通过全身暴露于可吸入二氧化硅来建立矽肺大鼠模型

摘要

本研究描述了一种建立矽肺大鼠模型的技术，该模型在吸入室中通过全身吸入二氧化硅。患有矽肺的大鼠可以以一种简单、具有成本效益的方式密切模拟人类矽肺病的病理过程，并具有良好的可重复性。

摘要

矽肺的主要原因是在职业环境中吸入二氧化硅。尽管在解剖学和生理学上存在一些差异，但啮齿动物模型仍然是研究人类矽肺病的重要工具。对于矽肺病，经典的病理过程需要 通过 吸入新鲜产生的石英颗粒来诱导，这意味着特异性地诱发人类职业病。本研究描述了一种建立并有效模拟矽肺病病理动态进化过程的技术。此外，该技术具有良好的可重复性，不涉及手术。吸入暴露系统被制造、验证并用于可吸入颗粒吸入的毒理学研究。关键部件如下:（1）用气流控制器调节的散装干式SiO₂ 粉末发生器;（2） 0.3 m³ 全身吸入暴露室，最多可容纳 3 只成年大鼠;（3）实时调节氧气浓度、温度、湿度、压力的监测控制系统;（4）用于保护实验室技术人员和环境的屏障和废物处理系统。综上所述，本方案 报告了全身 吸入情况，吸入室创建了可靠、合理、可重复的大鼠硅化模型，死亡率低，伤害少，保护性强。

引言

吸入二氧化硅引起的矽肺病是我国最严重的职业病，占每年职业病报告总数的80%以上¹。矽肺病的病因明确，可以预防和控制，但没有有效的治疗方法²。许多药物在基础研究中已被证明是有效的，但它们的临床效果并不精确^3,4。因此，矽肺的病理生理机制仍有待探索。

许多研究使用一次性将二氧化硅输注到大鼠或小鼠的气管中来研究矽肺病的发病机制 ^5,6。尽管这些啮齿动物硅质模型可以在短时间内获得⁷，但这些方法仍然存在挑战，例如动物创伤和高死亡率。一些研究涉及将储存的二氧化硅滴入肺部以诱导非特异性肺反应，但没有提到小鼠的硅结节⁸。此外，除了急性矽肺病之外，在职业环境中长期暴露于二氧化硅可显著降低肺部炎症，并升高肺部抗凋亡标志物（而不是促凋亡标志物^{）的水平9}。因此，需要一个可靠、合理、可重复的动物模型来进一步探究矽肺病的发病机制。

本研究描述了一种模拟矽肺患者疾病过程的方法，即通过全身吸入二氧化硅，在吸入室中空气输送颗粒，吸入室包括空气输送的二氧化硅发生器、全身室和废物处理系统。该方法简单易操作，有效模拟了矽肺病的病理动态演化过程。此外，使用这种方法确定了矽肺病的许多可能机制和发病机制10,11,12。预计拟议的方案将有助于在矽肺病研究的相关领域进行进一步研究。

研究方案

所有动物实验均根据美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行，并经华北理工大学伦理委员会批准（协议代码LX2019033和批准的2019-3-3）。本研究使用3周龄的雄性Wistar大鼠。所有大鼠都被关在带有刨花的静态笼子里。动物保持在12小时/12小时的光/暗循环中，并 随意提供食物和水。适应性喂养1周后进行后续实验。

1.动物准备

1. 抵达后，将所有老鼠安置在特定的无病原体 （SPF） 房间内。
2. 将健康大鼠随机分为两组（n = 10）:吸入纯净空气的对照大鼠和吸入二氧化硅的矽肺大鼠。

2. 二氧化硅制备

注意:人体吸入的二氧化硅粉尘会损害肺部。因此，个人在手术期间必须穿戴工作服、医用手套和防护口罩 （N95）。

1. 在每次暴露之前，用玛瑙研钵研磨二氧化硅颗粒（见 材料表）1.5小时。这是因为新破裂的石英比老化的^{石英 13} 产生更多的活性氧，而直径为 1-5 μm 的二氧化硅最具致病性。
2. 研磨后使用电子天平称量二氧化硅（30g），将其放入玻璃容器中，并在180°C下在电加热吹风干燥器中烘烤6小时（见 材料表），以消除二氧化硅颗粒表面的病原体。

3.二氧化硅暴露于大鼠

1. 连接喷射和市售的发生器系统（参见 材料表）并将二氧化硅（30 g）放入发生器中。检查连接管路是否正常，电源线是否已连接，电源是否正常。
   1. 手动检查喷淋塔和废气处理装置加湿器的水位（见 物料表），不足时加水（不达标线）。
   2. 将自来水加入废气处理装置的喷淋塔，将蒸馏水加入加湿器（图1）。
2. 打开废气排放装置（见 物料表）和气源开关，确认屏蔽柜内部是否处于负压状态。
   1. 确认吸入室下方的液体混合、粉末混合、纯气流量控制阀、废水排放阀已关闭。
3. 将总共10只大鼠置于吸入室中（见 材料表），并关闭吸入室和屏蔽的柜门。
4. 在仪表板或计算机中设置以下实验参数:箱体压力:-50至-30Pa;氧气浓度:21%;柜体温度:26-30°C;湿度:30%-70%;粉尘进入率:2.0-2.5 mL/min;柜内粉尘浓度:60 ± 5 mg/m³.
   注意: 在实验过程中连续观察实验数据和设备状态。设备故障报警提示及时处理。
   1. 将每只动物每天连续暴露于二氧化硅3小时，每周5天，并让对照组中的动物吸入纯净的空气。
5. 实验完成后，关闭混合气体流量控制阀，打开纯气流量阀。将纯气体连续注入吸入室。
   注:在本研究中，将纯气体流量（7.0-7.5 m³ / h）注入至少20分钟，直到吸入室中的有毒气体完全置换。
   1. 关闭纯净气流阀，打开门，将老鼠取出，并将它们送回无病原体的房间。
6. 依次拆下老鼠架和支管组件，并将它们放入水槽中进行清洁。冲洗后，关闭自动清洁阀并打开舱口。
   1. 用干净的布擦拭内壁，或打开纯气干燥水箱。最后，进行消毒。用75%乙醇清洗消毒后，关闭排气门，尽快轻轻打开吸入舱门，将水分蒸发掉，使吸入舱内部保持干燥。
7. 按照制造商的说明（见 材料表），每周两次使用全面的大气采样器检查柜中的二氧化硅浓度，以确保实验过程中二氧化硅浓度的稳定性。采样前校准大气采样器。
   1. 使用数字单盘分析天平进行重量测定。计算出的二氧化硅浓度为65 mg/m³ （图1 和 表1）。
      注意: 在吸收二氧化硅之前和之后称量滤纸。使用以下公式¹² 计算二氧化硅的浓度:
      
      其中 W2 = 取样后滤纸的重量，W1 = 取样前滤纸的重量，V = 空气体积。

4. 肺组织的采集和固定

1. 通过腹膜内注射戊巴比妥（100mg / kg体重）和利多卡因（4mg / kg体重）对大鼠实施安乐死。通过心跳丢失来评估死亡¹⁴.
2. 在实验结束时，用4%多聚甲醛固定右下肺，肾，肝，脾和骨至少24小时，包埋在石蜡中，并切成5μm部分^7,15。

5. 苏木精和伊红（H&E）染色

1. 将石蜡切片在二甲苯中脱蜡（见 材料表）两次，每次10分钟，每次¹⁶分钟，并在100%乙醇，95%乙醇，90%乙醇，80%乙醇，70%乙醇和蒸馏水中再水化3分钟。
2. 用苏木精（见 材料表）染色切片5分钟，然后用水洗涤切片¹⁰。
3. 将切片放入 2% 盐醇中，然后放入蒸馏水中，直到颜色变为蓝色。
4. 用曙红染色切片1分钟，用95%乙醇脱水，用二甲苯使它们透明，用中性胶密封，并在光学显微镜^下观察12。

6. 免疫组化染色

1. 定期用水清洗石蜡切片。
2. 将抗原在高压（60kPa）和高温（100°C）下暴露80秒，然后用内源性过氧化物酶阻滞剂（3%）封闭15分钟以消除内源性过氧化物酶⁷。
3. 将样品与针对CD68的抗体（1:200稀释 - 将4μLCD68加入396μL抗体稀释剂;参见 材料表）在4°C下孵育过夜。
4. 将样品与二抗（HRP偶联的山羊抗小鼠IgG聚合物;参见 材料表）在37°C孵育30分钟，然后用1x PBS洗涤样品。
5. 用3,3-二氨基联苯胺（DAB;见 材料表）观察免疫反应性。将DAB施加到组织后，在光学显微镜¹⁰下观察组织的染色。
   注意:根据组织的染色时间，染色时间从几秒钟到几分钟不等。通过将切片放入水中而中止了染色程序。在这项研究中，组织的棕色染色代表CD68的阳性表达。所有抗体均在 1x PBS 中稀释。

结果

利用所提出的方法，探讨了大鼠矽肺病的一些潜在机制和发病机制。吸入室的示意图如图1所示。如前所述，该腔室由空气输送的二氧化硅发生器、全身腔室和废物处理系统组成¹⁷。肺功能、血清和肺中炎症因子水平、胶原沉积和肌成纤维细胞分化在先前的研究中报道 10,18,19。miRNA、lncRNA ...

讨论

作为矽肺病的主要原因，二氧化硅在成型中起着决定性的作用。尘肺病患者吸入的二氧化硅颗粒是通过机械切割产生的新鲜游离二氧化硅颗粒。二氧化硅可以直接在新鲜裂解的颗粒表面上产生活性氧，也可以通过其对巨噬细胞的影响间接产生活性氧²⁵。因此，二氧化硅颗粒的研磨非常重要。在拟议的方案中，二氧化硅用玛瑙砂浆研磨超过90分钟，使其更细，更不规则，并增加表面...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air detector (compressive atmospheric sampler)	Qingdao Xuyu Environmental Protection Technology Co. LTD
Anatomical table			No specific brand is recommended.
Antibody of CD68	Abcam	ab201340
DAB	ZSGB-BIO	ZLI-9018
Electric heating air-blowing drier	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD
Electronic balance	OHRUS
Embedding machine	leica
Exhaust gas discharge device	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Generator systems	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Gloves (thin laboratory gloves)	The secco medical
Hematoxylin and eosin	BaSO Diagnostics Inc.	BA4025
HOPE MED 8050 exposure control apparatus	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Inhalation chamber	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Injection syringe			No specific brand is recommended.
Light microscope	olympus
Object slide	shitai
PV-6000 (HRP-conjugated goat anti-mouse IgG polymer)	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co. Ltd	s5631
Silicon dioxide	Sigma-Aldrich
Slicing machine	leica	RM2255
Waste gas treatment device	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Wet box	Cooperative plastic Products Factory
Xylol	Tianjin Yongda Chemical Reagent Co., LTD