使用改良的酶联免疫吸附测定法检测和定量人血浆中的降钙素基因相关肽 （CGRP）

摘要

关于人血浆中降钙素基因相关肽（CGRP）浓度的已发表数据不一致。这些不一致可能是由于缺乏标准化的，经过验证的方法来量化这种神经肽。在这里，我们描述了一种经过验证的酶联免疫吸附测定（ELISA）方案，用于纯化和定量人血浆中的CGRP。

摘要

降钙素基因相关肽 （CGRP） 是一种血管活性神经肽，在偏头痛的病理生理学中起假定作用，可能是生物标志物状态的候选者。CGRP 在激活时从神经元纤维中释放出来，并在接受三叉神经传出神经支配的脉管系统中诱导无菌神经源性炎症和动脉血管舒张。外周脉管系统中CGRP的存在促使人们使用蛋白质组学测定（例如酶联免疫吸附测定（ELISA））检测和定量人血浆中的这种神经肽的研究。然而，其6.9 min的半衰期和测定方案技术细节的可变性（通常未完全描述）在文献中产生了不一致的CGRP ELISA数据。本文介绍了一种改进的ELISA方案，用于人血浆中CGRP的纯化和定量。程序步骤包括样品收集和制备、使用极性吸附剂作为纯化手段的提取、阻断非特异性结合的额外步骤以及通过 ELISA 进行 定量。此外，该方案已通过加标和回收率以及稀释实验的线性进行了验证。从理论上讲，这种经过验证的方案可用于量化个体血浆中的CGRP浓度，不仅是偏头痛，还包括CGRP可能起作用的其他疾病。

引言

降钙素基因相关肽（CGRP）是一种37个氨基酸的神经肽，存在于具有血管周围定位的神经元纤维以及非神经元组织中。CGRP的两种形式，α-和β-CGRP，具有90%以上的同源性，并具有相同的生理功能;然而，αCGRP存在于中枢和周围神经系统中，而βCGRP存在于肠道神经系统^1，2中。在伤害感受器激活和钙依赖性胞吐作用后，CGRP 从神经元释放，诱发涉及动脉血管扩张和血浆蛋白外渗的无菌神经源性炎症³，⁴，⁵，^6，7。从这里开始，CGRP出现在毛细血管后血管中，可能是引起传入伤害性激活的疾病的生物标志物，例如偏头痛⁸，⁹，^10，11。值得注意的是，CGRP还通过其在血管生成和免疫调节中的作用与COVID-19有关，并可能预测不利的疾病演变^12，13。因此，准确定量人血浆中CGRP的方案可能具有广泛的价值。

CGRP在偏头痛中的作用可能受到最多关注。基于临床前和临床研究，CGRP已被提出作为偏头痛的可能生物标志物和治疗靶标³，⁴，⁵，⁶，⁷，^8，9^，10。一些研究发现，相对于对照组受试者，发作性偏头痛队列中的CGRP升高¹⁰，^14，15。CGRP抑制剂在偏头痛治疗临床试验中的成功似乎表明CGRP升高是偏头痛的致病因素。然而，并非所有研究人员都证实了这些结果¹⁶，¹⁷，^18，19。此外，CGRP在偏头痛非头痛症状中的作用尚未阐明;目前的工作是出于了解CGRP在偏头痛前庭症状中的作用的愿望。

文献中CGRP免疫测定数据不一致可能是由于多种原因造成的。首先，由于丝氨酸蛋白酶21，胰岛素降解酶和其他金属蛋白酶22，中性内肽酶23和内皮素转换酶-1 24的活性，CGRP在外周脉管系统中的半衰期为6.9分钟²⁰。其次，用于量化CGRP的免疫测定的可变技术细节在此类研究中没有充分描述。最后，免疫测定方法缺乏标准化使情况更加复杂。

本文介绍了一种改进的酶联免疫吸附测定 （ELISA） 方案，该方案允许纯化和准确定量人血浆中的 α 和 βCGRP。该试剂盒的抗体与胰岛淀粉样蛋白、降钙素或P物质不发生交叉反应。该协议经过了必要的验证实验，例如加标和回收率以及稀释的线性，此处提供了其数据。这种经过验证的CGRP ELISA协议以前在文献中没有完全描述。该协议可用于量化偏头痛以及心脏病学²，^25，皮肤科26，产科27，风湿病学²⁸，²⁹，肌肉骨骼^30，31，内分泌32，³³和病毒性疾病¹²，¹³的背景下人血浆中的CGRP^，其中CGRP涉及。

研究方案

该协议是使用来自约翰霍普金斯机构审查委员会（NA_00092491）批准同意的个人的人血浆样本开发的。

1. 样品采集和制备

1. 通过标准静脉穿刺方法从肘前静脉收集 5 mL 全血³⁴ 到 6 mL 真空容器乙二胺四乙酸 （EDTA） 收集管中。
2. 收集后向管中加入 0.5 mL 抑肽酶 （10，000 KIU/mL） 竞争性丝氨酸蛋白酶抑制剂，以阻断目标肽的裂解。将试管倒置10次，使抑肽酶与血液充分混合。之后，将试管存放在冰上，直到下一步。
3. 在采血后60分钟内以604× g 离心管在4°C下离心4分钟。
4. 用移液管取出血浆级分并转移到 2 mL 圆底无菌冷冻管中。
5. 立即将冷冻管在-80°C下储存长达2周。

2. 血浆样品的提取

1. 将提取盒放入 15 mL 锥形离心管内，柱的外脊由管的外脊支撑。
2. 首先通过 5 mL 100% 甲醇，然后通过 10 mL 超纯水通过滤芯来激活滤芯。
   1. 当流体通过重力驱动的流动 通过 滤芯时，它将聚集在管中。
   2. 在积聚时倒出多余的液体，以确保液体不会吞没墨盒。
   3. 确保小柱在实验过程中不会干燥。
3. 用 750 μL 4% 乙酸稀释 250 μL 血浆。
4. 将 1 mL 血浆和乙酸溶液缓慢通过墨盒。
   注意:每毫升通过重力驱动流 ，此步骤 大约需要 30 秒。
5. 用 10 mL 4% 乙酸清洗墨盒。如前所述，在积聚时扔掉多余的液体，以确保液体不会吞没墨盒。
6. 最后一滴乙酸从滤芯中释放出来后，从管中取出滤芯并将其放入新的 15 mL 锥形离心管中。
7. 通过混合 2.7 mL 4% 乙酸和 0.3 mL 100% 甲醇制备 100% 甲醇和 4% 乙酸的 10:1 溶液。使用此功能通过一次将溶液通过小柱 1 mL 来洗脱 CGRP。在每毫升溶液通过之间暂停25分钟。不要扔掉淋洗液。
8. 在最后一毫升甲醇和乙酸溶液通过后25分钟，试管将包含3mL洗脱液。将每 1 mL 洗脱液放入 1.7 mL 微量离心管中。
   注意:这应该从每个滤芯中产生三个微量离心管。
9. 将每个试管放入小型离心机中1秒，以确保所有淋洗液都在每个试管的底部。
10. 通过4°C真空离心干燥所有样品（设置为浓缩器功能，对于水溶液，在1，400rpm下;g力根据管的位置而变化，因此范围为130-250× g）。
    注意:真空离心机干燥样品所需的时间取决于所使用的微量离心管的类型。
11. 在进行测定程序（步骤4.1）之前，立即用酶免疫测定（EIA）缓冲液（参见 材料表）解冻至室温（RT）或20°C重新配制先前干燥的样品。
    注意:用于复溶干燥样品的EIA缓冲液体积应等于原始样品体积或250μL。

3.ELISA板的制备 - 封闭以限制非特异性结合

1. 向板上的每个孔中加入 250 μL 三缓冲盐水 （TBS）/鱼明胶封闭缓冲液。
2. 将盖板放在板上，并在室温下孵育2小时。
3. 取下盖板并使用多通道移液器倒置或抽吸清空板。然后，将盘子吸干在纸巾上以丢弃任何微量液体。
4. 通过将板留在层流罩中10分钟来干燥板。
5. 板明显干燥后，将其放入带有硅胶干燥剂袋的抓握密封箔袋中，并将袋子在-20°C下储存24小时。
   注意:板应在板孵育后4周内使用。

4. 在检测程序之前

1. 按照试剂盒说明制备试剂（EIA缓冲液，CGRP标准品，CGRP质量控制，CGRP示踪剂，洗涤缓冲液）。仅在16-20小时潜伏期结束后准备Ellman试剂。
2. 在执行其余方案之前，将所有样品和试剂解冻至RT。

5. 检测程序

1. 用试剂盒提供的洗涤缓冲液（300μL/孔）在封闭的板中冲洗每个孔五次。对于每次冲洗，将洗涤缓冲液放入孔中后暂停30秒，然后使用多通道移液器倒出液体或吸出物。
2. 最终冲洗后，通过倒置（倒置板以排出孔内的液体）或使用多通道移液器抽吸从孔中取出所有缓冲液。将最后一滴吸干到纸巾上，然后轻敲倒置的板，直到所有液体都从孔中明显去除。
3. 留出至少两个没有试剂或缓冲液的孔，称为"空白"孔。然后，留出至少两个其他孔用于非特异性结合（NSB）。
4. 将 100 μL EIA 缓冲液分配到每个 NSB 孔中。
5. 将 100 μL CGRP 标准品一式两份分配到适当的孔中。
6. 将 100 μL 样品（在 EIA 缓冲液中复溶）和质量控制一式两份分配到适当的孔中。
7. 将 100 μL CGRP 示踪剂（附着在乙酰胆碱酯酶上的抗 CGRP 抗体）分配到每个含有 NSB、CGRP 标准品、样品和质控的孔中。不要将示踪剂分配到"空白"孔中。
8. 使用透明盖板盖住板，密封每个孔，使每个孔中的样品和试剂不会显着蒸发。将板在4°C孵育16-20小时。
9. 孵育完成后，按照试剂盒说明重新配制Ellman试剂。
10. 倒置板以除去所有液体。用 300 μL 洗涤缓冲液冲洗每个孔（如上所述）三次。
11. 第三次冲洗后，从平板上除去液体，将板放在振动板上，并以120rpm摇动2分钟。
12. 再洗盘子三次。最后一次冲洗后，使用多通道移液器倒置或抽吸从孔中取出所有缓冲液。将最后一滴液体吸干到纸巾上，轻敲倒置的板，直到所有液体都明显地从孔中取出。
    注意:如果使用ELISA微孔板清洗机，则可能不需要此步骤中描述的额外三次洗涤。
13. 将 200 μL 埃尔曼试剂分配到每个孔中（不包括"空白"孔）。
14. 用新的盖板盖住板，并用铝箔包裹，以防止任何光线照射。在室温下在黑暗中孵育1小时。
15. 用干纸巾擦拭背面，确保板背面没有液体可能会混淆分光光度计读数。
16. 读取板在405nm处的吸光度（黄色）。

6. 数据分析

1. 计算每个"空白"，NSB，标准品，质量控制和样品的平均吸光度。
2. 从标准品、质量控制和样品吸光度值中减去NSB平均吸光度值。
3. 在y轴上绘制吸光度，在x轴上绘制浓度。使用四参数逻辑回归模型构建标准曲线。
4. 构建曲线后，使用曲线的方程确定质量控制和样品的插值浓度，可以在x轴上读取。
   注意:仅当计算出的质量控制插值浓度在预期浓度的25%以内（通常为125 pg/mL，但请参阅质控瓶的标签）时，才验证标准曲线。

结果

协议中有几个关键步骤应该强调。首先，抑肽酶（一种丝氨酸蛋白酶抑制剂）必须在收集后立即添加到全血样品中，以防止CGRP的进一步酶降解。丝氨酸蛋白酶已被证明在CGRP代谢中发挥作用，之前的一项研究也使用抑肽酶定量人类的CGRP^21，35。如果不使用蛋白酶抑制剂，并且样品制备需要超过 60 分钟，那么在进行 ELISA 时可以预期 CGRP 水平降低。其次，?...

讨论

本文介绍了一种经过验证的方案，可用于检测和定量人血浆中的CGRP。该协议是在发现商业CGRP ELISA试剂盒不能准确定量该分子后合成的。在建立样品制备方案和有效的标准曲线后，加标和回收率以及稀释实验的线性表明，回收率远低于预期。使用不同的商用CGRPELISA试剂盒也发现了类似的结果（表4）。作为参考，广泛接受的标准回收率为80-120%³⁶。这些结果可能表明存?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube	Sorenson Bioscience, Inc.	11510
99% methanol	ThermoFisher Scientific	L13255.0F
15 mL conical centrifuge tube	Falcon	14-959-49B
2 mL round bottom sterile cryovials	CRYO.S	122263
4% acetic acid	ThermoFisher Scientific	035572.K2
6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube	BD	367863
Allegra 64R benchtop centrifuge	Beckman Coulter, Inc.	367586
Aprotinin	VWR	76344-814
CGRP (human) ELISA kit	Bertin Bioreagent	A05481
CGRP stock	Bertin Bioreagent
EIA Buffer	Bertin Bioreagent	A07000
Ellman's Reagent	Bertin Bioreagent	A09000_49+1
Multichannel pipettes	ThermoFisher Scientific	4661180N
Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges	Waters	WAT094226
Orbital Shaker	Bellco	7744-01010
Precision micropipettes	ThermoFisher Scientific	F144055MG
SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader	Molecular Devices	Part Number M2
TBS/Fish Gelatin	Bioworld, from Fischer Scientific	50-199-167
Ultrapure water ELISA Grade	Bertin Bioreagent	A07001
Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator	Eppendorf	22820109
Wash Buffer	Bertin Bioreagent	A17000