSF分析が含まれています^4,5。SF分析から得られた総白血球数および差白血球数は、関節で起こる病理学的過程のスナップショットを提供し、したがって炎症の程度を分類する。偏光下での尿酸一ナトリウム(MSU)やピロリン酸カルシウム(CPP)結晶などの病原性結晶の同定は、結晶性関節炎(痛風や偽痛風など)の診断と治療に不可欠です。さらに、微生物の存在は敗血症性関節炎の診断を示唆しています。

カルシウム結晶は、^OA6の患者から収集されたサンプルで頻繁に見られます。塩基性リン酸カルシウム(BCP)結晶とCPPは、^OA6患者のSFサンプルのそれぞれ約22%と23%で報告されています。それらの役割は不明のままであるが、これらの結晶はより重篤な形態の^OA7 と関連しており、病理学的過程自体のエピフェノメナと考えられている。カルシウム結晶は、膝^{関節置換術}を受けているOA患者の組織サンプルの100%で検出されています8。さらに、カルシウム結晶は、いくつかの研究⁹ によって実証され、少なくとも部分的にNLRP3インフラマソーム¹⁰によって媒介される炎症作用のために、OAの病因に関与している可能性があるという仮説が立てられています。

最近では、カルシウム結晶がOAの初期段階と後期ステージ⁶ の両方で記載されており、OAおよび薬理学的治療のさまざまな臨床サブセットの診断に重要な役割を果たす可能性があることを示しています。

SF分析の全体的な目標は、SFの炎症度を決定することと、特定の結晶または微生物を特定することによって結晶または敗血症性関節炎を診断することです。これは、好中球の割合が非常に低いか存在しない典型的な非炎症パターンのために、OAの診断において特に有用で、シンプルで、信頼性の高いツールです。

代替技術に対する利点
SF分析は、総白血球数と差白血球数、結晶検索を含む簡単な手順で構成されています。専門の検査技師^3,11によって行われる手動細胞カウントは、滑膜および他の体液の細胞学的分析のためのゴールドスタンダードであり続けています。ただし、この方法の時間のかかる制限と観察者間および観察者内の変動性により、自動セルカウンターは、血液および尿分析装置がSF分析を可能にするように適合された大規模な日常的な臨床検査室で手動カウントに徐々に取って代わりました^11,12。それにもかかわらず、手動カウントは特定の設定でいくつかの利点を提示します:(1)外来では、時間通りに合計および差分WBC値を取得します。(2)細胞食性単核球(Reiter)細胞や滑膜細胞などの非造血細胞など、自動カウンターでは認識できない細胞型を特定すること。(3)サンプルが小さすぎて機器で処理できない場合。(4)研究目的で容易にアクセスできるローカルラボレジストリを作成すること。手動計数の別の利点は、スライドガラス調製後非常に迅速かつ即時に細胞の分化を可能にする方法であるインプラビタール染色が見られる。対照的に、ライトおよびMay-Grünwald-Giemsa手順などの従来の染色では、空気乾燥SF塗抹標本と細胞を染色する時間が必要です¹³。時間に敏感なルーチン分析には適していませんが、これらの染色法により、赤血球、好塩基球、好酸球、多形核白血球、リンパ球、血小板など、サンプル中のより詳細な細胞集団が明らかになります。

最後に、結晶の日常的なSF分析は、偏光顕微鏡に基づく簡単な技術を使用して実行され、迅速な結果が得られます¹⁴。走査型や電子顕微鏡などの代替法は、より正確で高感度な結果をもたらしますが、コストが高く、サンプルの調製と分析に時間がかかるため、日常の臨床現場での使用は現実的ではありません。

プロトコル

現在のプロトコルは、パドヴァ大学病院の倫理委員会のガイドラインに準拠しています。SFは、関節滲出液の治療的関節穿刺を受けている患者の膝関節から患者の同意を得て、クリニックへの最初の提示時または関節炎フレアに応答して収集されました。この手順に対する禁忌は、凝固障害、抗凝固薬、皮膚病変、皮膚炎、または関節を覆う蜂巣炎でした。全てのSF試料を非同定化した。

1.滑液製剤

1. 腫れた関節¹⁵ の関節穿刺中に収集されたSFサンプルを、抗凝固剤(好ましくはEDTA; 材料表を参照)を含むチューブに移し、添加剤を含まない第2のチューブに移します(図1)。
2. 感染が疑われる場合は、SFサンプルの一部(~1 mL)を微生物検査用の培養ボトルに無菌的に移します。
   注:感染は、臨床的特徴(重度の腫瘍、ドロール、カロリー、機能性、および時には発熱)とSFの肉眼的外観(濁度、色)の両方の結果として疑われる可能性があります。この場合、医師は微生物学検査室によって行われる微生物学的分析を処方する。
3. サンプルが収集されたらすぐにSF分析(ステップ2〜5)を実行します。

2.肉眼検査

注:SFサンプルの巨視的評価は、主観的、定性的、および半定量的評価で構成されています。参照標準スケールはなく、対照サンプルは使用されていません。

1. SFボリュームをミリリットルで表して注釈を付けます。サンプルの色を淡黄色から濃い黄色まで定義します。血液の存在を記録します。
2. バックライトでサンプルを観察し、流体チューブを通して印刷されたページを読みやすくすることで、明瞭度を定義します(図2A)。
3. 使い捨てピペットからサンプルを滴下して粘度を評価します。長いストリングまたはドロップ形成は、それぞれ粘度の良し悪しを示します(図2B)。
4. 組織片やフィブリンなどの粒子状物質の存在を、チューブを通して、バックライトでサンプルを観察することによって評価します。

3.顕微鏡検査

注:SF顕微鏡分析は、総白血球数および差白血球(WBC)数、および結晶の検索を含む細胞学的検査で構成されています。

1. 以下の手順に従って、合計セル数を決定します。
   1. 血球計算盤を使用して、EDTAチューブに収集されたSF中の白血球の総数を決定します( 材料の表を参照)。
   2. マラセスポテンピペットを使用してEDTAチューブから0.5 μLのSFを引き出します(マーク0.5; 材料表を参照)(補足図1)。同じピペットで、9.5 μLの0.1%メチレンブルー溶液(マーク11)を吸引します。最終希釈率は20倍です。
   3. 穏やかな反転によってピペットを混合し、最初の滴を捨て、そして滑液+メチレンブルー溶液を計数チャンバーに注ぐ。
   4. 9つのうち2つの連続した正方形のセルを数え、得られた数に100を掛けます(簡略化された式; 補足図2)。WBCを立方ミリメートルあたりの白血球数として表します。
      注:簡略化された式:白血球(N / mm³)=2つの連続した正方形でカウントされた細胞の数x 100。
   5. 以前に公開されたレポート^16,17(表1)に続くWBCの総数に従ってSFを分類します。
2. 差動セルカウントを実行します。
   1. 多形核(PMN)細胞、単球、およびリンパ球の割合を、超バイタル染色または従来の染色を使用して決定します^13,18。
   2. 超バイタル染色の場合は、クレジルバイオレットとメチレンブルーでプレコーティングされたすぐに使用できるスライドの中央にSFを1滴ずつ置きます(補足図3; 材料表を参照)。
   3. カバーガラスで覆い、顕微鏡浸漬油を一滴入れます。
   4. 従来の染色用に風乾SF塗抹標本を準備します(日常的な分析にはあまり適していません)。きれいなスライドの最後にSFを少し落とします。2番目のスライドまたはカバーガラスを使用して、前方に動かしてスライドに沿って広げます。塗抹標本を風乾させます。
   5. 標準的なMay-Grünwald-Giemsa手順¹⁸に従ってサンプルを染色します。
   6. 油浸対物レンズ(1,000x)の下のスライドを確認します。
   7. 100個の連続した細胞を数え、多形核細胞、単球、およびリンパ球を区別します(図3、 補足図4)。
   8. 各カテゴリの合計数をパーセンテージで表します。
      注意: 正確な結果を得るには、SFが収集されたらすぐに、または適切に保管された場合(24°C)は関節穿刺から48〜4時間以内に細胞学的検査を実施する必要があります。

4.結晶検出

1. 追加の偏光フィルターと赤色補償器¹⁹ を備えた偏光顕微鏡を使用して病理学的結晶の存在を決定します( 材料表を参照)。
2. 結晶検出のためのスライド準備を行います。
   1. スライドガラスを光学紙またはエタノールで吸収した柔らかい紙で慎重に洗浄します。スライドガラスにSFを少し垂らします。
   2. カバーガラスで覆い、スライドを顕微鏡の下に置きます。
3. 結晶を特定します。
   1. 顕微鏡下でスライドの焦点を合わせ、低倍率の対物レンズを使用します。40倍の対物レンズを備えた明視野の下でスライドを注意深く調べます。セルの内側と外側を見てください。
   2. 結晶のサイズと形状(菱形、針形、棒形など)に従って結晶を識別します。
   3. 光源と試料の間に偏光フィルターを挿入します。偏光子の光軸がアナライザーに対して垂直になるまで回転させ(対物レンズの上に配置)、暗い背景を作成します。
   4. 複屈折結晶が特定されたら、偏光子と試料の間に補償器を挿入し、結晶の光軸に対して平行または垂直に動かします。
   5. 結晶によって明らかにされた色を観察します(表2)。
      注:MSU結晶は針状に見え、暗視野では明るく複屈折し、軸が補償器と平行な場合は黄色/オレンジ色を示します。逆に、垂直(負の符号)に配置すると青色になります(表2; 図4)。CPP結晶は棒状または菱形の結晶で、偏光下では複屈折が弱く、補償器の軸に対して平行または垂直に整列すると青色または黄色を示します(正の符号)。 図5)。

5.アリザリンレッド染色

1. アリザリンレッドS(pH 4.1-4.3)の2%溶液を調製し、0.22μmのフィルターで溶液をろ過し、光から離して保管します。
   1. スライドを準備するには、きれいなスライドでSFの滴を同量のアリザリンレッド溶液(1:1)と混合します。カバーガラスで覆い、400倍の倍率で調べます。
   2. 顕微鏡で結晶を特定します。
      注意: 明るい暗赤色の沈殿物が透過光の下で、丸い形状と同心円状の層で見える場合、テストは陽性です。偏光下では、それらは強く複屈折²⁰に見える(図6)。

結果

OAの影響を受けた大きな関節はしばしば腫れ、かなりの量のSFを生成し、関節穿刺 によって 排出されます¹⁵。関節穿刺直後に評価されるSFの巨視的特徴には、本質的に量、色、透明度、および粘度が含まれます¹⁷。それらの低い特異性にもかかわらず、それらは炎症の程度に関する予備データを提供する。色は、SF細胞性および細胞外マトリックス高?...

ディスカッション

OAでは、SF分析は、総白血球数と差白血球数、CPPやBCPなどの結晶の検索という簡単なステップで疾患の特徴を定義するのに役立ちます。さらに、MSU結晶の検出は、重要な併存疾患を浮き彫りにする可能性があります。

低コストで簡単な実行にもかかわらず、主に結晶の同定に関連するため、経験の浅いアナリストのために、テストの感度と結果の信頼性が影響を受ける可?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin red S	Merck	A5533	For BCP crystal search
Burker chamber	Merck	BR718905	For total white blood cell count
Cover glasses	Merck	C7931	For microscopic examination
EDTA tubes	BD	368861	For SF collection
Glass slides	Merck	S8902	For crystal search
Lambda filter (compensator)	Any	Refer to microscope company	For crystal identification
Malassez-Potain pipette	Artiglass	54830000	For dilution of synovial fluid
Methylene blue solution	Merck	3978	For total white blood cell count
Polarized microscope	Leica, Nikon, others	Depending on the model and company	For complete synovial fluid analysis
Polarizing lens	Any	Refer to microscope company	For crystal identification
Testsimplet	Waldeck	14386	Supravital staining for cell differentiation