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요약

본 연구는 흡입실에서 전신을 통해 실리카를 흡입하여 규폐쥐 모델을 확립하는 기술을 기술한다. 규폐증이 있는 쥐는 인간 규폐증의 병리학적 과정을 쉽고 비용 효율적인 방식으로 우수한 반복성으로 모방할 수 있습니다.

초록

규폐증의 주요 원인은 직업 환경에서 실리카를 흡입하는 것입니다. 일부 해부학적 및 생리학적 차이에도 불구하고 설치류 모델은 인간 규폐증을 연구하는 데 필수적인 도구입니다. 규폐증의 경우, 고전적인 병리학적 과정은 새로 생성된 석영 입자의 흡입을 통해 유도될 수 있어야 하며, 이는 특히 인간의 직업병을 유발하는 것을 의미합니다. 이 연구는 규폐증의 병리학적 동적 진화 과정을 확립하고 효과적으로 모방하는 기술을 설명했습니다. 또한, 이 기술은 수술을 수반하지 않고도 반복성이 우수했습니다. 흡입 노출 시스템은 호흡 가능한 입자 흡입에 대한 독성학 연구에 제작, 검증 및 사용되었습니다. 중요한 구성 요소는 다음과 같습니다 : (1) 공기 흐름 컨트롤러로 조정 된 벌크 건식 SiO2 분말 발생기; (2) 최대 3마리의 성체 쥐를 수용하는 0.3m3 전신 흡입 노출 챔버; (3) 산소 농도, 온도, 습도 및 압력을 실시간으로 조절하는 모니터링 및 제어 시스템; (4) 실험실 기술자와 환경을 보호하기 위한 장벽 및 폐기물 처리 시스템. 요약하면, 본 프로토콜은 전신을 통한 흡입을 보고하며, 흡입 챔버는 낮은 사망률, 더 적은 부상 및 더 많은 보호 기능을 갖춘 신뢰할 수 있고 합리적이며 반복 가능한 쥐 규산염 모델을 만들었습니다.

서문

실리카 흡입으로 인해 발생하는 규폐증은 중국에서 가장 심각한 직업병으로 매년 보고되는 총 직업병 신고 건수의 80% 이상을 차지합니다1. 규폐증의 원인은 명확하고 예방과 조절이 가능하지만 효과적인 치료 방법이 없다2. 많은 약물이 기초 연구에서 효과가 입증되었지만 임상적 효과가 정확하지 않습니다 3,4. 따라서 규폐증의 병리학적, 생리학적 메커니즘은 여전히 탐구되어야 합니다.

많은 연구에서 규폐증의 발병 기전을 조사하기 위해 쥐 또는 생쥐의 기관에 실리카를 1회 주입하는 방법을 사용했습니다 5,6. 이러한 설치류 규산염 모델은 단기간에 얻을 수 있었지만7 이러한 방법은 여전히 동물 외상과 높은 사망률과 같은 문제를 안고 있었다. 일부 연구에서는 저장된 실리카를 폐에 주입하여 비특이적 폐 반응을 유도하는 방법을 사용했지만, 마우스의 규폐성 결절에 대해서는 언급하지 않았다8. 또한, 급성 규폐증과는 별개로, 직업 환경에서 실리카에 만성적으로 노출되면 폐 염증이 현저히 낮아졌고 폐에서 세포사멸 촉진 마커가 아닌 항세포사멸 마커의 수치가 상승했다9. 따라서 규폐증의 발병 기전을 더 자세히 조사하기 위해서는 신뢰할 수 있고 합리적이며 반복 가능한 동물 모델이 필요합니다.

본 연구는 전신을 통한 실리카 흡입, 공기 전달 실리카 발생기, 전신 챔버 및 폐기물 처리 시스템으로 구성된 흡입 챔버에서 공기 전달 입자를 통해 규폐증 환자의 질병 과정을 모방하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 간단하고 작동하기 쉬우며 규폐증의 병리학적 동적 진화 과정을 효과적으로 모방합니다. 또한, 규폐증의 많은 가능한 메커니즘과 발병기전은 이 방법10,11,12를 사용하여 확인된다. 제안된 프로토콜은 규폐증 연구의 관련 분야에서 추가 조사에 도움이 될 것으로 예상됩니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 실험동물의 관리 및 사용을 위한 미국 국립보건원 가이드에 따라 수행되었으며 화북과학기술대학 윤리위원회의 승인을 받았습니다(프로토콜 코드 LX2019033 및 2019-3-3 승인). 본 연구에는 생후 3주 된 수컷 Wistar 쥐가 사용되었습니다. 모든 쥐는 나무 부스러기가 있는 고정 케이지에 보관되었습니다. 동물들은 12시간/12시간 밝음/어두움 주기로 유지되었으며, 음식과 물이 즉시 제공되었다. 후속 실험은 적응 섭식 1주일 후에 수행되었습니다.

1. 동물 준비

  1. 도착하자마자 모든 쥐를 특정 병원균 (SPF) 방에 수용하십시오.
  2. 건강한 쥐를 무작위로 두 그룹(n = 10)으로 나눕니다: 순수한 공기를 흡입하는 대조군 쥐와 실리카를 흡입하는 규폐증이 있는 쥐.

2. 실리카 준비

주의 : 인체에서 흡입한 실리카 먼지는 폐를 손상시킬 수 있습니다. 따라서 개인은 수술 중에 작업복, 의료용 장갑 및 보호 마스크(N95)를 착용해야 합니다.

  1. 실리카 입자( 재료 표 참조)를 각 노출 전에 1.5시간 동안 마노 모르타르로 분쇄합니다. 이는 갓 파쇄된 석영이 숙성된 석영보다 더 많은 양의 활성 산소 종을 생성하기 때문입니다.13 직경 1-5μm의 실리카가 가장 병원성이 높습니다.
  2. 분쇄 후 전자 저울을 사용하여 실리카(30g)의 무게를 측정하고 유리 용기에 넣고 180°C에서 전기 가열 공기 송풍 건조기( 재료 표 참조)에서 6시간 동안 굽고 실리카 입자 표면에서 병원균을 제거합니다.

3. 쥐에 대한 실리카 노출

  1. 주입 장치와 시중에서 판매되는 발생기 시스템( 재료 표 참조)을 연결하고 실리카(30g)를 발생기에 넣습니다. 연결 파이프라인이 정상인지, 전원 코드가 연결되어 있는지, 전원 공급이 정상인지 확인하십시오.
    1. 분무탑의 수위와 폐가스처리장치의 가습기( 재료표 참조)를 수동으로 확인하고, 물이 부족하면(표준선에 미치지 못함) 물을 추가한다.
    2. 폐가스 처리 장치의 스프레이 타워에 수돗물을 추가하고 가습기에 증류수를 추가합니다(그림 1).
  2. 배기 가스 배출 장치( 재료 표 참조)와 공기 소스 스위치를 켜서 차폐 캐비닛 내부가 음압 상태인지 확인합니다.
    1. 흡입 챔버 아래의 액체 혼합, 분말 혼합, 순수 가스 흐름 제어 밸브 및 폐수 배출 밸브가 닫혀 있는지 확인합니다.
  3. 흡입실에 총 10마리의 쥐를 넣고( 재료 표 참조) 흡입실과 차폐된 캐비닛 도어를 닫습니다.
  4. 계기판 또는 컴퓨터에서 다음 실험 매개변수를 설정합니다. 캐비닛 압력: -50 to -30 Pa; 산소 농도 : 21 %; 캐비닛 온도: 26-30 °C; 습도 : 30 % -70 %; 먼지 유입 속도: 2.0-2.5mL/분; 그리고 장 먼지 농도: 60 ± 5 mg/m3.
    알림: 실험 중 실험 데이터 및 장비 상태를 지속적으로 관찰하십시오. 장비 고장 경보는 적시에 처리하도록 촉구했습니다.
    1. 각 동물을 일주일에 5일, 하루 3시간 동안 지속적으로 실리카에 노출시키고 대조군의 동물이 순수한 공기를 흡입하도록 합니다.
  5. 실험이 완료되면 혼합 가스 유량 제어 밸브를 닫고 순수 가스 유량 밸브를 엽니다. 흡입 챔버에 순수한 가스를 지속적으로 주입합니다.
    참고: 본 연구에서는 흡입실의 유독가스가 완전히 교체될 때까지 순수 가스 흐름(7.0-7.5m3/h)을 최소 20분 동안 주입했습니다.
    1. 순수한 공기 흐름 밸브를 닫고 문을 열고 쥐를 꺼내 병원균이 없는 방으로 돌려보냅니다.
  6. 쥐 선반과 분기 파이프 구성 요소를 순서대로 제거하고 청소를 위해 싱크대에 놓습니다. 헹굼 후 자동 세척 밸브를 닫고 해치를 엽니다.
    1. 깨끗한 천으로 내벽을 닦거나 순수한 가스를 켜서 탱크를 말리십시오. 마지막으로 소독을 수행하십시오. 75% 에탄올로 세척 및 소독한 후 배기 게이트를 닫고 가능한 한 빨리 흡입실 도어를 약간 열어 수분을 증발시켜 흡입실 내부가 건조한 상태를 유지하도록 합니다.
  7. 실험 중 실리카 농도의 안정성을 보장하기 위해 일주일에 두 번 제조업체의 지침( 재료 표 참조)에 따라 포괄적인 대기 샘플러로 캐비닛의 실리카 농도를 확인하십시오. 샘플링하기 전에 대기 샘플러를 보정합니다.
    1. 중량 측정 측정을 위해 디지털 단일 팬 분석 저울을 사용하십시오. 계산된 실리카 농도는 65mg/m3 이었다(도 1 및 표 1).
      알림: 실리카 흡수 전후에 여과지의 무게를 잰다. 실리카의 농도는 하기 화학식12를 사용하여 계산하였다:
      figure-protocol-2849
      여기서 W2 = 샘플링 후 여과지의 무게, W1 = 샘플링 전 여과지의 무게, V = 공기의 부피.

4. 폐 조직의 획득 및 고정

  1. 펜토바르비탈(체중 100mg/kg)과 리도카인(체중 4mg/kg)을 복강내 주사하여 쥐를 안락사시킨다. 심장 박동 손실로 사망 평가14.
  2. 실험이 끝나면 오른쪽 하부 폐, 신장, 간, 비장 및 뼈를 4% 파라포름알데히드로 최소 24시간 동안 고정하고 파라핀을 삽입하고 5μm 섹션 7,15로 자릅니다.

5. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색

  1. 각16 분 동안 10 분 동안 두 번 크실롤 (재료 표 참조)의 파라핀 섹션을 탈파라핀화하고 100 % 에탄올, 95 % 에탄올, 90 % 에탄올, 80 % 에탄올, 70 % 에탄올 및 증류수로 각각 3 분 동안 재수화합니다.
  2. 헤마톡실린( 재료 표 참조)으로 섹션을 5분 동안 염색한 다음 물10으로 섹션을 세척합니다.
  3. 섹션을 2% 염산 알코올에 넣은 다음 색상이 파란색으로 바뀔 때까지 증류수에 넣습니다.
  4. 섹션을 에오신으로 1분 동안 염색하고 95% 에탄올로 탈수하고 크실렌으로 투명하게 만들고 중성 검으로 밀봉하고 광학 현미경12로 관찰합니다.

6. 면역조직화학적 염색

  1. 파라핀 부분을 정기적으로 물로 씻으십시오.
  2. 항원을 고압(60kPa) 및 고온(100°C)에서 80초 동안 노출시킨 후 내인성 과산화효소 차단제(3%)로 15분 동안 차단하여 내인성 과산화효소를 제거한다7.
  3. CD68에 대한 항체(1:200 희석-CD68 4μL에 396μL 항체 희석액 추가, 재료 표 참조)로 샘플을 4°C에서 밤새 배양합니다.
  4. 2차 항체(HRP-conjugated goat anti-mouse IgG polymer, 재료 표 참조)로 37°C에서 30분 동안 샘플을 배양한 다음 1x PBS로 샘플을 세척합니다.
  5. 3,3-diaminobenzidine(DAB, 재료 표 참조)을 사용한 면역 반응을 시각화합니다. 조직에 DAB를 도포한 후 광학 현미경10으로 조직의 염색을 관찰합니다.
    참고: 염색 시간은 조직의 염색 시간에 따라 몇 초에서 몇 분까지 다양했습니다. 염색 절차는 절편을 물에 넣어 중단시켰다. 이 연구에서 조직의 갈색 염색은 CD68의 양성 발현을 나타냅니다. 모든 항체는 1x PBS로 희석되었습니다.

결과

제안된 방법을 사용하여 쥐에서 규폐증의 몇 가지 잠재적인 메커니즘과 발병기전을 조사했습니다. 흡입 챔버의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. 챔버는 공기 전달 실리카 발생기, 전신 챔버 및 폐기물 처리 시스템으로 구성되었으며, 앞서 설명한바와 같이 17. 폐 기능, 혈청 및 폐의 염증 인자 수준, 콜라겐 침착 및 근섬유아세포 분화는 이전 연구에서 보?...

토론

규폐증의 주요 원인인 실리카는 성형에 결정적인 역할을 합니다. 진폐증 환자가 흡입하는 실리카 입자는 기계적 절단으로 생성된 신선한 유리 실리카 입자입니다. 실리카는 갓 절단된 입자 표면에 직접 또는 대식세포(25)에 대한 그 효과를 통해 간접적으로 활성 산소 종을 생성할 수 있다. 따라서 실리카 입자의 분쇄가 매우 중요합니다. 제안된 프로토콜에서 실리카를 마노 모르?...

공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82003406), 허베이 성 자연 과학 재단 (H2022209073) 및 허베이 교육부 과학 기술 프로젝트 (ZD2022127)의 자금 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Air detector (compressive atmospheric sampler)Qingdao Xuyu Environmental Protection Technology Co. LTD
Anatomical table No specific brand is recommended.
Antibody of CD68Abcamab201340
DABZSGB-BIOZLI-9018
Electric heating air-blowing drierShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD
Electronic balanceOHRUS
Embedding machineleica
Exhaust gas discharge device  HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Generator systems HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Gloves (thin laboratory gloves)The secco medical
Hematoxylin and eosinBaSO Diagnostics Inc.BA4025
HOPE MED 8050 exposure control apparatusHOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Inhalation chamber HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Injection syringe No specific brand is recommended.
Light microscope olympus
Object slideshitai
PV-6000 (HRP-conjugated goat anti-mouse IgG polymer)Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co. Ltds5631
Silicon dioxideSigma-Aldrich
Slicing machineleicaRM2255
Waste gas treatment deviceHOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Wet boxCooperative plastic Products Factory
XylolTianjin Yongda Chemical Reagent Co., LTD

참고문헌

  1. Li, J., et al. The burden of pneumoconiosis in China: an analysis from the Global Burden of Disease Study. BMC Public Health. 22 (1), 1114 (2019).
  2. The Lancet Respiratory Medicine. The world is failing on silicosis. The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).
  3. Li, T., Yang, X., Xu, H., Liu, H. Early identification, accurate diagnosis, and treatment of silicosis. Canadian Respiratory Journal. 3769134, (2022).
  4. Adamcakova, J., Mokra, D. New insights into pathomechanisms and treatment possibilities for lung silicosis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4162 (2021).
  5. Li, Y., et al. Thalidomide alleviates pulmonary fibrosis induced by silica in mice by inhibiting ER stress and the TLR4-NF-κB pathway. International Journal of Molecular Sciences. 23 (10), 5656 (2022).
  6. Zhang, E., et al. Exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells reverse epithelial-mesenchymal transition potentially via attenuating Wnt/β-catenin signaling to alleviate silica-induced pulmonary fibrosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 31 (9), 655-666 (2021).
  7. Li, S., et al. N-Acetyl-Seryl-Asparyl-Lysyl-Proline regulates lung renin angiotensin system to inhibit epithelial-mesenchymal transition in silicotic mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 408, 408 (2020).
  8. Walters, E. H., Shukla, S. D. Silicosis: Pathogenesis and utility of animal models of disease. Allergy. 76 (10), 3241-3242 (2021).
  9. Langley, R. J., Mishra, N. C., Peña-Philippides, J. C., Hutt, J. A., Sopori, M. L. Granuloma formation induced by low-dose chronic silica inhalation is associated with an anti-apoptotic response in Lewis rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 73 (10), 669-683 (2010).
  10. Jin, F., et al. Ac-SDKP Attenuates activation of lung macrophages and bone osteoclasts in rats exposed to silica by inhibition of TLR4 and RANKL signaling pathways. Journal of Inflammation Research. 14, 1647-1660 (2021).
  11. Xu, H., et al. A new anti-fibrotic target of Ac-SDKP: inhibition of myofibroblast differentiation in rat lung with silicosis. PloS One. 7 (7), e40301 (2012).
  12. Li, S., et al. Ac-SDKP increases α-TAT 1 and promotes the apoptosis in lung fibroblasts and epithelial cells double-stimulated with TGF-β1 and silica. Toxicology and Applied Pharmacology. 369, 17-29 (2019).
  13. Vallyathan, V., Shi, X. L., Dalal, N. S., Irr, W. Generation of free radicals from freshly fractured silica dust. Potential role in acute silica-induced lung injury. The American Review of Respiratory Disease. 138 (5), 1213-1219 (1988).
  14. Khoo, S. Y., Lay, B. P. P., Joya, J., et al. Local anesthetic refinement of pentobarbital euthanasia reduces abdominal writhing without affecting immunohistochemical endpoints in rats. Lab Anim. 2018 (52), 152-162 (2018).
  15. Chooi, K. F., Rajendran, D. B. K., Phang, S. S. G., Toh, H. H. A. The dimethylnitrosamine induced liver fibrosis model in the rat. Journal of Visualized Experiments. 112 (112), (2016).
  16. Valentin, J., Frobert, A., Ajalbert, G., Cook, S., Giraud, M. -. N. Histological quantification of chronic myocardial infarct in rats. Journal of Visualized Experiments. 118 (118), (2016).
  17. Zhang, H., et al. silicosis decreases bone mineral density in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 348, 117-122 (2018).
  18. Zhang, B., et al. Targeting the RAS axis alleviates silicotic fibrosis and Ang II-induced myofibroblast differentiation via inhibition of the hedgehog signaling pathway. Toxicology Letters. 313, 30-41 (2019).
  19. Li, S., et al. Silica perturbs primary cilia and causes myofibroblast differentiation during silicosis by reduction of the KIF3A-repressor GLI3 complex. Theranostics. 10 (4), 1719-1732 (2020).
  20. Gao, X., et al. Pulmonary silicosis alters microRNA expression in rat lung and miR-411-3p exerts anti-fibrotic effects by inhibiting MRTF-A/SRF signaling. Molecular therapy. Nucleic Acids. 20, 851-865 (2020).
  21. Cai, W., et al. Differential expression of lncRNAs during silicosis and the role of LOC103691771 in myofibroblast differentiation induced by TGF-β1. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125, (2020).
  22. Cai, W., et al. Transcriptomic analysis identifies upregulation of secreted phosphoprotein 1 in silicotic rats. Experimental and Therapeutic. 21 (6), (2021).
  23. Li, Y., et al. Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation. Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).
  24. Mao, N., et al. Glycolytic reprogramming in silica-induced lung macrophages and silicosis reversed by Ac-SDKP treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10063 (2021).
  25. Hamilton, R. F., Thakur, S. A., Holian, A. Silica binding and toxicity in alveolar macrophages. Free Radical Biology and Medicine. 44 (7), 1246-1258 (2008).
  26. Park, R., et al. Exposure to crystalline silica, silicosis, and lung disease other than cancer in diatomaceous earth industry workers: a quantitative risk assessment. Occupational and Environmental. 59 (1), 36-43 (2002).
  27. Honnons, S., Porcher, J. M. In vivo experimental model for silicosis. Journal of Environmental Pathology, Toxicology and. 19 (4), 391-400 (2000).
  28. Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Experimental Lung Research. 32 (5), 181-199 (2006).
  29. Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
  30. Hoy, R. F., Chambers, D. C. Silica-related diseases in the modern world. Allergy. 75 (11), 2805-2817 (2020).
  31. Davis, G. S. Pathogenesis of silicosis: current concepts and hypotheses. Lung. 164 (3), 139-154 (1986).
  32. Moss, O. R., James, R. A., Asgharian, B. Influence of exhaled air on inhalation exposure delivered through a directed-flow nose-only exposure system. Inhalation Toxicology. 18 (1), 45-51 (2006).

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