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要約

本研究では、吸入チャンバー内で全身からシリカを吸入する珪肺症ラットモデルを確立する技術について述べる。珪肺症のラットは、ヒトの珪肺症の病理学的過程を、簡単で費用対効果の高い方法で、再現性に優れた方法で厳密に模倣することができました。

要約

珪肺症の主な原因は、職業環境でのシリカの吸入です。解剖学的および生理学的にいくつかの違いがあるにもかかわらず、げっ歯類モデルはヒトの珪肺症を研究するための不可欠なツールであり続けています。珪肺症の場合、古典的な病理学的プロセスは、新たに生成された石英粒子の吸入を介して誘導可能である必要があり、これは人間の職業病を特異的に誘発することを意味します。この研究は、珪肺症の病理学的動的進化プロセスを確立し、効果的に模倣する技術について説明しました。さらに、この技術は手術を伴わずに良好な再現性を示しました。吸入曝露システムは、呼吸性粒子吸入に関する毒物学研究に製造、検証、および使用されました。重要なコンポーネントは次のとおりです:(1)気流コントローラーで調整されたバルク乾式SiO2粉末発生器。(2)最大3匹の成体ラットを収容できる0.3m3の全身吸入暴露チャンバー。(3)酸素濃度、温度、湿度、圧力をリアルタイムで調整するための監視および制御システム。(4)検査技師と環境を保護するためのバリアおよび廃棄物処理システム。要約すると、本プロトコルは全身からの吸入を報告し、吸入チャンバーは、死亡率が低く、損傷が少なく、保護が強化された、信頼性が高く、合理的で再現性のあるラット珪肺モデルを作成しました。

概要

シリカの吸入によって引き起こされる珪肺症は、中国で最も深刻な職業病であり、毎年の職業病報告総数の80%以上を占めています1。珪肺症の病因は明確であり、予防および制御できますが、有効な治療法はありません2。多くの薬剤が基礎研究で有効であることが証明されていますが、臨床効果は不正確です3,4。したがって、珪肺症の病理学的および生理学的メカニズムはまだ調査する必要があります。

多くの研究では、ラットまたはマウスの気管にシリカを1回だけ注入して、珪肺症の病因を調査しています5,6。これらのげっ歯類の珪化モデルは短期間で得ることができましたが7、これらの方法には動物の外傷や高い死亡率などの課題がありました。いくつかの研究では、貯蔵されたシリカを肺に注入して非特異的な肺反応を誘発することが含まれていましたが、マウスの珪質性結節については言及されていません8。さらに、急性珪肺症とは別に、職業環境でのシリカへの慢性的な曝露は、肺の炎症を有意に低下させ、肺のアポトーシス促進マーカーではなく抗アポトーシスマーカーのレベルを上昇させました9。したがって、珪肺症の病因をさらに調査するには、信頼性が高く、合理的で再現性のある動物モデルが必要です。

本研究では、全身からのシリカ吸入、吸入室内の空気送達粒子、空気送達シリカ発生器、全身チャンバー、および廃棄物処理システムで構成される珪肺症患者の疾患プロセスを模倣する方法について述べる。この方法はシンプルで操作が簡単で、珪肺症の病理学的動的進化プロセスを効果的に模倣します。また、珪肺症の多くの可能なメカニズムおよび病因は、この方法を使用して特定される10,11,12。提案されたプロトコルは、珪肺症研究の関連分野でのさらなる調査に役立つことが期待されています。

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プロトコル

すべての動物実験は、米国国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイドに従って実施され、華北科技大学の倫理委員会によって承認されました(プロトコルコードLX2019033および承認の2019-3-3)。3週齢の雄のWistarラットを本研究に使用しました。すべてのネズミは、木の削りくずで固定されたケージに入れられました。動物は12時間/12時間の明暗サイクルで維持され、餌と水が 自由に与えられました。追跡実験は、適応摂食の1週間後に実施されました。

1.動物の調製

  1. 到着したら、すべてのラットを特定の病原体フリー(SPF)部屋に収容します。
  2. 健康なラットを無作為に2つのグループ(n = 10)に分けます:純粋な空気を吸入する対照ラットとシリカを吸入する珪肺症のラット。

2. シリカ調製

注意: 人体が吸い込むシリカ粉塵は、肺を損傷する可能性があります。したがって、手術中はオーバーオール、医療用手袋、保護マスク(N95)を着用する必要があります。

  1. 各曝露の前に、シリカ粒子( 材料表を参照)を瑪瑙モルタルで1.5時間研磨します。これは、破砕したばかりの石英は、熟成した石英13よりも多くの活性酸素種を生成し、直径1〜5μmのシリカが最も病原性が高いためです。
  2. 粉砕後、電子天秤でシリカ(30g)を秤量し、ガラス容器に入れ、電気加熱式送風乾燥機( 材料表参照)で180°Cで6時間焼成し、シリカ粒子の表面から病原体を除去します。

3. ラットへのシリカ曝露

  1. 注入装置と市販の発電機システム( 材料表を参照)を接続し、シリカ(30 g)を発電機に入れます。接続パイプラインが正常か、電源コードが接続されているか、電源が正常かを確認してください。
    1. スプレータワーと排ガス処理装置の加湿器の水位( 材料表を参照)を手動で確認し、水が不足している場合(標準ラインに達していない場合)は水を追加します。
    2. 排ガス処理装置のスプレー塔に水道水を入れ、加湿器に蒸留水を入れます(図1)。
  2. 排ガス排出装置( 材料表参照)と空気源スイッチをONにして、シールドキャビネット内が負圧状態になっているか確認してください。
    1. 吸入室下の混合液、粉体混合、純気体流量制御弁、排水排出弁が閉じていることを確認します。
  3. 合計10匹のラットを吸入チャンバーに入れ( 材料表を参照)、吸入コンパートメントと遮蔽されたキャビネットのドアを閉じます。
  4. インストルメントパネルまたはコンピュータで次の実験パラメータを設定します。 キャビネット圧力:-50〜-30 Pa;酸素濃度:21%;キャビネット温度:26-30°C;湿度:30%-70%;ダストエントリー速度:2.0-2.5 mL / min;そしてキャビネットの塵の集中:60 ± 5 mg/m3。
    注意: 実験中は、実験データと機器の状態を継続的に観察してください。機器の故障アラームは、タイムリーな処理を促しました。
    1. 各動物を1日3時間、週5日間継続的にシリカに曝露し、対照群の動物に純粋な空気を吸入させます。
  5. 実験が終了したら、混合ガス流量制御バルブを閉じ、純ガス流量バルブを開きます。純粋なガスを吸入チャンバーに連続的に注入します。
    注:本研究では、吸入室内の有毒ガスが完全に置換されるまで、純粋なガス流(7.0〜7.5 m3 / h)を少なくとも20分間注入しました。
    1. 純粋な気流バルブを閉じ、ドアを開けて、ネズミを取り出し、病原体のいない部屋に送り返します。
  6. ラットラックと枝管のコンポーネントを順番に取り外し、シンクに置いて清掃します。すすぎ後、自動洗浄バルブを閉じ、ハッチを開けます。
    1. 内壁を清潔な布で拭くか、純粋なガスをオンにしてタンクを乾かします。最後に、消毒を行います。75%エタノールで洗浄および消毒した後、排気ゲートを閉じ、できるだけ早く吸入キャビンのドアを少し開いて水分を蒸発させ、吸入キャビン内を乾燥した状態に保ちます。
  7. 実験中のシリカ濃度の安定性を確保するために、製造元の指示( 材料表を参照)に従って、週に2回、包括的な大気サンプラーを使用してキャビネット内のシリカ濃度をチェックします。サンプリングの前に大気サンプラーを校正してください。
    1. 重量測定には、デジタルシングルパン分析天びんを使用します。計算されたシリカ濃度は65mg/m3 であった(図1 および 表1)。
      注:シリカの吸収の前後にろ紙の重量を量ります。シリカの濃度は、以下の式12を用いて算出した:
      figure-protocol-2583
      ここで、W2 = サンプリング後のろ紙の重量、W1 = サンプリング前のろ紙の重量、V = 空気の体積。

4. 肺組織の獲得と固定

  1. ペントバルビタール(100 mg / kg体重)とリドカイン(4 mg / kg体重)の腹腔内注射によりラットを安楽死させます。.心拍の喪失による死を評価する14.
  2. 実験終了時に、右下肺、腎臓、肝臓、脾臓、骨を4%パラホルムアルデヒドで少なくとも24時間固定し、パラフィンに埋め込み、5μmの切片に切断します7,15。

5. ヘマトキシリンとエオシン(H&E)の染色

  1. パラフィン切片をキシロール( 材料表参照)で2回、各10分間16で脱パラフィンし、100%エタノール、95%エタノール、90%エタノール、80%エタノール、70%エタノール、蒸留水で各3分間再水和する。
  2. 切片をヘマトキシリン( 材料表参照)で5分間染色し、次に切片を水10で洗浄する。
  3. 切片を2%塩酸アルコールに入れ、色が青に変わるまで蒸留水に入れます。
  4. 切片をエオシンで1分間染色し、95%エタノールで脱水し、キシレンで透明にし、中性ガムで密封し、光学顕微鏡で観察する12。

6. 免疫組織化学的染色

  1. 定期的にパラフィン切片を水で洗ってください。
  2. 抗原を高圧(60 kPa)および高温(100°C)で80秒間暴露した後、内因性ペルオキシダーゼ遮断薬(3%)で15分間ブロッキングして、内因性ペルオキシダーゼを除去します7。
  3. CD68に対する抗体(CD68 4 μLを396 μLの抗体希釈液に1:200希釈で添加、 材料表を参照)とサンプルを4°Cで一晩インキュベートします。
  4. サンプルを二次抗体(HRP標識ヤギ抗マウスIgGポリマー、 材料表参照)と37°Cで30分間インキュベートした後、1x PBSでサンプルを洗浄します。
  5. 3,3-ジアミノベンジジン(DAB; 材料表を参照)による免疫反応性を可視化します。DABを組織に塗布した後、光学顕微鏡10で組織の染色を観察する。
    注:染色時間は、組織の染色時間に応じて数秒から数分まで変化しました。切片を水に浸すことにより、染色手順を中止した。この研究では、組織の褐色染色はCD68の陽性発現を表していました。すべての抗体を1x PBSで希釈しました。

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結果

提案手法を用いて、ラットにおける珪肺症の潜在的なメカニズムと病因を調査しました。吸入チャンバーの概略図を図1に示す。チャンバーは、前述のように、空気供給式シリカ発生器、全身チャンバー、および廃棄物処理システムで構成されていました17。肺機能、血清および肺の炎症因子のレベル、コラーゲン沈着、および筋線維芽細胞の分化は、?...

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ディスカッション

珪肺症の主な原因として、シリカは成形において決定的な役割を果たします。じん肺患者が吸入するシリカ粒子は、機械的切断によって生成された新鮮な遊離シリカ粒子です。シリカは、新たに切断された粒子表面に直接、またはマクロファージに対するその効果を通じて間接的に活性酸素種を生成することができる25。したがって、シリカ粒子の粉砕は非常に重要です。?...

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開示事項

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会(82003406年)、河北省自然科学基金会(H2022209073年)、河北省教育部科学技術プロジェクト(ZD2022127年)から資金提供を受けました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Air detector (compressive atmospheric sampler)Qingdao Xuyu Environmental Protection Technology Co. LTD
Anatomical table No specific brand is recommended.
Antibody of CD68Abcamab201340
DABZSGB-BIOZLI-9018
Electric heating air-blowing drierShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD
Electronic balanceOHRUS
Embedding machineleica
Exhaust gas discharge device  HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Generator systems HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Gloves (thin laboratory gloves)The secco medical
Hematoxylin and eosinBaSO Diagnostics Inc.BA4025
HOPE MED 8050 exposure control apparatusHOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Inhalation chamber HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Injection syringe No specific brand is recommended.
Light microscope olympus
Object slideshitai
PV-6000 (HRP-conjugated goat anti-mouse IgG polymer)Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co. Ltds5631
Silicon dioxideSigma-Aldrich
Slicing machineleicaRM2255
Waste gas treatment deviceHOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Wet boxCooperative plastic Products Factory
XylolTianjin Yongda Chemical Reagent Co., LTD

参考文献

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  3. Li, T., Yang, X., Xu, H., Liu, H. Early identification, accurate diagnosis, and treatment of silicosis. Canadian Respiratory Journal. 3769134, (2022).
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