Establecimiento de un modelo de rata de silicosis a través de la exposición de todo el cuerpo a sílice respirable

Resumen

En este estudio se describe una técnica para establecer un modelo de rata con silicosis con la inhalación de sílice a través de todo el cuerpo en una cámara de inhalación. Las ratas con silicosis podrían imitar de cerca el proceso patológico de la silicosis humana de una manera fácil, rentable y con buena repetibilidad.

Resumen

La principal causa de silicosis es la inhalación de sílice en el entorno laboral. A pesar de algunas diferencias anatómicas y fisiológicas, los modelos de roedores siguen siendo una herramienta esencial para el estudio de la silicosis humana. En el caso de la silicosis, el proceso patológico clásico debe ser inducible mediante la inhalación de partículas de cuarzo recién generadas, lo que significa inducir específicamente enfermedades profesionales humanas. En este estudio se describe una técnica para establecer e imitar eficazmente el proceso de evolución dinámica patológica de la silicosis. Además, la técnica tuvo una buena repetibilidad sin necesidad de cirugía. El sistema de exposición por inhalación fue fabricado, validado y utilizado para estudios toxicológicos sobre la inhalación de partículas respirables. Los componentes críticos fueron los siguientes: (1) generador de polvo SiO₂ seco a granel ajustado con un controlador de flujo de aire; (2) cámara de exposición por inhalación de^{cuerpo entero de} 0,3 m3 con capacidad para hasta 3 ratas adultas; (3) un sistema de monitoreo y control para regular la concentración de oxígeno, la temperatura, la humedad y la presión en tiempo real; y (4) una barrera y un sistema de eliminación de desechos para proteger a los técnicos de laboratorio y el medio ambiente. En resumen, el presente protocolo informa de la inhalación a través de todo el cuerpo, y la cámara de inhalación creó un modelo silicótico de rata fiable, razonable y repetible con baja mortalidad, menos lesiones y más protección.

Introducción

La silicosis, causada por la inhalación de sílice, es la enfermedad profesional más grave en China, y representa más del 80% del número total de informes de enfermedades profesionales cada año¹. La etiología de la silicosis es clara y puede prevenirse y controlarse, pero no se dispone de un método de tratamiento eficaz². Muchos fármacos han demostrado ser eficaces en estudios básicos, pero tienen efectos clínicos imprecisos ^3,4. Por lo tanto, los mecanismos patológicos y fisiológicos de la silicosis aún deben ser explorados.

Muchos estudios han utilizado una infusión única de sílice en la tráquea de ratas o ratones para investigar la patogénesis de la silicosis ^5,6. A pesar de que estos modelos silicóticos de roedores pudieron obtenerse en poco tiempo⁷, estos métodos aún presentaban desafíos, como traumatismos animales y alta mortalidad. Algunos estudios han implicado la instilación de sílice almacenada en los pulmones para inducir una reacción pulmonar inespecífica, pero no mencionaron los nódulos silicosicos en ratones⁸. Además, lejos de la silicosis aguda, la exposición crónica a la sílice en ambientes ocupacionales indujo una inflamación pulmonar significativamente menor y elevó los niveles de marcadores antiapoptóticos, en lugar de marcadores proapoptóticos, en los pulmones⁹. Por lo tanto, se necesita un modelo animal confiable, razonable y repetible para explorar más a fondo la patogénesis de la silicosis.

El presente estudio describe un método para imitar el proceso de la enfermedad de pacientes con silicosis a través de la inhalación de sílice a través de todo el cuerpo, partículas liberadas por aire en una cámara de inhalación, que comprendía un generador de sílice suministrado por aire, una cámara de cuerpo entero y un sistema de eliminación de desechos. Este método es simple, fácil de operar e imita eficazmente el proceso de evolución dinámica patológica de la silicosis. Además, con este método se identifican muchos mecanismos posibles y la patogenia de la silicosis 10,11,12. Se prevé que el protocolo propuesto ayude a futuras investigaciones en el campo relacionado con la investigación de la silicosis.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos y fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Ciencia y Tecnología del Norte de China (código de protocolo LX2019033 y 2019-3-3 de aprobación). Para el presente estudio se utilizaron ratas Wistar macho, de 3 semanas de edad. Todas las ratas se mantuvieron en jaulas estáticas con virutas de madera. Los animales se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h, y se les proporcionó alimento y agua ad libitum. Los experimentos de seguimiento se llevaron a cabo después de 1 semana de alimentación adaptativa.

1. Preparación animal

1. A su llegada, aloje a todas las ratas en una habitación específica libre de patógenos (SPF).
2. Divida aleatoriamente las ratas sanas en dos grupos (n = 10): ratas de control que inhalan aire puro y ratas con silicosis que inhalan sílice.

2. Preparación de sílice

PRECAUCIÓN: El polvo de sílice inhalado por el cuerpo humano puede dañar los pulmones. Por lo tanto, las personas deben usar overoles, guantes médicos y máscaras protectoras (N95) durante las operaciones.

1. Moler las partículas de sílice (ver Tabla de Materiales) con un mortero de ágata durante 1,5 h antes de cada exposición. Esto se debe a que el cuarzo recién fracturado produce mayores cantidades de especies activas de oxígeno que el cuarzo^{envejecido 13}, y la sílice con un diámetro de 1-5 μm es la más patógena.
2. Pesar la sílice (30 g) con una balanza electrónica después de la molienda, colocarla en un recipiente de vidrio y hornearla a 180 °C durante 6 h en un secador de aire eléctrico (ver Tabla de materiales) para eliminar los patógenos de la superficie de las partículas de sílice.

3. Exposición a la sílice de las ratas

1. Conecte la inyección y los sistemas generadores disponibles en el mercado (consulte la tabla de materiales) y coloque la sílice (30 g) en el generador. Compruebe si la tubería de conexión es normal, si el cable de alimentación está conectado y si la fuente de alimentación es normal.
   1. Verifique el nivel de agua de la torre de pulverización y el humidificador del dispositivo de tratamiento de gases residuales (consulte la Tabla de materiales) manualmente y agregue agua si es insuficiente (no hasta la línea estándar).
   2. Agregue agua del grifo a la torre de pulverización del dispositivo de tratamiento de gases residuales y agua destilada al humidificador (Figura 1).
2. Encienda el dispositivo de descarga de gases de escape (consulte la Tabla de materiales) y el interruptor de la fuente de aire para confirmar si el interior del gabinete de protección está en un estado de presión negativa.
   1. Confirme que las válvulas de control de flujo de líquido y polvo, mezcla de polvo, y válvula de descarga de aguas residuales debajo de la cámara de inhalación estén cerradas.
3. Coloque un total de 10 ratas en la cámara de inhalación (consulte la Tabla de materiales) y cierre el compartimiento de inhalación y las puertas del gabinete con mosquitero.
4. Ajuste los siguientes parámetros experimentales en el panel de instrumentos o en la computadora: presión del gabinete: -50 a -30 Pa; concentración de oxígeno: 21%; temperatura del gabinete: 26-30 °C; humedad: 30%-70%; tasa de entrada de polvo: 2,0-2,5 mL/min; y concentración de polvo en el gabinete: 60 ± 5 mg/m³.
   NOTA: Observe los datos experimentales y el estado del equipo continuamente durante el experimento. La alarma de falla del equipo provocó un procesamiento oportuno.
   1. Exponga a cada animal a sílice de forma continua durante 3 horas al día, 5 días a la semana, y permita que los animales del grupo de control inhalen aire puro.
5. Al finalizar el experimento, cierre la válvula de control de flujo de gas mixto y abra la válvula de flujo de gas puro. Inyecte el gas puro continuamente en la cámara de inhalación.
   NOTA: En el presente estudio, el flujo de gas puro (7,0-7,5 m³/h) se inyectó durante al menos 20 minutos hasta que el gas venenoso en la cámara de inhalación fue reemplazado por completo.
   1. Cierre la válvula de flujo de aire puro, abra la puerta, saque a las ratas y envíelas de regreso a la habitación libre de patógenos.
6. Retire la rejilla para ratas y los componentes de la tubería de derivación en secuencia y colóquelos en el fregadero para limpiarlos. Después del enjuague, cierre la válvula de limpieza automática y abra la escotilla.
   1. Limpie la pared interior con un paño limpio o encienda el gas puro para secar el tanque. Por último, realizar la desinfección. Después de limpiar y desinfectar con etanol al 75%, cierre la compuerta de escape y, lo antes posible, abra ligeramente la puerta de la cabina de inhalación para evaporar la humedad, de modo que el interior de la cabina de inhalación permanezca seco.
7. Compruebe la concentración de sílice en el armario con un muestreador atmosférico completo siguiendo las instrucciones del fabricante (véase la Tabla de materiales) dos veces por semana para garantizar la estabilidad de la concentración de sílice durante el experimento. Calibre el muestreador atmosférico antes de tomar muestras.
   1. Utilice una balanza analítica digital de un solo plato para la determinación gravimétrica. La concentración de sílice calculada fue de 65 mg/^m3 (Figura 1 y Tabla 1).
      NOTA: Pesar el papel de filtro antes y después de la absorción de sílice. La concentración de sílice se calculó mediante la siguiente fórmula¹²:
      
      donde W2 = peso del papel de filtro después del muestreo, W1 = peso del papel de filtro antes del muestreo y V = volumen de aire.

4. Adquisición y fijación de tejidos pulmonares

1. Eutanasia de las ratas mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital (100 mg/kg de peso corporal) y lidocaína (4 mg/kg de peso corporal). Evaluar la muerte por la pérdida de latidos del corazón¹⁴.
2. Al final del experimento, fijar el pulmón inferior derecho, el riñón, el hígado, el bazo y el hueso con paraformaldehído al 4% durante al menos 24 h, incrustar en parafina y cortar en secciones de 5 μm ^7,15.

5. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)

1. Desparafinar las secciones de parafina en xilol (ver Tabla de Materiales) dos veces durante 10 minutos cada¹⁶, y rehidratar en etanol al 100%, etanol al 95%, etanol al 90%, etanol al 80%, etanol al 70% y agua destilada durante 3 min cada una.
2. Tiña las secciones con hematoxilina (ver Tabla de Materiales) durante 5 min, y luego lava las secciones con agua¹⁰.
3. Coloque las secciones en alcohol clorhídrico al 2% y luego en agua destilada hasta que el color cambie a azul.
4. Teñir las secciones con eosina durante 1 min, deshidratarlas con etanol al 95%, hacerlas transparentes con xileno, sellarlas con goma neutra y observar bajo un microscopio óptico¹².

6. Tinción inmunohistoquímica

1. Lave rutinariamente las secciones de parafina con agua.
2. Exponer los antígenos a alta presión (60 kPa) y alta temperatura (100 °C) durante 80 s y luego bloquear con un bloqueador peroxidasa endógeno (3%) durante 15 min para eliminar las peroxidasas endógenas⁷.
3. Incubar las muestras con anticuerpos dirigidos contra CD68 (dilución 1:200; añadir 4 μL de CD68 a 396 μL de diluyente de anticuerpo; ver Tabla de Materiales) a 4 °C durante la noche.
4. Incubar las muestras con un anticuerpo secundario (polímero IgG antiratón de cabra conjugado con HRP; ver Tabla de Materiales) a 37 °C durante 30 min, y luego lavar las muestras con 1x PBS.
5. Visualizar la inmunorreactividad con 3,3-diaminobenzidina (DAB; ver Tabla de Materiales). Después de aplicar DAB al tejido, observe la tinción del tejido bajo un microscopio óptico¹⁰.
   NOTA: El tiempo de tinción varió de unos pocos segundos a unos minutos según el tiempo de tinción del tejido. El procedimiento de tinción se abortó colocando las secciones en agua. En este estudio, la tinción marrón del tejido representó la expresión positiva de CD68. Todos los anticuerpos se diluyeron en 1x PBS.

Resultados

Utilizando el método propuesto, se exploraron algunos mecanismos potenciales y la patogénesis de la silicosis en ratas. El esquema de la cámara de inhalación se muestra en la Figura 1. La cámara consistía en un generador de sílice suministrado por aire, una cámara de cuerpo entero y un sistema de eliminación de desechos, como se describió anteriormente¹⁷. Las funciones pulmonares, los niveles de factores inflamatorios en suero y pulmón, depósito de coláge...

Discusión

Como principal causa de silicosis, la sílice juega un papel decisivo en el moldeo. Las partículas de sílice inhaladas por los pacientes con neumoconiosis son partículas de sílice frescas y libres producidas por corte mecánico. La sílice puede generar especies reactivas de oxígeno, ya sea directamente sobre las superficies de partículas recién escindidas o indirectamente a través de su efecto sobre los macrófagos²⁵. Por lo tanto, la molienda de partículas de sílice es de gran importan...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air detector (compressive atmospheric sampler)	Qingdao Xuyu Environmental Protection Technology Co. LTD
Anatomical table			No specific brand is recommended.
Antibody of CD68	Abcam	ab201340
DAB	ZSGB-BIO	ZLI-9018
Electric heating air-blowing drier	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD
Electronic balance	OHRUS
Embedding machine	leica
Exhaust gas discharge device	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Generator systems	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Gloves (thin laboratory gloves)	The secco medical
Hematoxylin and eosin	BaSO Diagnostics Inc.	BA4025
HOPE MED 8050 exposure control apparatus	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Inhalation chamber	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Injection syringe			No specific brand is recommended.
Light microscope	olympus
Object slide	shitai
PV-6000 (HRP-conjugated goat anti-mouse IgG polymer)	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co. Ltd	s5631
Silicon dioxide	Sigma-Aldrich
Slicing machine	leica	RM2255
Waste gas treatment device	HOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Wet box	Cooperative plastic Products Factory
Xylol	Tianjin Yongda Chemical Reagent Co., LTD