JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом исследовании описывается методика создания модели силикозной крысы с вдыханием диоксида кремния через все тело в ингаляционной камере. Крысы с силикозом могут точно имитировать патологический процесс силикоза человека простым, экономически эффективным способом с хорошей повторяемостью.

Аннотация

Основной причиной силикоза является вдыхание диоксида кремния в производственной среде. Несмотря на некоторые анатомические и физиологические различия, модели грызунов продолжают оставаться важным инструментом для изучения силикоза человека. При силикозе классический патологический процесс должен быть индуцирован путем вдыхания свежеобразующихся частиц кварца, что означает специфическое индуцирование профессионального заболевания человека. В данном исследовании описана методика установления и эффективной имитации патологического динамического процесса эволюции силикоза. Кроме того, техника обладала хорошей повторяемостью без хирургического вмешательства. Система ингаляционного воздействия была изготовлена, валидирована и использована для токсикологических исследований вдыхаемых частиц. Важнейшими компонентами были следующие: (1) генератор сухого порошка SiO2 , регулируемый с помощью регулятора воздушного потока; (2) Камера ингаляционного воздействия для всего тела объемом 0,3м3 , вмещающая до 3 взрослых крыс; (3) система мониторинга и управления для регулирования концентрации, температуры, влажности и давления кислорода в режиме реального времени; и (4) барьерная система и система удаления отходов для защиты лаборантов и окружающей среды. Таким образом, в настоящем протоколе сообщается о вдыхании через все тело, и ингаляционная камера создала надежную, разумную и воспроизводимую силикозную модель крысы с низкой смертностью, меньшим травматизмом и большей защитой.

Введение

Силикоз, вызванный вдыханием диоксида кремния, является наиболее серьезным профессиональным заболеванием в Китае, на долюкоторого ежегодно приходится более 80% от общего числа сообщений о профессиональных заболеваниях1. Этиология силикоза ясна, и его можно предотвратить и контролировать, но эффективного метода лечения не существует2. Эффективность многих препаратов была доказана в фундаментальных исследованиях, но они имеют неточные клинические эффекты 3,4. Поэтому патологоанатомические и физиологические механизмы силикоза еще предстоит изучить.

Во многих исследованиях использовали однократное введение диоксида кремния в трахею крыс или мышей для изучения патогенеза силикоза 5,6. Несмотря нато, что эти силикозные модели грызунов можно было получить за короткое время, эти методы все еще сталкивались с проблемами, такими как травмы животных и высокая смертность. Некоторые исследования включали введение накопленного диоксида кремния в легкие, чтобы вызвать неспецифическую легочную реакцию, но не упоминали силикотические узелки у мышей8. Кроме того, помимо острого силикоза, хроническое воздействие диоксида кремния в профессиональной среде индуцировало значительно меньшее воспаление легких и повышало уровни антиапоптотических маркеров, а не проапоптотических маркеров в легких9. Поэтому для дальнейшего изучения патогенеза силикоза необходима надежная, разумная и воспроизводимая модель на животных.

В настоящем исследовании описан способ имитации процесса заболевания у пациентов с силикозом путем вдыхания диоксида кремния через все тело, доставляемых по воздуху частиц в ингаляционной камере, которая состояла из генератора диоксида кремния, доставляемого по воздуху, камеры для всего тела и системы утилизации отходов. Этот метод прост, удобен в эксплуатации и эффективно имитирует патологический динамический процесс эволюции силикоза. Также с помощью этого метода выявляются многие возможные механизмы и патогенез силикоза 10,11,12. Ожидается, что предлагаемый протокол поможет дальнейшим исследованиям в смежной области исследований силикоза.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения США по уходу и использованию лабораторных животных и одобрены Комитетом по этике Северо-Китайского университета науки и технологий (код протокола LX2019033 и 2019-3-3 утверждения). Для настоящего исследования были использованы крысы-самцы линии Wistar в возрасте 3 недель. Все крысы содержались в статичных клетках с древесной стружкой. Животные содержались в цикле 12 ч/12 ч свет/темнота и обеспечивались едой и водой вволю. Последующие эксперименты проводили через 1 неделю адаптивного кормления.

1. Подготовка животных

  1. По прибытии разместите всех крыс в специальной комнате, свободной от патогенов (SPF).
  2. Случайным образом разделите здоровых крыс на две группы (n = 10): контрольные крысы, вдыхающие чистый воздух, и крысы с силикозом, вдыхающие диоксид кремния.

2. Приготовление диоксида кремния

ВНИМАНИЕ: Кварцевая пыль, вдыхаемая человеческим организмом, может повредить легкие. Поэтому во время операций люди должны носить комбинезоны, медицинские перчатки и защитные маски (N95).

  1. Измельчайте частицы кремнезема (см. Таблицу материалов) агатовым раствором в течение 1,5 ч перед каждой выдержкой. Это связано с тем, что свежеизмельченный кварц производит большее количество активных форм кислорода, чем выдержанный кварц13, а кремнезем диаметром 1-5 мкм является наиболее патогенным.
  2. После измельчения взвесьте диоксид кремния (30 г) с помощью электронных весов, поместите его в стеклянную емкость и запекайте при температуре 180 °C в течение 6 ч в сушилке с электрическим обогревом (см. таблицу материалов), чтобы удалить патогенные микроорганизмы с поверхности частиц кремнезема.

3. Воздействие диоксида кремния на крыс

  1. Соедините систему впрыска и имеющуюся в продаже систему генератора (см. Таблицу материалов) и поместите диоксид кремния (30 г) в генератор. Проверьте, нормально ли подключен трубопровод, подключен ли шнур питания и исправен ли источник питания.
    1. Проверьте уровень воды в распылительной башне и увлажнителе устройства очистки отходящих газов вручную (см. Таблицу материалов) и долейте воду, если она недостаточна (не соответствует стандартной линии).
    2. Добавьте водопроводную воду в распылительную башню устройства очистки отходящих газов и дистиллированную воду в увлажнитель (рисунок 1).
  2. Включите устройство отвода выхлопных газов (см. Таблицу материалов) и выключатель источника воздуха, чтобы убедиться, что внутренняя часть экранирующего шкафа находится в состоянии отрицательного давления.
    1. Убедитесь, что клапаны смешивания жидкости, смешивания порошка, управления потоком чистого газа и клапан сброса сточных вод под ингаляционной камерой закрыты.
  3. Поместите в общей сложности 10 крыс в ингаляционную камеру (см. Таблицу материалов) и закройте ингаляционное отделение и экранированные дверцы шкафа.
  4. Установите на панели приборов или в компьютере следующие экспериментальные параметры: давление в шкафу: от -50 до -30 Па; концентрация кислорода: 21%; температура шкафа: 26-30 °C; влажность: 30%-70%; скорость проникновения пыли: 2,0-2,5 мл/мин; и концентрация пыли в шкафу: 60 ± 5 мг/м3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за экспериментальными данными и состоянием оборудования непрерывно во время эксперимента. Сигнал тревоги о неисправности оборудования побудил к своевременной обработке.
    1. Подвергайте каждое животное воздействию диоксида кремния непрерывно в течение 3 часов в день, 5 дней в неделю, и позволяйте животным в контрольной группе вдыхать чистый воздух.
  5. По завершении эксперимента закройте клапан управления потоком смешанного газа и откройте клапан потока чистого газа. Непрерывно впрыскивайте чистый газ в ингаляционную камеру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании поток чистого газа (7,0-7,5м3/ч) впрыскивался в течение не менее 20 мин до тех пор, пока ядовитый газ в ингаляционной камере не был полностью заменен.
    1. Закройте клапан подачи чистого воздуха, откройте дверцу, вытащите крыс и отправьте их обратно в комнату, свободную от патогенов.
  6. Последовательно снимите решетку для крыс и компоненты патрубка и поместите их в раковину для очистки. После промывки закройте клапан автоматической очистки и откройте люк.
    1. Протрите внутреннюю стенку чистой тканью или включите чистый газ, чтобы высушить бак. Наконец, проведите дезинфекцию. После очистки и дезинфекции 75% этиловым спиртом закройте вытяжную заслонку и как можно скорее приоткройте дверцу ингаляционной кабины, чтобы влага испарилась, чтобы внутренняя часть ингаляционной кабины оставалась сухой.
  7. Проверяйте концентрацию кремнезема в шкафу с помощью комплексного атмосферного пробоотборника в соответствии с инструкциями производителя (см. таблицу материалов) два раза в неделю, чтобы обеспечить стабильность концентрации кремнезема во время эксперимента. Перед отбором проб откалибруйте атмосферный пробоотборник.
    1. Для гравиметрического определения используйте цифровые аналитические весы с одним чашечкой. Расчетная концентрация кремнезема составила 65 мг/м3 (рис. 1 и табл. 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Взвесьте фильтровальную бумагу до и после абсорбции диоксида кремния. Концентрацию кремнезема рассчитывали по следующей формуле12:
      figure-protocol-5846
      где W2 = вес фильтровальной бумаги после отбора проб, W1 = вес фильтровальной бумаги до отбора проб и V = объем воздуха.

4. Захват и фиксация легочных тканей

  1. Усыпляют крыс внутрибрюшинными инъекциями пентобарбитала (100 мг/кг массы тела) и лидокаина (4 мг/кг массы тела). Оценивают смерть по потере сердцебиения14.
  2. По окончании эксперимента правую нижнюю часть легкого, почку, печень, селезенку и кость закрепляют 4% параформальдегидом не менее 24 ч, заделывают в парафин и разрезают на срезыпо 5 мкм 7,15.

5. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)

  1. Депарафинизируют парафиновые срезы в ксилоле (см. Таблицу материалов) дважды по 10 мин каждые16 мин и регидратируют в 100% этаноле, 95% этаноле, 90% этаноле, 80% этаноле, 70% этаноле и дистиллированной воде в течение 3 мин каждый.
  2. Срезы окрашивают гематоксилином (см. таблицу материалов) в течение 5 мин, а затем промывают срезы водой10.
  3. Поместите срезы в 2% соляный спирт, а затем в дистиллированную воду, пока цвет не изменится на синий.
  4. Окрасьте срезы эозином в течение 1 мин, обезвоживайте их 95%-ным этиловым спиртом, делайте их прозрачными с помощью ксилола, запечатывают нейтральной камедью и наблюдают под световым микроскопом12.

6. Иммуногистохимическое окрашивание

  1. Регулярно промывайте парафиновые срезы водой.
  2. Подвергают антигены высокому давлению (60 кПа) и высокой температуре (100 °С) в течение 80 с, а затем блокируют эндогенным блокатором пероксидазы (3%) в течение 15 мин для элиминации эндогенных пероксидаз7.
  3. Инкубируют образцы с антителами, направленными против CD68 (разведение 1:200 - добавление 4 мкл CD68 к 396 мкл разбавителя антител; см. таблицу материалов) при 4 °C в течение ночи.
  4. Инкубируют образцы со вторичным антителом (HRP-конъюгированный козий антимышиный полимер IgG; см. таблицу материалов) при 37 °C в течение 30 мин, а затем промывают образцы 1x PBS.
  5. Визуализируйте иммунореактивность с помощью 3,3-диаминобензидина (DAB; см. таблицу материалов). После нанесения DAB на ткань наблюдают за окрашиванием ткани под световым микроскопом10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время окрашивания варьировалось от нескольких секунд до нескольких минут в зависимости от времени окрашивания ткани. Процедуру окрашивания прерывали помещением срезов в воду. В этом исследовании коричневое окрашивание ткани представляло собой положительную экспрессию CD68. Все антитела были разведены в 1x PBS.

Результаты

С помощью предложенного метода были изучены некоторые потенциальные механизмы и патогенез силикоза на крысах. Схема ингаляционной камеры приведена на рисунке 1. Камера состояла из генератора диоксида кремния с подачей воздуха, камеры для всего тела и системы удаления ?...

Обсуждение

Являясь основной причиной силикоза, кремнезем играет решающую роль в формовании. Частицы кремнезема, вдыхаемые пациентами с пневмокониозом, представляют собой свежие, свободные частицы кремнезема, полученные путем механической резки. Кремнезем может генерировать активные формы кисл...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа финансировалась Национальным фондом естественных наук Китая (82003406), Фондом естественных наук провинции Хэбэй (H2022209073) и Научно-техническим проектом Департамента образования провинции Хэбэй (ZD2022127).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Air detector (compressive atmospheric sampler)Qingdao Xuyu Environmental Protection Technology Co. LTD
Anatomical table No specific brand is recommended.
Antibody of CD68Abcamab201340
DABZSGB-BIOZLI-9018
Electric heating air-blowing drierShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD
Electronic balanceOHRUS
Embedding machineleica
Exhaust gas discharge device  HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Generator systems HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Gloves (thin laboratory gloves)The secco medical
Hematoxylin and eosinBaSO Diagnostics Inc.BA4025
HOPE MED 8050 exposure control apparatusHOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Inhalation chamber HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Injection syringe No specific brand is recommended.
Light microscope olympus
Object slideshitai
PV-6000 (HRP-conjugated goat anti-mouse IgG polymer)Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co. Ltds5631
Silicon dioxideSigma-Aldrich
Slicing machineleicaRM2255
Waste gas treatment deviceHOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Wet boxCooperative plastic Products Factory
XylolTianjin Yongda Chemical Reagent Co., LTD

Ссылки

  1. Li, J., et al. The burden of pneumoconiosis in China: an analysis from the Global Burden of Disease Study. BMC Public Health. 22 (1), 1114 (2019).
  2. The Lancet Respiratory Medicine. The world is failing on silicosis. The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).
  3. Li, T., Yang, X., Xu, H., Liu, H. Early identification, accurate diagnosis, and treatment of silicosis. Canadian Respiratory Journal. 3769134, (2022).
  4. Adamcakova, J., Mokra, D. New insights into pathomechanisms and treatment possibilities for lung silicosis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4162 (2021).
  5. Li, Y., et al. Thalidomide alleviates pulmonary fibrosis induced by silica in mice by inhibiting ER stress and the TLR4-NF-κB pathway. International Journal of Molecular Sciences. 23 (10), 5656 (2022).
  6. Zhang, E., et al. Exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells reverse epithelial-mesenchymal transition potentially via attenuating Wnt/β-catenin signaling to alleviate silica-induced pulmonary fibrosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 31 (9), 655-666 (2021).
  7. Li, S., et al. N-Acetyl-Seryl-Asparyl-Lysyl-Proline regulates lung renin angiotensin system to inhibit epithelial-mesenchymal transition in silicotic mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 408, 408 (2020).
  8. Walters, E. H., Shukla, S. D. Silicosis: Pathogenesis and utility of animal models of disease. Allergy. 76 (10), 3241-3242 (2021).
  9. Langley, R. J., Mishra, N. C., Peña-Philippides, J. C., Hutt, J. A., Sopori, M. L. Granuloma formation induced by low-dose chronic silica inhalation is associated with an anti-apoptotic response in Lewis rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 73 (10), 669-683 (2010).
  10. Jin, F., et al. Ac-SDKP Attenuates activation of lung macrophages and bone osteoclasts in rats exposed to silica by inhibition of TLR4 and RANKL signaling pathways. Journal of Inflammation Research. 14, 1647-1660 (2021).
  11. Xu, H., et al. A new anti-fibrotic target of Ac-SDKP: inhibition of myofibroblast differentiation in rat lung with silicosis. PloS One. 7 (7), e40301 (2012).
  12. Li, S., et al. Ac-SDKP increases α-TAT 1 and promotes the apoptosis in lung fibroblasts and epithelial cells double-stimulated with TGF-β1 and silica. Toxicology and Applied Pharmacology. 369, 17-29 (2019).
  13. Vallyathan, V., Shi, X. L., Dalal, N. S., Irr, W. Generation of free radicals from freshly fractured silica dust. Potential role in acute silica-induced lung injury. The American Review of Respiratory Disease. 138 (5), 1213-1219 (1988).
  14. Khoo, S. Y., Lay, B. P. P., Joya, J., et al. Local anesthetic refinement of pentobarbital euthanasia reduces abdominal writhing without affecting immunohistochemical endpoints in rats. Lab Anim. 2018 (52), 152-162 (2018).
  15. Chooi, K. F., Rajendran, D. B. K., Phang, S. S. G., Toh, H. H. A. The dimethylnitrosamine induced liver fibrosis model in the rat. Journal of Visualized Experiments. 112 (112), (2016).
  16. Valentin, J., Frobert, A., Ajalbert, G., Cook, S., Giraud, M. -. N. Histological quantification of chronic myocardial infarct in rats. Journal of Visualized Experiments. 118 (118), (2016).
  17. Zhang, H., et al. silicosis decreases bone mineral density in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 348, 117-122 (2018).
  18. Zhang, B., et al. Targeting the RAS axis alleviates silicotic fibrosis and Ang II-induced myofibroblast differentiation via inhibition of the hedgehog signaling pathway. Toxicology Letters. 313, 30-41 (2019).
  19. Li, S., et al. Silica perturbs primary cilia and causes myofibroblast differentiation during silicosis by reduction of the KIF3A-repressor GLI3 complex. Theranostics. 10 (4), 1719-1732 (2020).
  20. Gao, X., et al. Pulmonary silicosis alters microRNA expression in rat lung and miR-411-3p exerts anti-fibrotic effects by inhibiting MRTF-A/SRF signaling. Molecular therapy. Nucleic Acids. 20, 851-865 (2020).
  21. Cai, W., et al. Differential expression of lncRNAs during silicosis and the role of LOC103691771 in myofibroblast differentiation induced by TGF-β1. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125, (2020).
  22. Cai, W., et al. Transcriptomic analysis identifies upregulation of secreted phosphoprotein 1 in silicotic rats. Experimental and Therapeutic. 21 (6), (2021).
  23. Li, Y., et al. Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation. Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).
  24. Mao, N., et al. Glycolytic reprogramming in silica-induced lung macrophages and silicosis reversed by Ac-SDKP treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10063 (2021).
  25. Hamilton, R. F., Thakur, S. A., Holian, A. Silica binding and toxicity in alveolar macrophages. Free Radical Biology and Medicine. 44 (7), 1246-1258 (2008).
  26. Park, R., et al. Exposure to crystalline silica, silicosis, and lung disease other than cancer in diatomaceous earth industry workers: a quantitative risk assessment. Occupational and Environmental. 59 (1), 36-43 (2002).
  27. Honnons, S., Porcher, J. M. In vivo experimental model for silicosis. Journal of Environmental Pathology, Toxicology and. 19 (4), 391-400 (2000).
  28. Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Experimental Lung Research. 32 (5), 181-199 (2006).
  29. Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
  30. Hoy, R. F., Chambers, D. C. Silica-related diseases in the modern world. Allergy. 75 (11), 2805-2817 (2020).
  31. Davis, G. S. Pathogenesis of silicosis: current concepts and hypotheses. Lung. 164 (3), 139-154 (1986).
  32. Moss, O. R., James, R. A., Asgharian, B. Influence of exhaled air on inhalation exposure delivered through a directed-flow nose-only exposure system. Inhalation Toxicology. 18 (1), 45-51 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

188SiO2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены