골관절염을 식별하기 위한 활액 분석

요약

투과, 편광 및 보상 광 현미경 하에서의 활액 분석은 간단한 단계를 통해 샘플의 염증성 또는 비염증성 특성을 평가하는 데 사용됩니다. 골관절염에서 칼슘 결정을 검출하고 골관절염의 더 심각한 하위 집합을 식별하는 데 특히 유용합니다.

초록

활액(SF) 분석은 골관절염(OA) 진단에 중요합니다. 총 및 미분 백혈구(WBC) 수를 포함한 거시적 및 미시적 특징은 OA의 특징인 SF의 비염증성 특성을 정의하는 데 도움이 됩니다. OA 환자에서 SF 샘플의 WBC는 일반적으로 마이크로 리터당 2000 세포를 초과하지 않으며 호중구와 같은 염증 세포의 비율은 매우 낮거나 없습니다. 칼슘 결정은 OA 환자로부터 수집된 SF에서 빈번합니다. OA의 발병기전에서 그들의 역할은 불분명하지만 경미한 염증 과정 및 더 심각한 질병 진행과 관련이 있습니다. 최근에, 칼슘 결정은 OA의 초기 및 후기 단계 모두에서 설명되었으며, 이는 OA 및 약리학적 치료의 다양한 임상 하위 집합을 진단하는 데 중요한 역할을 할 수 있음을 나타냅니다. OA에서 SF 분석의 전반적인 목표는 SF의 비염증성 정도를 확인하고 칼슘 결정의 존재를 강조하는 두 가지입니다.

서문

골관절염(OA)은 복잡하고 다인성인 만성 관절 질환으로, 전 세계적으로 15세 이상 피험자의 유병률이 16%, 40^{세 이상 피험자}의 경우 23%로 추정됩니다. 골관절염 발병률은 인구 고령화와 비만, 대사증후군 등의 위험인자의 증가로 인해 증가할 것으로 예상된다².

OA와 관련된 주요 문제 중에는 초기 단계에서 질병을 진단하는 데 어려움이 있으며 현재 사용 가능한 치료법은 통증 관리 및 글리코사미노글리칸과 같은 증상이 있는 느린 작용 약물(SYSADOA)로 제한됩니다. OA의 진단은 임상 증상과 영상 소견을 기반으로 합니다. 그러나 두 평가 사이의 상관관계가 부족하면 OA 진단 및 치료 시작이 수년간 지연될 수 있다². OA는 퇴행성 과정과 낮은 등급의 염증이 특징이며, 이는 활액(SF) 분석을 통해 쉽게 조사할 수 있습니다. SF는 히알루론산이 풍부한 점성 혈장 투석액으로 관절 공간을 윤활하고 연골에 영양분과 산소를 공급하며 대사 노폐물을 제거합니다. SF는 또한 충격 흡수 장치 역할을 하여 응력과 변형이 발생하는 동안 관절을 보호합니다³.

SF 분석은 근골격계 증상 및 관절 삼출액이 있는 환자의 초기 평가 시 항상 수행해야 하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법입니다³. 미국 류마티스 학회(American College of Rheumatology), 영국 류마티스 학회(British Society for Rheumatology) 등의 권장 사항에는 주로 급성 단일관절염을 평가할 때 수행해야 하는 류마티스 질환 진단 검사 중 SF 분석이 포함됩니다 ^4,5. SF 분석에서 얻은 총 및 차등 백혈구 수는 관절에서 발생하는 병리학 적 과정의 스냅 샷을 제공하여 염증 정도를 분류합니다. 편광에서 요산일나트륨(MSU) 및 피로인산칼슘(CPP) 결정과 같은 병원성 결정의 식별은 결정 관절염(예: 통풍 및 가성 통풍)의 진단 및 치료에 매우 중요합니다. 또한, 미생물의 존재는 패혈증 성 관절염의 진단을 시사합니다.

칼슘 결정은 OA⁶ 환자로부터 채취한 샘플에서 빈번합니다. 염기성 인산칼슘(BCP) 결정과 CPP는 OA⁶ 환자로부터 각각 SF 샘플의 약 22% 및 23%에서 보고되었습니다. 그들의 역할은 불분명하지만, 이러한 결정은 더 심각한 형태의 OA⁷ 과 관련이 있으며 병리학 적 과정 자체의 부수 현상으로 간주됩니다. 칼슘 결정은 무릎 치환술을 받는 OA 환자의 조직 샘플 중 100%에서 검출되었다⁸. 또한, 칼슘 결정은 염증 효과로 인해 골관절염의 발병에 관여할 수 있다는 가설이 제기되었으며, 이는^{여러 연구에서 입증} 되었으며9 적어도 부분적으로는 NLRP3 인플라마솜(inflammasome)에 의해 매개된다¹⁰.

보다 최근에, 칼슘 결정^{은 OA} 의 초기 및 후기 단계 6 모두에서 설명되었으며, 이는 OA 및 약리학적 치료의 다양한 임상 하위 집합을 진단하는 데 중요한 역할을 할 수 있음을 나타냅니다.

SF 분석의 전반적인 목표는 SF의 염증 정도를 결정하고 특정 결정 또는 미생물을 식별하여 결정 또는 패혈성 관절염을 진단하는 것입니다. 호중구의 비율이 매우 낮거나 없는 전형적인 비염증성 패턴으로 인해 OA를 진단하는 데 특히 유용하고 간단하며 신뢰할 수 있는 도구입니다.

대체 기술에 비해 장점
SF 분석은 총 및 차등 백혈구 수와 결정 검색을 포함하는 간단한 절차로 구성됩니다. 전문 실험실 기술자가 수행하는 수동 세포 계수 ^3,11은 활액 및 기타 체액의 세포학적 분석을 위한 황금 표준으로 남아 있습니다. 그러나, 이 방법의 시간 소모적인 한계와 관찰자 간 및 관찰자 내 가변성으로 인해, 자동 세포 계수기는 SF 분석을 가능하게 하기 위해 혈액 및 소변 분석기가 조정된 대규모 일상 임상 실험실에서 수동 계수를 점진적으로 대체하고 있다^11,12. 그럼에도 불구하고, 수동 계수는 특정 설정에서 몇 가지 이점을 제시한다 : (1) 보행기에서, 시간에 대한 총 및 차등 WBC 값을 얻기 위해; (2) 자동 카운터가 인식할 수 없는 세포탐식 단핵(Reiter) 세포 또는 활액막과 같은 비조혈 세포와 같은 세포 유형을 식별하기 위해; (3) 샘플이 너무 작아서 기기에서 취급할 수 없는 경우; (4) 연구 목적으로 쉽게 접근할 수 있는 지역 실험실 레지스트리를 만듭니다. 수동 계수의 또 다른 장점은 유리 슬라이드 준비 직후 세포를 매우 빠르게 분화할 수 있는 방법인 인서프라바이탈 염색(insupravital staining)입니다. 대조적으로, Wright 및 May-Grünwald-Giemsa 절차와 같은 전통적인 염색은 공기 건조 SF 도말과 세포 염색^{시간이 필요합니다 13}. 시간에 민감한 일상적인 분석에는 적합하지 않지만 이러한 염색 방법은 적혈구, 호염기구, 호산구, 다형핵 백혈구, 림프구 및 혈소판을 포함한 샘플의 보다 상세한 세포 집단을 보여줍니다.

마지막으로, 결정에 대한 일상적인 SF 분석은 빠른 결과를 제공하는 편광 현미경을 기반으로 하는 간단한 기술을 사용하여 수행됩니다¹⁴. 주사 및 전자 현미경과 같은 대체 방법은 더 정확하고 민감한 결과를 산출하지만 높은 비용과 시간이 많이 소요되는 샘플 준비 및 분석으로 인해 일상적인 임상 실습에서 사용하는 것은 불가능합니다.

프로토콜

본 프로토콜은 파도바 대학 병원 윤리위원회의 지침을 준수합니다. SF는 클리닉에 처음 내원할 때 또는 관절염 발적에 대한 반응으로 관절 삼출에 대한 치료적 관절 천자를 받는 환자의 무릎 관절에서 환자의 동의를 얻어 수집되었습니다. 절차에 대한 금기 사항은 응고 병증, 항응고제, 피부 병변, 피부염 또는 관절 위의 봉와직염이었습니다. 모든 SF 샘플은 비식별화되었습니다.

1. 활액 준비

1. 부어오른 관절¹⁵ 의 관절 천자 동안 수집된 SF 샘플을 항응고제가 포함된 튜브(바람직하게는 EDTA, 재료 표 참조)와 첨가제가 포함되지 않은 두 번째 튜브로 옮깁니다(그림 1).
2. 감염이 의심되는 경우 미생물 검사를 위해 SF 샘플(~ 1mL)의 일부를 배양 병에 무균적으로 옮깁니다.
   참고: 감염은 임상적 특징(심한 종양, 돌로르, 칼로리, functio laesa 및 때때로 발열)과 SF의 거시적 외관(탁도, 색상)의 결과로 의심될 수 있습니다. 이 경우 의사는 미생물학 실험실에서 수행하는 미생물 분석을 처방합니다.
3. 샘플을 채취하는 즉시 SF 분석(2-5단계)을 수행합니다.

2. 육안 검사

참고: SF 샘플의 거시적 평가는 주관적, 정성적 및 반정량적 평가로 구성됩니다. 참조 표준 스케일이 없으며 대조 샘플이 사용되지 않습니다.

1. 밀리리터로 표시된 SF 부피에 주석을 답니다. 옅은 노란색에서 짙은 노란색까지 다양할 수 있는 샘플의 색상을 정의합니다. 혈액의 존재를 기록하십시오.
2. 백라이트에서 샘플을 관찰하고 유체 튜브를 통해 인쇄된 페이지를 쉽게 읽을 수 있는지 확인하여 선명도를 정의합니다(그림 2A).
3. 일회용 피펫에서 샘플을 떨어뜨려 점도를 평가합니다. 긴 스트링 또는 드롭 형성은 각각 점도가 좋거나 낮음을 나타냅니다(그림 2B).
4. 튜브와 백라이트를 통해 샘플을 관찰하여 조직 조각 또는 피브린을 포함한 미립자 물질의 존재를 평가합니다.

3. 현미경 검사

참고: SF 현미경 분석은 총 및 미분 백혈구(WBC) 수와 결정 검색을 포함한 세포학적 검사로 구성됩니다.

1. 아래 단계에 따라 총 셀 수를 결정합니다.
   1. 혈구계를 사용하여 EDTA 튜브에 수집 된 SF의 총 백혈구 수를 결정하십시오 ( 재료 표 참조).
   2. Malassez-Potain 피펫(마크 0.5, 재료 표 참조)을 사용하여 EDTA 튜브에서 SF 0.5μL를 추출합니다(보충 그림 1). 동일한 피펫으로 0.1% 메틸렌 블루 용액 9.5μL를 그립니다(마크 11). 최종 희석은 20 배입니다.
   3. 부드러운 반전으로 피펫을 혼합하고 첫 번째 방울을 버리고 활액 + 메틸렌 블루 용액을 계수 챔버에 붓습니다.
   4. 9 개 중 2 개의 연속 사각형으로 셀을 세고 얻은 숫자에 100을 곱합니다 (단순화 된 공식; 보충 그림 2). 백혈구를 입방 밀리미터당 백혈구 수로 표현합니다.
      참고: 단순화된 공식: 백혈구(N/mm³) = 연속된 두 개의 제곱에서 계수된 세포 수 x 100.
   5. 이전에 발표된 보고서^16,17에 따라 총 WBC 수에 따라 SF를 분류합니다(표 1).
2. 미분 셀 카운트를 수행합니다.
   1. supravital 또는 traditional staining을 사용하여 polymorphonuclear (PMN) 세포, 단핵구 및 림프구의 백분율을 결정하십시오^13,18.
   2. 초생명 염색을 위해 크레실 바이올렛과 메틸렌 블루로 미리 코팅된 즉시 사용 가능한 슬라이드의 중앙에 작은 SF 한 방울을 떨어뜨립니다(보충 그림 3, 재료 표 참조).
   3. 커버슬립으로 덮고 현미경 침지 오일 한 방울을 떨어뜨립니다.
   4. 전통적인 염색을 위해 공기 건조 SF 도말을 준비합니다(일상적인 분석에는 적합하지 않음). 깨끗한 슬라이드 끝에 SF를 조금 떨어 뜨립니다. 두 번째 슬라이드 또는 커버 슬립을 사용하여 앞으로 움직여 슬라이드를 따라 펼칩니다. 얼룩을 자연 건조시키십시오.
   5. 표준 May-Grünwald-Giemsa 절차¹⁸에 따라 샘플을 염색합니다.
   6. 오일 이멀젼 대물렌즈(1,000x) 아래의 슬라이드를 검사합니다.
   7. 100개의 연속된 세포를 세고 다형핵 세포, 단핵구 및 림프구를 구별합니다(그림 3, 보충 그림 4).
   8. 각 범주의 총 수를 백분율로 표현합니다.
      참고: 정확한 결과를 얻으려면 SF를 수집하자마자 또는 적절하게 보관된 경우 관절 천자 후 24-48시간 이내(4°C)에 세포학적 검사를 수행해야 합니다.

4. 크리스탈 감지

1. 추가적인 편광 필터와 적색 보정기(¹⁹ )가 장착된 편광 현미경을 사용하여 병리학적 결정의 존재를 결정한다( 재료 표 참조).
2. 결정 감지를 위한 슬라이드 준비를 수행합니다.
   1. 광학 용지 또는 에탄올이 흡수 된 부드러운 종이로 유리 슬라이드를 조심스럽게 청소하십시오. 유리 슬라이드에 SF를 약간 떨어 뜨립니다.
   2. 커버슬립으로 덮고 슬라이드를 현미경 아래에 놓습니다.
3. 크리스탈을 식별합니다.
   1. 저전력 배율 대물렌즈를 사용하여 현미경으로 슬라이드의 초점을 맞춥니다. 40x 대물렌즈로 밝은 필드 아래에서 슬라이드를 주의 깊게 검사합니다. 세포 안팎을 살펴보십시오.
   2. 크기와 모양(예: 마름모꼴, 바늘 모양, 막대 모양)에 따라 결정을 식별합니다.
   3. 광원과 시편 사이에 편광 필터를 삽입합니다. 광축이 분석기에 수직이 될 때까지(대물렌즈 위에 배치됨) 편광판을 회전하여 어두운 배경을 만듭니다.
   4. 복굴절 결정이 확인되면 편광판과 시편 사이에 보정기를 삽입하고 결정의 광축에 평행 또는 수직으로 이동합니다.
   5. 결정에 의해 드러난 색을 관찰한다(표 2).
      참고: MSU 결정은 바늘 모양으로 나타나고 암시야에서 밝게 복굴절되며 축이 보정기와 평행할 때 노란색/주황색을 표시합니다. 반대로, 수직으로 위치할 때(음수 부호) 파란색입니다(표 2; 그림 4). CPP 결정은 막대 또는 마름모꼴 모양의 결정으로 편광 아래에서 약하게 복굴절되며 보상기 축에 평행 또는 수직으로 정렬될 때 각각 파란색 또는 노란색을 나타냅니다(양의 부호). 그림 5).

5. 알리자린 레드 염색

1. 알리자린 레드 S (pH 4.1-4.3)의 2 % 용액을 준비하고, 0.22 μm 필터를 통해 용액을 여과하고, 빛으로부터 멀리 보관하십시오.
   1. 슬라이드를 준비하려면 깨끗한 슬라이드에 같은 양의 알리자린 레드 용액 (1 : 1)과 SF 한 방울을 섞습니다. 커버슬립으로 덮고 400x 배율로 검사합니다.
   2. 현미경으로 결정을 확인하십시오.
      참고: 투과광 아래에서 밝고 짙은 빨간색 침전물이 둥근 모양과 동심원 층으로 보일 때 테스트는 양성입니다. 편광된 빛에서는 강한 복굴절이 나타난다²⁰(그림 6).

결과

골관절염의 영향을 받는 큰 관절은 종종 부어오르고 상당한 양의 SF를 생성하며, 이는 관절 천자를 통해 배출된다¹⁵. 관절 천자 직후에 평가되는 SF의 거시적 특성은 본질적으로 양, 색, 투명도 및 점도를 포함한다¹⁷. 낮은 특이성에도 불구하고 염증 정도에 대한 예비 데이터를 제공합니다. 색상은 SF 세포성과 세포외 기질 거대분자의 단편화 정도에 따라 다...

토론

OA에서 SF 분석은 총 및 차등 백혈구 수와 CPP 및 BCP를 포함한 결정 검색과 같은 간단한 단계를 통해 질병 특성을 정의하는 데 도움이 됩니다. 또한, MSU 결정의 검출은 중요한 동반 질환을 강조할 수 있습니다.

저렴한 비용과 간단한 실행에도 불구하고 테스트의 민감도와 결과의 신뢰성은 주로 결정 식별과 관련된 경험이 없는 분석가로 인해 영향을 받을 수 있습니다. 분석가의 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin red S	Merck	A5533	For BCP crystal search
Burker chamber	Merck	BR718905	For total white blood cell count
Cover glasses	Merck	C7931	For microscopic examination
EDTA tubes	BD	368861	For SF collection
Glass slides	Merck	S8902	For crystal search
Lambda filter (compensator)	Any	Refer to microscope company	For crystal identification
Malassez-Potain pipette	Artiglass	54830000	For dilution of synovial fluid
Methylene blue solution	Merck	3978	For total white blood cell count
Polarized microscope	Leica, Nikon, others	Depending on the model and company	For complete synovial fluid analysis
Polarizing lens	Any	Refer to microscope company	For crystal identification
Testsimplet	Waldeck	14386	Supravital staining for cell differentiation