АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Опубликованные данные, относящиеся к концентрациям пептидов, связанных с геном кальцитонина (CGRP), в плазме крови человека, противоречивы. Эти несоответствия могут быть связаны с отсутствием стандартизированной, проверенной методологии для количественной оценки этого нейропептида. Здесь мы описываем утвержденный протокол иммуноферментного анализа (ИФА) для очистки и количественного определения CGRP в плазме человека.

Аннотация

Пептид, связанный с геном кальцитонина (CGRP), представляет собой вазоактивный нейропептид, который играет предполагаемую роль в патофизиологии мигрени и может быть кандидатом на статус биомаркера. CGRP высвобождается из нейрональных волокон при активации и индуцирует стерильное нейрогенное воспаление и артериальную вазодилатацию в сосудистой сети, которая получает эфферентную иннервацию тройничного нерва. Присутствие CGRP в периферической сосудистой сети стимулировало исследования по обнаружению и количественному определению этого нейропептида в плазме человека с использованием протеомных анализов, таких как иммуноферментный анализ (ИФА). Однако его период полураспада 6,9 мин и вариабельность технических деталей протоколов анализа, которые часто не полностью описаны, привели к противоречивым данным CGRP ELISA в литературе. Здесь представлен модифицированный протокол ИФА для очистки и количественного определения CGRP в плазме человека. Процедурные этапы включают отбор и подготовку проб, экстракцию с использованием полярного сорбента в качестве средства очистки, дополнительные этапы блокирования неспецифического связывания и количественную оценку с помощью ИФА. Кроме того, протокол был проверен с помощью экспериментов по спайку, восстановлению и линейности разбавления. Этот валидированный протокол теоретически может быть использован для количественной оценки концентраций CGRP в плазме крови людей не только с мигренью, но и с другими заболеваниями, в которых CGRP может играть роль.

Введение

Пептид, связанный с геном кальцитонина (CGRP), представляет собой нейропептид из 37 аминокислот, который присутствует в нейронных волокнах с периваскулярной локализацией, а также в ненейрональных тканях. Две формы CGRP, α- и β-CGRP, имеют более 90% гомологии и общие физиологические функции; однако αCGRP обнаруживается в центральной и периферической нервной системе, а βCGRP обнаруживается в энтеральной нервной системе 1,2. При активации ноцицепторов и кальций-зависимом экзоцитозе CGRP высвобождается из нейронов, вызывая стерильное нейрогенное воспаление, включающее расширение артериальной вазодилатации и экстравазацию белка плазмы 3,4,5,6,7. Отсюда CGRP появляется в посткапиллярных сосудах и может быть биомаркером заболеваний, вызывающих афферентную ноцицептивную активацию, таких как мигрень 8,9,10,11. Следует отметить, что CGRP также участвует в COVID-19 благодаря своей роли в ангиогенезе и иммуномодуляции и может предсказывать неблагоприятное развитие заболевания12,13. Таким образом, протокол для точного количественного определения CGRP в плазме человека может иметь широкое значение.

Наибольшее внимание, пожалуй, было уделено роли CGRP в мигрени. Основываясь на доклинических и клинических исследованиях, CGRP был выдвинут в качестве возможного биомаркера мигрени и в качестве мишени для лечения 3,4,5,6,7,8,9,10. В некоторых исследованиях было обнаружено повышение CGRP в когортах с эпизодической мигренью по сравнению с контрольными участниками10,14,15. Успех ингибиторов CGRP в клинических испытаниях для лечения мигрени, по-видимому, подразумевает повышенный CGRP как причинный фактор мигрени. Однако не все исследователи подтвердили эти результаты16,17,18,19. Более того, роль CGRP в отсутствии головной боли при мигрени еще предстоит выяснить; Данная работа была мотивирована желанием понять роль CGRP в вестибулярных симптомах мигрени.

Противоречивые данные иммуноанализа CGRP в литературе могут быть вызваны несколькими причинами. Во-первых, период полувыведения CGRP в периферической сосудистой сети составляет 6,9 мин 20 из-за активности сериновых протеаз 21, инсулиноразрушающих ферментов и других металлопротеаз 22, нейтральных эндопептидаз 23 и эндотелинпревращающего фермента-1 24. Во-вторых, переменные технические детали иммунологических анализов, используемых для количественного определения CGRP, не полностью описаны в таких исследованиях. Наконец, отсутствие стандартизации методики иммуноанализа еще больше усложняет картину.

В этой статье описывается модифицированный протокол иммуноферментного анализа (ИФА), который позволяет проводить очистку и точное количественное определение α- и βCGRP в плазме человека. Антитела набора не являются перекрестно реактивными с амилином, кальцитонином или веществом P. Этот протокол прошел необходимые проверочные эксперименты, такие как спайк и восстановление и линейность разбавления, данные по которым представлены здесь. Такой протокол CGRP ELISA, прошедший валидацию, ранее не был полностью описан в литературе. Этот протокол может быть использован для количественной оценки CGRP в плазме человека в контексте мигрени, а также кардиологических2,25, дерматологических 26, акушерских 27, ревматологических28,29, скелетно-мышечных 30,31, эндокринных 32,33 и вирусных заболеваний 12,13, в которых участвует CGRP.

протокол

Этот протокол был разработан с использованием образцов плазмы человека от согласившихся лиц с одобрения Институционального наблюдательного совета Джона Хопкинса (NA_00092491).

1. Отбор и подготовка образцов

  1. Соберите 5 мл цельной крови из антекубитальной вены с помощью стандартных методов венепункции34 в пробирку для сбора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) объемом 6 мл.
  2. Добавьте 0,5 мл апротинина (10 000 КИЕ/мл) конкурентного ингибитора сериновой протеазы в пробирку после сбора, чтобы блокировать лизис целевого пептида. Переверните пробирку 10 раз, чтобы апротинин адекватно смешался с кровью. После этого храните пробирки на льду до следующего шага.
  3. Центрифугируйте пробирку при 604 x g в течение 4 мин при 4 °C в течение 60 мин после забора крови.
  4. Снимите фракцию плазмы с помощью пипетки и переведите в 2 мл стерильных криовалов с круглым дном.
  5. Немедленно храните криовиалы при температуре -80 °C до 2 недель.

2. Извлечение образцов плазмы

  1. Поместите экстракционный картридж в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл так, чтобы внешние выступы картриджа поддерживались внешними гребнями пробирки.
  2. Активируйте картридж, сначала пропустив через картридж 5 мл 100% метанола, а затем 10 мл сверхчистой воды.
    1. Когда жидкость проходит через картридж под действием силы тяжести, она будет собираться в трубке.
    2. Выбрасывайте лишнюю жидкость по мере ее накопления, чтобы жидкость не поглотила картридж.
    3. Следите за тем, чтобы картридж не высыхал в ходе эксперимента.
  3. Разбавьте 250 мкл плазмы 750 мкл 4% уксусной кислоты.
  4. Медленно пропустите 1 мл плазмы и раствора уксусной кислоты через картридж.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен занять примерно 30 с через гравитационный поток на каждый пройденный миллилитр.
  5. Промойте картридж 10 мл 4% уксусной кислоты. Как и ранее, выбрасывайте лишнюю жидкость по мере ее накопления, чтобы жидкость не поглотила картридж.
  6. После того, как последняя капля уксусной кислоты будет выпущена из картриджа, извлеките картридж из пробирки и поместите его в новую коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл.
  7. Приготовьте раствор 100% метанола и 4% уксусной кислоты в соотношении 10:1, смешав 2,7 мл 4% уксусной кислоты и 0,3 мл 100% метанола. Используйте это для разбавления CGRP, пропуская этот раствор через картридж по 1 мл за раз. Сделайте паузу на 25 мин между каждым миллилитром раствора. НЕ выбрасывайте элюент.
  8. Пробирка будет содержать 3 мл элюированной жидкости через 25 минут после того, как пройдет последний миллилитр раствора метанола и уксусной кислоты. Поместите каждый 1 мл элюента в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно дать три микроцентрифужные пробирки из каждого картриджа.
  9. Поместите каждую пробирку в мини-центрифугу на 1 с, чтобы убедиться, что весь элюент находится на дне каждой пробирки.
  10. Высушите все образцы вакуумным центрифугированием при 4 °C (для водных растворов установлено значение концентратора при 1 400 об/мин; перегрузка изменяется в зависимости от положения пробирок и, следовательно, колеблется от 130 до 250 x g).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое вакуумной центрифуге для сушки образцов, будет зависеть от типа используемой микроцентрифужной пробирки.
  11. Непосредственно перед тем, как приступить к процедуре анализа (этап 4.1), восстановите ранее высушенный образец с помощью буфера для иммуноферментного анализа (ИФА) (см. Таблицу материалов), размороженного до комнатной температуры (RT) или 20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем буфера ОВОС, используемого для восстановления высушенного образца, должен быть равен исходному объему образца или 250 мкл.

3. Подготовка ИФА-планшета - блокировка для ограничения неспецифического связывания

  1. Добавьте 250 мкл трис-буферного солевого раствора (TBS) / рыбьего желатинового блокирующего буфера в каждую лунку на тарелке.
  2. Накройте тарелку накрытым листом и выдерживайте 2 часа при RT.
  3. Снимите защитный лист и опорожните пластину путем инверсии или аспирации с помощью многоканальной пипетки. Затем промокните тарелку бумажным полотенцем, чтобы удалить следы жидкости.
  4. Высушите пластину, оставив пластину в вытяжке с ламинарным потоком на 10 минут.
  5. После того, как пластина заметно высохнет, поместите ее в герметичный пакет из фольги с пакетиком с осушителем силикагеля и храните пакет при температуре -20 °C в течение 24 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины следует использовать в течение 4 недель после инкубации пластин.

4. Перед процедурой анализа

  1. Приготовьте реагенты (буфер EIA, стандарт CGRP, контроль качества CGRP, индикатор CGRP, буфер для промывки) в соответствии с инструкциями набора. Готовят реактив Эллмана только после окончания 16-20 ч инкубационного периода.
  2. Разморозьте все образцы и реагенты до RT перед выполнением остальной части протокола.

5. Процедура анализа

  1. Промойте каждую скважину в заблокированной пластине пять раз с помощью входящего в комплект буфера для стирки (300 мкл / лунка). Для каждого полоскания сделайте паузу в 30 с после помещения буфера для промывки в лунки, затем вылейте жидкость или аспират с помощью многоканальной пипетки.
  2. После окончательного промывания удалите весь буфер из лунок путем инверсии (переворачивания пластины для вытеснения жидкости из лунок) или аспирации с помощью многоканальной пипетки. Промокните последние капли на бумажное полотенце и постучите по перевернутой тарелке, пока вся жидкость не будет заметно удалена из лунок.
  3. Выделите по крайней мере две скважины без реагентов или буфера, которые будут известны как «пустые» скважины. Затем отложите по крайней мере две другие лунки для неспецифического связывания (NSB).
  4. Распределите 100 мкл буфера EIA в каждую лунку NSB.
  5. Распределите 100 мкл стандартов CGRP в двух экземплярах в соответствующие лунки.
  6. Распределите 100 мкл образцов (восстановленных в буфере ОВОС) и контролируйте качество в двух экземплярах в соответствующие лунки.
  7. Распределите 100 мкл индикатора CGRP (антитела против CGRP, прикрепленного к ацетилхолинэстеразе) в каждую лунку, содержащую NSB, стандарты CGRP, образцы и контроль качества. Не выдавайте трассер в «холостые» скважины.
  8. Накройте пластину прозрачным покровным листом, герметизируя каждую лунку таким образом, чтобы образцы и реагенты в каждой лунке не испарялись значительно. Выдерживают пластину в течение 16-20 ч при температуре 4 °C.
  9. После завершения инкубации восстановите реагент Эллмана в соответствии с инструкциями набора.
  10. Переверните пластину, чтобы удалить всю жидкость. Промойте каждую лунку (как описано выше) три раза 300 мкл буфера для стирки.
  11. После третьего полоскания удалите жидкость с тарелок, поставьте тарелку на шейкер и встряхивайте при 120 об/мин в течение 2 мин.
  12. Вымойте тарелку еще три раза. После окончательного промывания удалите весь буфер из лунок методом инверсии или аспирации с помощью многоканальной пипетки. Промокните последние капли жидкости бумажным полотенцем и постучите по перевернутой тарелке, пока вся жидкость не будет заметно удалена из лунок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные три промывки, описанные на этом этапе, могут не понадобиться, если используется шайба для микропланшетов ИФА.
  13. Распределите 200 мкл реагента Эллмана в каждую лунку (не включая «пустые» скважины).
  14. Накройте тарелку новым защитным листом и оберните ее алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить воздействие света. Инкубировать в темноте при РТ в течение 1 ч.
  15. Убедитесь, что на обратной стороне пластины нет жидкости, которая может испортить показания спектрофотометра, протерев заднюю сторону сухим бумажным полотенцем.
  16. Прочтите табличку для поглощения при 405 нм (желтый цвет).

6. Анализ данных

  1. Рассчитайте среднюю поглощающую способность для каждого «бланка», NSB, стандарта, контроля качества и образцов.
  2. Вычтите средние значения поглощения NSB из стандартных значений поглощения, значений контроля качества и поглощения образца.
  3. График поглощения по оси Y и концентрация по оси X. Постройте стандартную кривую, используя четырехпараметрическую модель логистической регрессии.
  4. После того, как кривая построена, используйте уравнение кривой для определения интерполированных концентраций для контроля качества и образцов, которые можно прочитать по оси x.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная кривая проверяется только в том случае, если рассчитанная интерполированная концентрация для контроля качества находится в пределах 25% от ожидаемой концентрации (обычно 125 пг/мл, но см. этикетку флакона для контроля качества).

Результаты

В протоколе есть несколько ключевых шагов, которые следует выделить. Во-первых, апротинин, ингибитор сериновой протеазы, должен быть добавлен к образцам цельной крови сразу после сбора, чтобы предотвратить дальнейшую ферментативную деградацию CGRP. Было показано, что сериновые протеазы ...

Обсуждение

В этой статье описывается проверенный протокол, позволяющий обнаруживать и количественно определять CGRP в плазме человека. Этот протокол был синтезирован после того, как было обнаружено, что коммерческие наборы CGRP ELISA не точно определяют количественное количество этой молекулы. После ?...

Раскрытие информации

У авторов нет дополнительных раскрытий, которые они могли бы добавить.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Роберта Н. Коула, Лорен Р. Девайн и Маркоса Иглесиаса за их полезные обсуждения этого протокола. Это было частично поддержано финансированием Американского отологического общества (грант стипендии, PSK), Американского фонда исследований слуха (90066548/90072266, JPC) и Национального центра развития трансляционных наук (NCATS), компонента Национальных институтов здравоохранения (NIH) и Дорожной карты NIH по медицинским исследованиям (UL1 TR003098, NSF). Содержание публикации является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Джонса Хопкинса, МУТР, NCATS или NIH.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.7 mL Safeseal microcentrifuge tubeSorenson Bioscience, Inc.11510
99% methanolThermoFisher ScientificL13255.0F
15 mL conical centrifuge tubeFalcon14-959-49B
2 mL round bottom sterile cryovialsCRYO.S122263
4% acetic acidThermoFisher Scientific035572.K2
6.0 mL Vacutainer EDTA collection tubeBD367863
Allegra 64R benchtop centrifugeBeckman Coulter, Inc.367586
AprotininVWR76344-814
CGRP (human) ELISA kitBertin BioreagentA05481
CGRP stockBertin Bioreagent
EIA BufferBertin BioreagentA07000
Ellman's ReagentBertin BioreagentA09000_49+1
Multichannel pipettesThermoFisher Scientific4661180N
Oasis HLB 3 cc Vac CartridgesWatersWAT094226
Orbital ShakerBellco7744-01010
Precision micropipettesThermoFisher ScientificF144055MG
SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate readerMolecular DevicesPart Number M2
TBS/Fish GelatinBioworld, from Fischer Scientific50-199-167
Ultrapure water ELISA GradeBertin BioreagentA07001
Vacufuge plus - Centrifuge ConcentratorEppendorf22820109
Wash BufferBertin BioreagentA17000

Ссылки

  1. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. -. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  2. Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
  3. Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., McCulloch, J., Uddman, R. Calcitonin gene-related peptide and cerebral blood vessels: distribution and vasomotor effects. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 7 (6), 720-728 (1987).
  4. Donnerer, J., Stein, C. Evidence for an increase in the release of CGRP from sensory nerves during inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 657, 505-506 (1992).
  5. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
  6. Markowitz, S., Saito, K., Moskowitz, M. A. Neurogenically mediated leakage of plasma protein occurs from blood vessels in dura mater but not brain. The Journal of Neuroscience. 7 (12), 4129-4136 (1987).
  7. Saito, K., Markowitz, S., Moskowitz, M. A. Ergot alkaloids block neurogenic extravasation in dura mater: proposed action in vascular headaches. Annals of Neurology. 24 (6), 732-737 (1988).
  8. Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
  9. Cady, R. K., Vause, C. V., Ho, T. W., Bigal, M. E., Durham, P. L. Elevated saliva calcitonin gene-related peptide levels during acute migraine predict therapeutic response to rizatriptan. Headache. 49 (9), 1258-1266 (2009).
  10. Cernuda-Morollón, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
  11. Messlinger, K. The big CGRP flood-sources, sinks and signalling sites in the trigeminovascular system. The Journal of Headache and Pain. 19, 22 (2018).
  12. Ochoa-Callejero, L., et al. Circulating levels of calcitonin gene-related peptide are lower in COVID-19 patients. Journal of the Endocrine Society. 5 (3), (2021).
  13. Rizzi, M., et al. CGRP plasma levels correlate with the clinical evolution and prognosis of hospitalized acute COVID-19 patients. Viruses. 14 (10), 2123 (2022).
  14. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
  15. Sarchielli, P., et al. Clinical-biochemical correlates of migraine attacks in rizatriptan responders and non-responders. Cephalalgia. 26 (3), 257-265 (2006).
  16. Greco, R., et al. Plasma levels of CGRP and expression of specific microRNAs in blood cells of episodic and chronic migraine subjects: towards the identification of a panel of peripheral biomarkers of migraine. The Journal of Headache and Pain. 21 (1), 122 (2020).
  17. Tvedskov, J. F., et al. No increase of calcitonin gene-related peptide in jugular blood during migraine. Annals of Neurology. 58 (4), 561-568 (2005).
  18. Pellesi, L., et al. Plasma levels of CGRP during a 2-h infusion of VIP in healthy volunteers and patients with migraine: An exploratory study. Frontiers in Neurology. 13, 871176 (2022).
  19. Kruuse, C., Iversen, H. K., Jansen-Olesen, I., Edvinsson, L., Olesen, J. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) levels during glyceryl trinitrate (GTN)-induced headache in healthy volunteers. Cephalalgia. 30 (4), 467-474 (2010).
  20. Kraenzlin, M. E., Ch'ng, J. L., Mulderry, P. K., Ghatei, M. A., Bloom, S. R. Infusion of a novel peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP) in man. Pharmacokinetics and effects on gastric acid secretion and on gastrointestinal hormones. Regulatory Peptides. 10 (2-3), 189-197 (1985).
  21. Brain, S. D., Williams, T. J. Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide. Nature. 335 (6185), 73-75 (1988).
  22. Kim, Y. -. G., Lone, A. M., Nolte, W. M., Saghatelian, A. Peptidomics approach to elucidate the proteolytic regulation of bioactive peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8523-8527 (2012).
  23. Katayama, M., et al. Catabolism of calcitonin gene-related peptide and substance P by neutral endopeptidase. Peptides. 12 (3), 563-567 (1991).
  24. Hartopo, A. B., et al. Endothelin-converting enzyme-1 gene ablation attenuates pulmonary fibrosis via CGRP-cAMP/EPAC1 pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 465-476 (2013).
  25. Mair, J., et al. Plasma CGRP in acute myocardial infarction. Lancet. 335 (8682), 168 (1990).
  26. Antúnez, C., et al. Calcitonin gene-related peptide modulates interleukin-13 in circulating cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive T cells in patients with atopic dermatitis. The British Journal of Dermatology. 161 (3), 547-553 (2009).
  27. Gangula, P. R., et al. Pregnancy and steroid hormones enhance the vasodilation responses to CGRP in rats. The American Journal of Physiology. 276 (1), H284-H288 (1999).
  28. Hernanz, A., Medina, S., de Miguel, E., Martín-Mola, E. Effect of calcitonin gene-related peptide, neuropeptide Y, substance P, and vasoactive intestinal peptide on interleukin-1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha production by peripheral whole blood cells from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Regulatory Peptides. 115 (1), 19-24 (2003).
  29. Takeba, Y., Suzuki, N., Kaneko, A., Asai, T., Sakane, T. Evidence for neural regulation of inflammatory synovial cell functions by secreting calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism. 42 (11), 2418-2429 (1999).
  30. Ahmed, M., Srinivasan, G. R., Theodorsson, E., Schultzberg, M., Kreicbergs, A. Effects of surgical denervation on substance P and calcitonin gene-related peptide in adjuvant arthritis. Peptides. 16 (4), 569-579 (1995).
  31. Neugebauer, V., Rümenapp, P., Schaible, H. G. Calcitonin gene-related peptide is involved in the spinal processing of mechanosensory input from the rat's knee joint and in the generation and maintenance of hyperexcitability of dorsal horn-neurons during development of acute inflammation. Neuroscience. 71 (4), 1095-1109 (1996).
  32. Wang, L. H., et al. Serum levels of calcitonin gene-related peptide and substance P are decreased in patients with diabetes mellitus and coronary artery disease. The Journal of International Medical Research. 40 (1), 134-140 (2012).
  33. Zelissen, P. M., Koppeschaar, H. P., Lips, C. J., Hackeng, W. H. Calcitonin gene-related peptide in human obesity. Peptides. 12 (4), 861-863 (1991).
  34. World Health Organization. WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. 3, Blood-sampling systems. World Health Organization. , (2010).
  35. Raffaelli, B., et al. Plasma calcitonin gene-related peptide (CGRP) in migraine and endometriosis during the menstrual cycle. Annals of Clinical and Translational Neurology. 8 (6), 1251-1259 (2021).
  36. Andreasson, U., et al. A practical guide to immunoassay method validation. Frontiers in Neurology. 6, 179 (2015).
  37. Messlinger, K., et al. CGRP measurements in human plasma-a methodological study. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (13), 1359-1373 (2021).
  38. Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
  39. Lee, J. -. E., Kim, S. Y., Shin, S. -. Y. Effect of repeated freezing and thawing on biomarker stability in plasma and serum samples. Osong Public Health and Research Perspectives. 6 (6), 357-362 (2015).
  40. Fan, P. -. C., Kuo, P. -. H., Lee, M. T., Chang, S. -. H., Chiou, L. -. C. Plasma calcitonin gene-related peptide: A potential biomarker for diagnosis and therapeutic responses in pediatric migraine. Frontiers in Neurology. 10, 10 (2019).
  41. Raffaelli, B., et al. Change of CGRP plasma concentrations in migraine after discontinuation of CGRP-(receptor) monoclonal antibodies. Pharmaceutics. 15 (1), 293 (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены