Estabelecendo um modelo de silicose em ratos via exposição de corpo inteiro à sílica respirável

Resumo

Este estudo descreve uma técnica para estabelecer um modelo de silicose em ratos com inalação de sílica por todo o corpo em uma câmara inalatória. Os ratos com silicose poderiam mimetizar de perto o processo patológico da silicose humana de maneira fácil, econômica e com boa repetibilidade.

Resumo

A principal causa de silicose é a inalação de sílica no ambiente ocupacional. Apesar de algumas diferenças anatômicas e fisiológicas, os modelos de roedores continuam sendo uma ferramenta essencial para o estudo da silicose humana. Para a silicose, o processo patológico clássico precisa ser induzível através da inalação de partículas de quartzo recém-geradas, o que significa induzir especificamente doença ocupacional humana. Este estudo descreveu uma técnica para estabelecer e mimetizar efetivamente o processo dinâmico patológico evolutivo da silicose. Além disso, a técnica apresentou boa repetibilidade, sem cirurgia envolvida. O sistema de exposição inalatória foi fabricado, validado e utilizado para estudos toxicológicos sobre inalação de partículas respiráveis. Os componentes críticos foram os seguintes: (1) gerador de pó SiO₂ seco a granel ajustado com um controlador de fluxo de ar; (2) 0,3^m3 de câmara de exposição inalatória de corpo inteiro acomodando até 3 ratos adultos; (3) um sistema de monitoramento e controle para regular a concentração de oxigênio, temperatura, umidade e pressão em tempo real; e (4) um sistema de barreira e disposição de resíduos para proteger os técnicos de laboratório e o meio ambiente. Em resumo, o presente protocolo relata a inalação por todo o corpo, e a câmara inalatória criou um modelo silicótico de rato confiável, razoável e repetível, com baixa mortalidade, menos lesões e mais proteção.

Introdução

A silicose, causada pela inalação de sílica, é a doença ocupacional mais grave na China, sendo responsável por mais de 80% do total de notificações de doenças ocupacionais a cada ano¹. A etiologia da silicose é clara, podendo ser prevenida e controlada, mas não há método de tratamento efetivo disponível². Muitos fármacos têm se mostrado eficazes em estudos básicos, mas apresentam efeitos clínicos imprecisos ^3,4. Portanto, os mecanismos patológicos e fisiológicos da silicose ainda precisam ser explorados.

Muitos estudos têm utilizado a infusão única de sílica na traqueia de ratos ou camundongos para investigar a patogênese da silicose ^5,6. Embora esses modelos silicóticos de roedores pudessem ser obtidos em curto espaço de^tempo7, esses métodos ainda apresentavam desafios, como trauma animal e alta mortalidade. Alguns estudos envolveram a instilação de sílica armazenada nos pulmões para induzir uma reação pulmonar inespecífica, mas não mencionaram nódulos silicóticos em camundongos⁸. Além disso, longe da silicose aguda, a exposição crônica à sílica em ambientes ocupacionais induziu inflamação pulmonar significativamente menor e elevou os níveis de marcadores antiapoptóticos, em vez de pró-apoptóticos, nos pulmões⁹. Portanto, um modelo animal confiável, razoável e repetível é necessário para explorar melhor a patogênese da silicose.

O presente estudo descreve um método para mimetizar o processo de doença de pacientes com silicose através da inalação de sílica através de todo o corpo, partículas liberadas pelo ar em uma câmara de inalação, que compreende um gerador de sílica liberado pelo ar, uma câmara de corpo inteiro e um sistema de descarte de resíduos. Este método é simples, fácil de operar e imita efetivamente o processo de evolução dinâmica patológica da silicose. Além disso, vários possíveis mecanismos e a patogênese da silicose são identificados por esse método 10,11,12. Espera-se que o protocolo proposto auxilie futuras investigações no campo relacionado à pesquisa em silicose.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Ciência e Tecnologia do Norte da China (código de protocolo LX2019033 e 2019-3-3 de aprovação). Ratos Wistar machos, com 3 semanas de idade, foram utilizados para o presente estudo. Todos os ratos foram mantidos em gaiolas estáticas com aparas de madeira. Os animais foram mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h e receberam ração e água ad libitum. Experimentos de seguimento foram conduzidos após 1 semana de alimentação adaptativa.

1. Preparo dos animais

1. Na chegada, alojar todos os ratos em uma sala específica livre de patógenos (SPF).
2. Dividir aleatoriamente os ratos sadios em dois grupos (n = 10): ratos controle inalando ar puro e ratos com silicose inalando sílica.

2. Preparação de sílica

CUIDADO: O pó de sílica inalado pelo corpo humano pode danificar os pulmões. Portanto, os indivíduos devem usar macacão, luvas médicas e máscaras de proteção (E95) durante as operações.

1. Triturar as partículas de sílica (ver Tabela de Materiais) com uma argamassa de ágata durante 1,5 h antes de cada exposição. Isso ocorre porque o quartzo recém-fraturado produz maiores quantidades de espécies ativas de oxigênio do que o quartzo envelhecido¹³, e a sílica com diâmetro de 1-5 μm é a mais patogênica.
2. Pesar a sílica (30 g) usando uma balança eletrônica após a moagem, colocá-la em um recipiente de vidro e assar a 180 °C por 6 h em um secador de ar de aquecimento elétrico (ver Tabela de Materiais) para eliminar patógenos da superfície das partículas de sílica.

3. Exposição à sílica nos ratos

1. Conecte a injeção e os sistemas geradores disponíveis comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) e coloque a sílica (30 g) no gerador. Verifique se o pipeline de conexão está normal, se o cabo de alimentação está conectado e se a fonte de alimentação está normal.
   1. Verifique o nível de água da torre de pulverização e o umidificador do dispositivo de tratamento de gases residuais (ver Tabela de Materiais) manualmente e adicione água se for insuficiente (não está na linha padrão).
   2. Adicione água da torneira à torre de pulverização do dispositivo de tratamento de gases residuais e água destilada ao umidificador (Figura 1).
2. Ligue o dispositivo de descarga de gases de escape (ver Tabela de Materiais) e o interruptor da fonte de ar para confirmar se o interior do gabinete de proteção está em estado de pressão negativa.
   1. Confirme se a mistura de líquidos, a mistura de pó, as válvulas de controle de fluxo de gás puro e a válvula de descarga de águas residuais sob a câmara de inalação estão fechadas.
3. Coloque um total de 10 ratos na câmara de inalação (ver Tabela de Materiais) e feche o compartimento de inalação e as portas do armário blindado.
4. Ajuste os seguintes parâmetros experimentais no painel de instrumentos ou no computador: pressão do gabinete: -50 a -30 Pa; concentração de oxigênio: 21%; temperatura do armário: 26-30 °C; umidade: 30%-70%; taxa de entrada de poeira: 2,0-2,5 mL/min; e concentração de poeira no gabinete: 60 ± 5 mg/m³.
   NOTA: Observe os dados experimentais e o estado do equipamento continuamente durante o experimento. O alarme de falha do equipamento motivou o processamento em tempo hábil.
   1. Expor cada animal à sílica continuamente por 3 h por dia, 5 dias por semana, e permitir que os animais do grupo controle inalem ar puro.
5. Após a conclusão do experimento, feche a válvula de controle de fluxo de gás misto e abra a válvula de fluxo de gás puro. Injete o gás puro continuamente na câmara de inalação.
   OBS: No presente estudo, o fluxo de gás puro (7,0-7,5 m³/h) foi injetado por pelo menos 20 min até que o gás venenoso na câmara de inalação fosse completamente substituído.
   1. Feche a válvula de fluxo de ar puro, abra a porta, retire os ratos e envie-os de volta para a sala livre de patógenos.
6. Remova o rack do rato e os componentes do tubo de ramificação em sequência e coloque-os na pia para limpeza. Após o enxágue, feche a válvula de limpeza automática e abra a escotilha.
   1. Limpe a parede interna com um pano limpo ou ligue o gás puro para secar o tanque. Por fim, realize a desinfecção. Após limpar e desinfetar com etanol 75%, feche o portão de exaustão e, assim que possível, abra levemente a porta da cabine de inalação para evaporar a umidade, de modo que o interior da cabine de inalação permaneça seco.
7. Verifique a concentração de sílica no gabinete com um amostrador atmosférico abrangente seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais) duas vezes por semana para garantir a estabilidade da concentração de sílica durante o experimento. Calibrar o amostrador atmosférico antes da amostragem.
   1. Use uma balança analítica digital de panela única para determinação gravimétrica. A concentração calculada de sílica foi de 65 mg/^m3 (Figura 1 e Tabela 1).
      OBS: Pesar o papel filtro antes e depois da absorção da sílica. A concentração de sílica foi calculada utilizando-se a seguinte fórmula¹²:
      
      onde W2 = peso do papel de filtro após a amostragem, W1 = peso do papel de filtro antes da amostragem e V = volume do ar.

4. Aquisição e fixação dos tecidos pulmonares

1. Eutanásia dos ratos por injeção intraperitoneal de pentobarbital (100 mg/kg de peso corporal) e lidocaína (4 mg/kg de peso corporal). Avaliar a morte pela perda dos batimentos cardíacos¹⁴.
2. Ao final do experimento, fixar o pulmão inferior direito, rim, fígado, baço e osso com paraformaldeído a 4% por pelo menos 24 h, embutir em parafina e cortar em cortes de 5 μm ^7,15.

5. Coloração para hematoxilina e eosina (H&E)

1. Desparafinizar as seções de parafina em xilol (ver Tabela de Materiais) duas vezes por 10 min a cada¹⁶ e reidratar em etanol 100%, etanol 95%, etanol 90%, etanol 80%, etanol 70% e água destilada por 3 min cada.
2. Manchar os cortes com hematoxilina (ver Tabela de Materiais) por 5 min e, em seguida, lavar os cortes com água¹⁰.
3. Coloque as secções em álcool clorídrico a 2% e depois em água destilada até que a cor mude para azul.
4. Manchar os cortes com eosina por 1 min, desidratá-los com etanol 95%, torná-los transparentes com xileno, selá-los com goma neutra e observar ao microscópio de luz¹².

6. Coloração imuno-histoquímica

1. Lave rotineiramente as seções de parafina com água.
2. Expor os antígenos a alta pressão (60 kPa) e alta temperatura (100 °C) por 80 s e, em seguida, bloquear com bloqueador da peroxidase endógena (3%) por 15 min para eliminar as peroxidases endógenas⁷.
3. Incubar as amostras com anticorpos dirigidos contra CD68 (diluição 1:200 - adicionar 4 μL de CD68 a 396 μL de diluente de anticorpos; ver Tabela de Materiais) a 4 °C durante a noite.
4. Incubar as amostras com um anticorpo secundário (polímero IgG de cabra anti-rato conjugado com HRP; ver Tabela de Materiais) a 37 °C durante 30 minutos e, em seguida, lavar as amostras com 1x PBS.
5. Visualize a imunorreatividade com 3,3-diaminobenzidina (DAB; ver Tabela de Materiais). Após a aplicação de DAB no tecido, observar a coloração do tecido ao microscópio de luz¹⁰.
   OBS: O tempo de coloração variou de poucos segundos a poucos minutos de acordo com o tempo de coloração do tecido. O procedimento de coloração foi abortado colocando-se os cortes em água. Neste estudo, a coloração marrom do tecido representou a expressão positiva de CD68. Todos os anticorpos foram diluídos em 1x PBS.

Resultados

Usando o método proposto, alguns mecanismos potenciais e a patogênese da silicose foram explorados em ratos. O esquema da câmara inalatória é mostrado na Figura 1. A câmara consistia de um gerador de sílica liberado a ar, uma câmara de corpo inteiro e um sistema de disposição de resíduos, conforme descrito anteriormente¹⁷. As funções pulmonares, os níveis de fatores inflamatórios no soro e pulmão, a deposição de colágeno e a diferenciação miofibro...

Discussão

Como principal causa de silicose, a sílica desempenha um papel decisivo na moldagem. As partículas de sílica inaladas por pacientes com pneumoconiose são partículas frescas e livres de sílica produzidas por corte mecânico. A sílica pode gerar espécies reativas de oxigênio diretamente na superfície das partículas recém-clivadas ou indiretamente através de seu efeito sobre os macrófagos²⁵. Portanto, a moagem de partículas de sílica é de grande importância. No protocolo proposto, a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air detector (compressive atmospheric sampler)	Qingdao Xuyu Environmental Protection Technology Co. LTD
Anatomical table			No specific brand is recommended.
Antibody of CD68	Abcam	ab201340
DAB	ZSGB-BIO	ZLI-9018
Electric heating air-blowing drier	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD
Electronic balance	OHRUS
Embedding machine	leica
Exhaust gas discharge device	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Generator systems	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Gloves (thin laboratory gloves)	The secco medical
Hematoxylin and eosin	BaSO Diagnostics Inc.	BA4025
HOPE MED 8050 exposure control apparatus	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Inhalation chamber	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Injection syringe			No specific brand is recommended.
Light microscope	olympus
Object slide	shitai
PV-6000 (HRP-conjugated goat anti-mouse IgG polymer)	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co. Ltd	s5631
Silicon dioxide	Sigma-Aldrich
Slicing machine	leica	RM2255
Waste gas treatment device	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Wet box	Cooperative plastic Products Factory
Xylol	Tianjin Yongda Chemical Reagent Co., LTD