Creazione di un modello di ratto silicosi attraverso l'esposizione di tutto il corpo alla silice respirabile

Riepilogo

Questo studio descrive una tecnica per stabilire un modello di ratto di silicosi con l'inalazione di silice attraverso tutto il corpo in una camera di inalazione. I ratti con silicosi potrebbero imitare da vicino il processo patologico della silicosi umana in modo semplice, economico e con una buona ripetibilità.

Abstract

La causa principale della silicosi è l'inalazione di silice nell'ambiente di lavoro. Nonostante alcune differenze anatomiche e fisiologiche, i modelli di roditori continuano ad essere uno strumento essenziale per lo studio della silicosi umana. Per la silicosi, il classico processo patologico deve essere inducibile attraverso l'inalazione di particelle di quarzo appena generate, il che significa indurre specificamente malattie professionali umane. Questo studio ha descritto una tecnica per stabilire e imitare efficacemente il processo di evoluzione dinamica patologica della silicosi. Inoltre, la tecnica ha avuto una buona ripetibilità senza alcun intervento chirurgico. Il sistema di esposizione per inalazione è stato fabbricato, convalidato e utilizzato per studi tossicologici sull'inalazione di particelle respirabili. I componenti critici erano i seguenti: (1) generatore di polveri SiO₂ a secco sfuso regolato con un regolatore del flusso d'aria; (2) camera di esposizione per inalazione di 0,3 m³ per tutto il corpo in grado di ospitare fino a 3 ratti adulti; (3) un sistema di monitoraggio e controllo per regolare la concentrazione di ossigeno, la temperatura, l'umidità e la pressione in tempo reale; e (4) una barriera e un sistema di smaltimento dei rifiuti per proteggere i tecnici di laboratorio e l'ambiente. In sintesi, il presente protocollo riporta l'inalazione attraverso tutto il corpo e la camera di inalazione ha creato un modello silicotico di ratto affidabile, ragionevole e ripetibile con bassa mortalità, meno lesioni e più protezione.

Introduzione

La silicosi, causata dall'inalazione di silice, è la malattia professionale più grave in Cina, rappresentando oltre l'80% del numero totale di segnalazioni di malattie professionali ogni anno¹. L'eziologia della silicosi è chiara e può essere prevenuta e controllata, ma non è disponibile un metodo di trattamento efficace². Molti farmaci si sono dimostrati efficaci negli studi di base, ma hanno effetti clinici imprecisi ^3,4. Pertanto, i meccanismi patologici e fisiologici della silicosi devono ancora essere esplorati.

Molti studi hanno utilizzato un'infusione una tantum di silice nella trachea di ratti o topi per studiare la patogenesi della silicosi ^5,6. Sebbene questi modelli silicotici di roditori potessero essere ottenuti in breve tempo⁷, questi metodi presentavano ancora delle sfide, come traumi animali e un'elevata mortalità. Alcuni studi hanno coinvolto l'instillazione di silice immagazzinata nei polmoni per indurre una reazione polmonare non specifica, ma non hanno menzionato i noduli silicotici nei topi⁸. Inoltre, lontano dalla silicosi acuta, l'esposizione cronica alla silice negli ambienti di lavoro ha indotto un'infiammazione polmonare significativamente più bassa e ha elevato i livelli di marcatori anti-apoptotici, piuttosto che di marcatori pro-apoptotici, nei polmoni⁹. Pertanto, è necessario un modello animale affidabile, ragionevole e ripetibile per esplorare ulteriormente la patogenesi della silicosi.

Il presente studio descrive un metodo per imitare il processo patologico dei pazienti con silicosi attraverso l'inalazione di silice attraverso tutto il corpo, particelle erogate dall'aria in una camera di inalazione, che comprendeva un generatore di silice erogato dall'aria, una camera per tutto il corpo e un sistema di smaltimento dei rifiuti. Questo metodo è semplice, facile da usare e imita efficacemente il processo di evoluzione dinamica patologica della silicosi. Inoltre, molti possibili meccanismi e la patogenesi della silicosi sono identificati utilizzando questo metodo 10,11,12. Si prevede che il protocollo proposto aiuterà ulteriori indagini nel campo correlato della ricerca sulla silicosi.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo la Guida del National Institutes of Health degli Stati Uniti per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e approvati dal Comitato per l'etica della North China University of Science and Technology (codice protocollo LX2019033 e 2019-3-3 di approvazione). Per il presente studio sono stati utilizzati ratti Wistar maschi, di 3 settimane di età. Tutti i ratti sono stati tenuti in gabbie statiche con trucioli di legno. Gli animali sono stati mantenuti in un ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore e sono stati forniti di cibo e acqua ad libitum. Gli esperimenti di follow-up sono stati condotti dopo 1 settimana di alimentazione adattativa.

1. Preparazione dell'animale

1. All'arrivo, alloggia tutti i ratti in una stanza specifica priva di agenti patogeni (SPF).
2. Dividi in modo casuale i ratti sani in due gruppi (n = 10): ratti di controllo che inalano aria pura e ratti con silicosi che inalano silice.

2. Preparazione della silice

ATTENZIONE: La polvere di silice inalata dal corpo umano può danneggiare i polmoni. Pertanto, le persone devono indossare tute, guanti medici e maschere protettive (N95) durante le operazioni.

1. Macinare le particelle di silice (vedi Tabella dei materiali) con una malta d'agata per 1,5 ore prima di ogni esposizione. Questo perché il quarzo appena fratturato produce maggiori quantità di specie di ossigeno attivo rispetto al quarzo^{invecchiato 13} e la silice con un diametro di 1-5 μm è la più patogeno.
2. Pesare la silice (30 g) utilizzando una bilancia elettronica dopo la macinazione, metterla in un contenitore di vetro e cuocerla a 180 °C per 6 ore in un essiccatore elettrico a riscaldamento (vedi Tabella dei materiali) per eliminare gli agenti patogeni dalla superficie delle particelle di silice.

3. Esposizione alla silice per i ratti

1. Collegare l'iniezione e i sistemi di generazione disponibili in commercio (vedere la tabella dei materiali) e inserire la silice (30 g) nel generatore. Controllare se la tubazione di connessione è normale, il cavo di alimentazione è collegato e l'alimentazione è normale.
   1. Controllare manualmente il livello dell'acqua della torre di spruzzatura e dell'umidificatore del dispositivo di trattamento dei gas di scarico (vedi Tabella dei materiali) e aggiungere acqua se è insufficiente (non fino alla linea standard).
   2. Aggiungere acqua di rubinetto alla torre di spruzzatura del dispositivo di trattamento dei gas di scarico e acqua distillata all'umidificatore (Figura 1).
2. Accendere il dispositivo di scarico dei gas di scarico (vedere la tabella dei materiali) e l'interruttore della fonte d'aria per verificare se l'interno dell'armadio di schermatura è in uno stato di pressione negativa.
   1. Verificare che la miscelazione di liquidi, polveri, valvole di controllo del flusso di gas puro e valvola di scarico delle acque reflue sotto la camera di inalazione siano chiuse.
3. Mettere un totale di 10 ratti nella camera di inalazione (vedere la tabella dei materiali) e chiudere lo scomparto di inalazione e le porte dell'armadio schermate.
4. Impostare i seguenti parametri sperimentali sul quadro strumenti o nel computer: pressione dell'armadio: da -50 a -30 Pa; concentrazione di ossigeno: 21%; temperatura dell'armadio: 26-30 °C; umidità: 30%-70%; velocità di ingresso della polvere: 2,0-2,5 mL/min; e concentrazione di polvere dell'armadio: 60 ± 5 mg/m³.
   NOTA: Osservare continuamente i dati sperimentali e lo stato dell'apparecchiatura durante l'esperimento. L'allarme di guasto dell'apparecchiatura ha richiesto un'elaborazione tempestiva.
   1. Esporre ogni animale alla silice continuamente per 3 ore al giorno, 5 giorni alla settimana, e consentire agli animali del gruppo di controllo di inalare aria pura.
5. Al termine dell'esperimento, chiudere la valvola di controllo del flusso di gas miscelato e aprire la valvola di flusso del gas puro. Iniettare continuamente il gas puro nella camera di inalazione.
   NOTA: Nel presente studio, il flusso di gas puro (7,0-7,5 m³/h) è stato iniettato per almeno 20 minuti fino a quando il gas velenoso nella camera di inalazione è stato completamente sostituito.
   1. Chiudere la valvola del flusso d'aria pura, aprire la porta, far uscire i ratti e rimandarli nella stanza priva di agenti patogeni.
6. Rimuovere la rastrelliera per topi e i componenti del tubo di derivazione in sequenza e posizionarli nel lavandino per la pulizia. Dopo il risciacquo, chiudere la valvola di pulizia automatica e aprire il portello.
   1. Pulisci la parete interna con un panno pulito o accendi il gas puro per asciugare il serbatoio. Infine, effettuare la disinfezione. Dopo la pulizia e la disinfezione con etanolo al 75%, chiudere la saracinesca di scarico e, appena possibile, aprire leggermente la porta della cabina di inalazione per far evaporare l'umidità, in modo che l'interno della cabina di inalazione rimanga asciutto.
7. Controllare la concentrazione di silice nell'armadio con un campionatore atmosferico completo seguendo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali) due volte alla settimana per garantire la stabilità della concentrazione di silice durante l'esperimento. Calibrare il campionatore atmosferico prima del campionamento.
   1. Per la determinazione gravimetrica è possibile utilizzare una bilancia analitica digitale a piatto singolo. La concentrazione di silice calcolata è stata di 65 mg/^m3 (Figura 1 e Tabella 1).
      NOTA: Pesare la carta da filtro prima e dopo l'assorbimento della silice. La concentrazione di silice è stata calcolata utilizzando la seguente formula¹²:
      
      dove W2 = peso della carta da filtro dopo il campionamento, W1 = peso della carta da filtro prima del campionamento e V = volume dell'aria.

4. Acquisizione e fissazione dei tessuti polmonari

1. Sopprimere i ratti mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital (100 mg/kg di peso corporeo) e lidocaina (4 mg/kg di peso corporeo). Valutare la morte per perdita del battito cardiaco¹⁴.
2. Alla fine dell'esperimento, fissare il polmone inferiore destro, il rene, il fegato, la milza e l'osso con paraformaldeide al 4% per almeno 24 ore, incorporare in paraffina e tagliare in sezioni^da 5 μm ^7,15.

5. Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E)

1. Deparaffinizzare le sezioni di paraffina nello xilolo (vedere Tabella dei materiali) due volte per 10 minuti ogni¹⁶ e reidratare in etanolo al 100%, etanolo al 95%, etanolo al 90%, etanolo all'80%, etanolo al 70% e acqua distillata per 3 minuti ciascuna.
2. Colorare le sezioni con ematossilina (vedere la tabella dei materiali) per 5 minuti, quindi lavare le sezioni con acqua¹⁰.
3. Mettere le sezioni in alcool cloridrico al 2% e poi in acqua distillata fino a quando il colore non cambia in blu.
4. Colorare le sezioni con eosina per 1 minuto, disidratarle con etanolo al 95%, renderle trasparenti con xilene, sigillarle con gomma neutra e osservare al microscopio ottico¹².

6. Colorazione immunoistochimica

1. Lavare regolarmente le sezioni di paraffina con acqua.
2. Esporre gli antigeni ad alta pressione (60 kPa) e ad alta temperatura (100 °C) per 80 s e poi bloccare con un bloccante della perossidasi endogena (3%) per 15 min per eliminare le perossidasi endogene⁷.
3. Incubare i campioni con anticorpi diretti contro CD68 (diluizione 1:200 - aggiungere 4 μL di CD68 a 396 μL di diluente anticorpale; vedere Tabella dei materiali) a 4 °C per una notte.
4. Incubare i campioni con un anticorpo secondario (polimero IgG anti-topo di capra coniugato con HRP; vedere la tabella dei materiali) a 37 °C per 30 minuti, quindi lavare i campioni con 1x PBS.
5. Visualizzare l'immunoreattività con la 3,3-diaminobenzidina (DAB; vedere la tabella dei materiali). Dopo aver applicato DAB sul tessuto, osservare la colorazione del tessuto al microscopio ottico¹⁰.
   NOTA: Il tempo di colorazione variava da pochi secondi a pochi minuti in base al tempo di colorazione del tessuto. La procedura di colorazione è stata interrotta mettendo le sezioni in acqua. In questo studio, la colorazione marrone del tessuto ha rappresentato l'espressione positiva di CD68. Tutti gli anticorpi sono stati diluiti in 1x PBS.

Risultati

Utilizzando il metodo proposto, sono stati esplorati alcuni potenziali meccanismi e la patogenesi della silicosi nei ratti. Lo schema della camera di inalazione è mostrato in Figura 1. La camera era costituita da un generatore di silice erogato ad aria, da una camera a corpo intero e da un sistema di smaltimento dei rifiuti, come descritto in precedenza¹⁷. Le funzioni polmonari, i livelli di fattori infiammatori nel siero e nel polmone, la deposizione di collagene e ...

Discussione

Essendo la principale causa di silicosi, la silice svolge un ruolo decisivo nello stampaggio. Le particelle di silice inalate dai pazienti con pneumoconiosi sono particelle di silice fresca e libera prodotte dal taglio meccanico. La silice può generare specie reattive dell'ossigeno direttamente sulle superfici delle particelle appena scisse o indirettamente attraverso il suo effetto sui macrofagi²⁵. Pertanto, la macinazione delle particelle di silice è di grande importanza. Nel protocollo propos...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air detector (compressive atmospheric sampler)	Qingdao Xuyu Environmental Protection Technology Co. LTD
Anatomical table			No specific brand is recommended.
Antibody of CD68	Abcam	ab201340
DAB	ZSGB-BIO	ZLI-9018
Electric heating air-blowing drier	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD
Electronic balance	OHRUS
Embedding machine	leica
Exhaust gas discharge device	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Generator systems	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Gloves (thin laboratory gloves)	The secco medical
Hematoxylin and eosin	BaSO Diagnostics Inc.	BA4025
HOPE MED 8050 exposure control apparatus	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Inhalation chamber	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Injection syringe			No specific brand is recommended.
Light microscope	olympus
Object slide	shitai
PV-6000 (HRP-conjugated goat anti-mouse IgG polymer)	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co. Ltd	s5631
Silicon dioxide	Sigma-Aldrich
Slicing machine	leica	RM2255
Waste gas treatment device	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Wet box	Cooperative plastic Products Factory
Xylol	Tianjin Yongda Chemical Reagent Co., LTD