Etablierung eines Silikose-Rattenmodells durch Exposition des Ganzkörpers mit lungengängigem Siliziumdioxid

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt eine Technik zur Etablierung eines Silikose-Rattenmodells mit der Inhalation von Kieselsäure durch den ganzen Körper in einer Inhalationskammer. Die Ratten mit Silikose konnten den pathologischen Prozess der menschlichen Silikose auf einfache, kostengünstige Weise mit guter Wiederholbarkeit genau nachahmen.

Zusammenfassung

Die Hauptursache für Silikose ist das Einatmen von Kieselsäure im beruflichen Umfeld. Trotz einiger anatomischer und physiologischer Unterschiede sind Nagetiermodelle nach wie vor ein wesentliches Werkzeug für die Untersuchung der menschlichen Silikose. Bei der Silikose muss der klassische pathologische Prozess durch die Inhalation von frisch erzeugten Quarzpartikeln induzierbar sein, d.h. durch die spezifische Induktion menschlicher Berufskrankheiten. Diese Studie beschrieb eine Technik, um den pathologischen dynamischen Evolutionsprozess der Silikose zu etablieren und effektiv nachzuahmen. Darüber hinaus wies die Technik eine gute Wiederholbarkeit auf, ohne dass eine Operation erforderlich war. Das Inhalations-Expositionssystem wurde hergestellt, validiert und für toxikologische Studien zur Inhalation lungengängiger Partikel verwendet. Die kritischen Komponenten waren wie folgt: (1) Schüttgut-SiO2-Pulvergenerator, der mit einem Luftstromregler eingestellt wurde; (2) 0,3 m³ Ganzkörper-Inhalations-Expositionskammer für bis zu 3 erwachsene Ratten; (3) ein Überwachungs- und Steuerungssystem zur Regelung von Sauerstoffkonzentration, Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Druck in Echtzeit; und (4) ein Barriere- und Abfallentsorgungssystem zum Schutz der Laboranten und der Umwelt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das vorliegende Protokoll die Inhalation über den ganzen Körper berichtet, und die Inhalationskammer schuf ein zuverlässiges, vernünftiges und wiederholbares Ratten-Silikose-Modell mit geringer Mortalität, weniger Verletzungen und mehr Schutz.

Einleitung

Silikose, die durch das Einatmen von Kieselsäure verursacht wird, ist die schwerste Berufskrankheit in China und macht jedes Jahr mehr als 80 % der Gesamtzahl der gemeldeten Berufskrankheiten aus¹. Die Ätiologie der Silikose ist klar und kann verhindert und kontrolliert werden, aber es gibt keine wirksame Behandlungsmethode². Viele Medikamente haben sich in Grundlagenstudien als wirksam erwiesen, aber sie haben ungenaue klinische^{Wirkungen 3,4}. Daher müssen die pathologischen und physiologischen Mechanismen der Silikose noch erforscht werden.

In vielen Studien wurde eine einmalige Infusion von Kieselsäure in die Luftröhre von Ratten oder Mäusen verwendet, um die Pathogenese der Silikose^{zu untersuchen 5,6}. Obwohl diese Nagetier-Silikotika-Modelle in kurzer Zeit erhalten werden konnten⁷, waren diese Methoden immer noch mit Herausforderungen verbunden, wie z. B. Tiertraumata und hohe Mortalität. Einige Studien beinhalteten die Instillation von gespeichertem Siliziumdioxid in die Lunge, um eine unspezifische Lungenreaktion auszulösen, erwähnten jedoch keine Kieselsäureknoten bei Mäusen⁸. Darüber hinaus führte die chronische Exposition gegenüber Kieselsäure im beruflichen Umfeld abseits der akuten Silikose zu einer signifikant geringeren Lungenentzündung und erhöhte die Spiegel anti-apoptotischer Marker anstelle von pro-apoptotischen Markern in der Lunge⁹. Daher wird ein zuverlässiges, vernünftiges und wiederholbares Tiermodell benötigt, um die Pathogenese der Silikose weiter zu erforschen.

Die vorliegende Studie beschreibt eine Methode zur Nachahmung des Krankheitsprozesses von Patienten mit Silikose durch Inhalation von Kieselsäure über den ganzen Körper, luftzugeführte Partikel in einer Inhalationskammer, die einen luftzugeführten Kieselsäuregenerator, eine Ganzkörperkammer und ein Abfallentsorgungssystem umfasste. Diese Methode ist einfach, leicht zu handhaben und ahmt effektiv den pathologischen dynamischen Evolutionsprozess der Silikose nach. Auch viele mögliche Mechanismen und die Pathogenese der Silikose werden mit dieser Methode identifiziert 10,11,12. Es wird erwartet, dass das vorgeschlagene Protokoll weitere Untersuchungen auf dem verwandten Gebiet der Silikoseforschung unterstützen wird.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß dem Leitfaden der US-amerikanischen National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Ethikausschuss der Nordchinesischen Universität für Wissenschaft und Technologie genehmigt (Protokollcode LX2019033 und 2019-3-3 der Genehmigung). Für die vorliegende Studie wurden männliche Wistar-Ratten im Alter von 3 Wochen verwendet. Alle Ratten wurden in statischen Käfigen mit Holzspänen gehalten. Die Tiere wurden in einem 12 h/12 h Hell-Dunkel-Zyklus gehalten und ad libitum mit Futter und Wasser versorgt. Folgeexperimente wurden nach 1 Woche adaptiver Fütterung durchgeführt.

1. Zubereitung von Tieren

1. Bei der Ankunft sollten alle Ratten in einem speziellen Raum untergebracht werden, der frei von Krankheitserregern (LSF) ist.
2. Die gesunden Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen eingeteilt (n = 10): Kontrollratten, die reine Luft einatmeten, und Ratten mit Silikose, die Kieselsäure inhalierten.

2. Herstellung von Kieselsäure

VORSICHT: Quarzstaub, der vom menschlichen Körper eingeatmet wird, kann die Lunge schädigen. Daher müssen Personen während der Operationen Overalls, medizinische Handschuhe und Schutzmasken (N95) tragen.

1. Die Kieselsäurepartikel (siehe Materialtabelle) werden vor jeder Belichtung 1,5 h lang mit einem Achatmörser gemahlen. Dies liegt daran, dass frisch gebrochener Quarz größere Mengen an aktiven Sauerstoffspezies produziert als gealterter Quarz¹³ und Kieselsäure mit einem Durchmesser von 1-5 μm am pathogensten ist.
2. Die Kieselsäure (30 g) wird nach dem Mahlen mit einer elektronischen Waage gewogen, in einen Glasbehälter gegeben und bei 180 °C 6 h in einem elektrischen Heizlufttrockner (siehe Materialtabelle) gebacken, um Krankheitserreger von der Oberfläche der Kieselsäurepartikel zu entfernen.

3. Kieselsäure-Exposition der Ratten

1. Verbinden Sie das Einspritz- und das handelsübliche Generatorsystem (siehe Materialtabelle) und geben Sie die Kieselsäure (30 g) in den Generator. Überprüfen Sie, ob die Verbindungsleitung in Ordnung ist, das Netzkabel angeschlossen ist und die Stromversorgung in Ordnung ist.
   1. Kontrollieren Sie den Wasserstand des Sprühturms und des Luftbefeuchters der Abgasreinigungsanlage (siehe Materialtabelle) manuell und füllen Sie Wasser nach, wenn dieser nicht ausreicht (nicht bis zur Normleitung).
   2. Geben Sie Leitungswasser in den Sprühturm des Abgasreinigungsgeräts und destilliertes Wasser in den Luftbefeuchter (Abbildung 1).
2. Schalten Sie die Abgasableitungseinrichtung (siehe Werkstofftabelle) und den Luftquellenschalter ein, um zu überprüfen, ob sich das Innere des Abschirmschranks im Unterdruckzustand befindet.
   1. Vergewissern Sie sich, dass die Flüssigkeitsmischung, die Pulvermischung, die Durchflussregelventile für Reingas und das Abwasserablassventil unter der Inhalationskammer geschlossen sind.
3. Setzen Sie insgesamt 10 Ratten in die Inhalationskammer (siehe Materialtabelle) und schließen Sie das Inhalationsfach und die abgeschirmten Schranktüren.
4. Stellen Sie die folgenden experimentellen Parameter auf der Instrumententafel oder im Computer ein: Schrankdruck: -50 bis -30 Pa; Sauerstoffkonzentration: 21%; Schranktemperatur: 26-30 °C; Luftfeuchtigkeit: 30%-70%; Staubeintragsrate: 2,0-2,5 ml/min; und Staubkonzentration im Schrank: 60 ± 5 mg/^m3.
   HINWEIS: Beobachten Sie die Versuchsdaten und den Gerätestatus während des Experiments kontinuierlich. Der Alarm bei Geräteausfall veranlasste eine zeitnahe Bearbeitung.
   1. Setzen Sie jedes Tier 3 Stunden pro Tag an 5 Tagen pro Woche kontinuierlich Kieselsäure aus und lassen Sie die Tiere in der Kontrollgruppe reine Luft einatmen.
5. Nach Beendigung des Versuchs ist das Mischgas-Durchflussregelventil zu schließen und das Reingas-Durchflussventil zu öffnen. Injizieren Sie das reine Gas kontinuierlich in die Inhalationskammer.
   ANMERKUNG: In der vorliegenden Studie wurde der Reingasstrom (7,0-7,5^m3/h) für mindestens 20 min injiziert, bis das giftige Gas in der Inhalationskammer vollständig ersetzt war.
   1. Schließen Sie das reine Luftstromventil, öffnen Sie die Tür, nehmen Sie die Ratten heraus und schicken Sie sie zurück in den pathogenfreien Raum.
6. Entnehmen Sie nacheinander das Rattengestell und die Komponenten des Abzweigrohrs und legen Sie sie zur Reinigung in die Spüle. Schließen Sie nach dem Spülen das automatische Reinigungsventil und öffnen Sie die Klappe.
   1. Wischen Sie die Innenwand mit einem sauberen Tuch ab oder schalten Sie das reine Gas ein, um den Tank zu trocknen. Zum Schluss führen Sie die Desinfektion durch. Nach der Reinigung und Desinfektion mit 75%igem Ethanol die Abluftklappe schließen und so schnell wie möglich die Tür der Inhalationskabine leicht öffnen, um die Feuchtigkeit zu verdunsten, damit das Innere der Inhalationskabine trocken bleibt.
7. Überprüfen Sie zweimal wöchentlich die Kieselsäurekonzentration im Schrank mit einem umfassenden atmosphärischen Probenehmer gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle), um die Stabilität der Kieselsäurekonzentration während des Experiments sicherzustellen. Kalibrieren Sie den atmosphärischen Probenehmer vor der Probenahme.
   1. Verwenden Sie eine digitale Einschalen-Analysenwaage für die gravimetrische Bestimmung. Die berechnete Kieselsäurekonzentration betrug 65 mg/^m3 (Abbildung 1 und Tabelle 1).
      HINWEIS: Wiegen Sie das Filterpapier vor und nach der Aufnahme von Kieselsäure. Die Konzentration der Kieselsäure wurde mit der folgenden Formel¹² berechnet:
      
      wobei W2 = Gewicht des Filterpapiers nach der Probenahme, W1 = Gewicht des Filterpapiers vor der Probenahme und V = Luftvolumen ist.

4. Erfassung und Fixierung von Lungengewebe

1. Euthanasie der Ratten durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (100 mg/kg Körpergewicht) und Lidocain (4 mg/kg Körpergewicht). Beurteilen Sie den Tod anhand des Verlusts des Herzschlags¹⁴.
2. Am Ende des Versuchs werden die rechte untere Lunge, Niere, Leber, Milz und Knochen mindestens 24 h lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und in 5-μm-Abschnitte geschnitten ^7,15.

5. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E)

1. Die Paraffinabschnitte in Xylol (siehe Materialtabelle) zweimal für jeweils^{10 Minuten 16} entparaffinieren und jeweils 3 Minuten in 100 % Ethanol, 95 % Ethanol, 90 % Ethanol, 80 % Ethanol, 70 % Ethanol und destilliertem Wasser rehydrieren.
2. Färben Sie die Abschnitte 5 Minuten lang mit Hämatoxylin (siehe Materialtabelle) und waschen Sie sie dann mit Wasser¹⁰.
3. Legen Sie die Abschnitte in 2%igen Salzalkohol und dann in destilliertes Wasser, bis die Farbe blau wird.
4. Färben Sie die Abschnitte 1 Minute lang mit Eosin, dehydrieren Sie sie mit 95%igem Ethanol, machen Sie sie mit Xylol transparent, versiegeln Sie sie mit neutralem Gummi und beobachten Sie sie unter einem Lichtmikroskop¹².

6. Immunhistochemische Färbung

1. Waschen Sie die Paraffinabschnitte regelmäßig mit Wasser.
2. Die Antigene werden 80 s lang bei hohem Druck (60 kPa) und hoher Temperatur (100 °C) exponiert und dann 15 Minuten lang mit einem endogenen Peroxidaseblocker (3%) blockiert, um die endogenen Peroxidasen zu eliminieren⁷.
3. Die Proben werden mit Antikörpern gegen CD68 (1:200 Verdünnung - 4 μl CD68 auf 396 μl Antikörperverdünnungsmittel zugeben; siehe Materialtabelle) bei 4 °C über Nacht inkubiert.
4. Die Proben werden mit einem sekundären Antikörper (HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG-Polymer; siehe Materialtabelle) bei 37 °C für 30 min inkubiert und anschließend mit 1x PBS gewaschen.
5. Visualisieren Sie die Immunreaktivität mit 3,3-Diaminobenzidin (DAB; siehe Materialtabelle). Nach dem Auftragen von DAB auf das Gewebe ist die Färbung des Gewebes unter dem Lichtmikroskop¹⁰ zu beobachten.
   HINWEIS: Die Färbezeit variierte je nach Färbezeit des Gewebes von einigen Sekunden bis zu einigen Minuten. Die Färbung wurde abgebrochen, indem die Schnitte in Wasser gelegt wurden. In dieser Studie stellte die braune Färbung des Gewebes die positive Expression von CD68 dar. Alle Antikörper wurden in 1x PBS verdünnt.

Ergebnisse

Mit der vorgeschlagenen Methode wurden einige mögliche Mechanismen und die Pathogenese der Silikose an Ratten untersucht. Das Schema der Inhalationskammer ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Kammer bestand aus einem luftzugeführten Silica-Generator, einer Ganzkörperkammer und einem Abfallentsorgungssystem, wie zuvor¹⁷ beschrieben. Die Lungenfunktionen, die Konzentrationen von Entzündungsfaktoren im Serum und in der Lunge, die Kollagenablagerung und die Differenzie...

Diskussion

Als Hauptverursacher der Silikose spielt Kieselsäure eine entscheidende Rolle bei der Formgebung. Die Kieselsäurepartikel, die von Patienten mit Pneumokoniose eingeatmet werden, sind frische, freie Kieselsäurepartikel, die durch mechanisches Schneiden hergestellt werden. Kieselsäure kann reaktive Sauerstoffspezies entweder direkt auf frisch gespaltenen Partikeloberflächen oder indirekt durch ihre Wirkung auf die Makrophagen²⁵ erzeugen. Daher ist die Vermahlung von Kieselsäurepartikeln von gr...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air detector (compressive atmospheric sampler)	Qingdao Xuyu Environmental Protection Technology Co. LTD
Anatomical table			No specific brand is recommended.
Antibody of CD68	Abcam	ab201340
DAB	ZSGB-BIO	ZLI-9018
Electric heating air-blowing drier	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD
Electronic balance	OHRUS
Embedding machine	leica
Exhaust gas discharge device	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Generator systems	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Gloves (thin laboratory gloves)	The secco medical
Hematoxylin and eosin	BaSO Diagnostics Inc.	BA4025
HOPE MED 8050 exposure control apparatus	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Inhalation chamber	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Injection syringe			No specific brand is recommended.
Light microscope	olympus
Object slide	shitai
PV-6000 (HRP-conjugated goat anti-mouse IgG polymer)	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co. Ltd	s5631
Silicon dioxide	Sigma-Aldrich
Slicing machine	leica	RM2255
Waste gas treatment device	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Wet box	Cooperative plastic Products Factory
Xylol	Tianjin Yongda Chemical Reagent Co., LTD