Nachweis und Quantifizierung von Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) in humanem Plasma mit Hilfe eines modifizierten Enzyme-linked Immunosorbent Assays

Zusammenfassung

Publizierte Daten zu Calcitonin-Gen-Related Peptide (CGRP)-Konzentrationen im menschlichen Plasma sind widersprüchlich. Diese Inkonsistenzen könnten auf das Fehlen einer standardisierten, validierten Methodik zur Quantifizierung dieses Neuropeptids zurückzuführen sein. In dieser Arbeit beschreiben wir ein validiertes ELISA-Protokoll (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) zur Aufreinigung und Quantifizierung von CGRP in humanem Plasma.

Zusammenfassung

Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) ist ein vasoaktives Neuropeptid, das vermutlich eine Rolle in der Pathophysiologie von Migränekopfschmerzen spielt und ein Kandidat für den Biomarkerstatus sein könnte. CGRP wird bei der Aktivierung aus neuronalen Fasern freigesetzt und induziert eine sterile neurogene Entzündung und arterielle Vasodilatation im Gefäßsystem, das eine trigeminale efferente Innervation erhält. Das Vorhandensein von CGRP im peripheren Gefäßsystem hat Untersuchungen zum Nachweis und zur Quantifizierung dieses Neuropeptids im menschlichen Plasma mit Hilfe von Proteom-Assays, wie dem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), angeregt. Die Halbwertszeit von 6,9 min und die Variabilität in den technischen Details der Assay-Protokolle, die oft nicht vollständig beschrieben sind, haben jedoch zu inkonsistenten CGRP-ELISA-Daten in der Literatur geführt. In dieser Arbeit wird ein modifiziertes ELISA-Protokoll zur Aufreinigung und Quantifizierung von CGRP in humanem Plasma vorgestellt. Die Verfahrensschritte umfassen die Probenentnahme und -vorbereitung, die Extraktion mit einem polaren Sorptionsmittel als Reinigungsmittel, zusätzliche Schritte zur Blockierung unspezifischer Bindungen und die Quantifizierung mittels ELISA. Darüber hinaus wurde das Protokoll mit Spike- und Recovery- und Linearitätsexperimenten validiert. Dieses validierte Protokoll kann theoretisch verwendet werden, um CGRP-Konzentrationen im Plasma von Personen mit Migräne, aber auch mit anderen Erkrankungen, bei denen CGRP eine Rolle spielen könnte, zu quantifizieren.

Einleitung

Das Calcitonin-Gen-Related Peptide (CGRP) ist ein Neuropeptid mit 37 Aminosäuren, das sowohl in neuronalen Fasern mit perivaskulärer Lokalisation als auch in nicht-neuronalen Geweben vorkommt. Die beiden Formen von CGRP, α- und β-CGRP, haben eine Homologie von mehr als 90 % und gemeinsame physiologische Funktionen. αCGRP kommt jedoch im zentralen und peripheren Nervensystem vor, während βCGRP im enterischen Nervensystem vorkommt ^1,2. Bei Nozizeptoraktivierung und kalziumabhängiger Exozytose wird CGRP aus Neuronen freigesetzt, was zu einer sterilen neurogenen Entzündung mit arterieller Vasodilatation und Plasmaproteinextravasation führt 3,4,5,6,7. Von hier aus erscheint CGRP in den postkapillaren Gefäßen und kann ein Biomarker für Krankheiten sein, die eine afferente nozizeptive Aktivierung verursachen, wie z. B. Migräne 8,9,10,11. Bemerkenswert ist, dass CGRP aufgrund seiner Rolle bei der Angiogenese und Immunmodulation auch mit COVID-19 in Verbindung gebracht wird und eine ungünstige Krankheitsentwicklung vorhersagen kann^12,13. Daher könnte ein Protokoll zur genauen Quantifizierung von CGRP in menschlichem Plasma einen breiten Wert haben.

Die meiste Aufmerksamkeit wurde vielleicht der Rolle von CGRP bei Migräne geschenkt. Basierend auf präklinischen und klinischen Studien wurde CGRP als möglicher Biomarker für Migräne und als Ziel für die Behandlung vorgeschlagen 3,4,5,6,7,8,9,10. Einige Studien haben eine Erhöhung des CGRP in Kohorten mit episodischer Migräne im Vergleich zu Kontrollteilnehmern festgestellt^10,14,15. Der Erfolg von CGRP-Inhibitoren in klinischen Studien zur Behandlung von Migränekopfschmerzen scheint darauf hinzudeuten, dass ein erhöhter CGRP ein ursächlicher Faktor für Migränekopfschmerzen ist. Allerdings haben nicht alle Forscher diese Ergebnisse bestätigt^16,17,18,19. Darüber hinaus muss die Rolle von CGRP bei den nicht-kopfschmerzbedingten Symptomen der Migräne noch geklärt werden. Die aktuelle Arbeit wurde durch den Wunsch motiviert, die Rolle von CGRP bei vestibulären Symptomen der Migräne zu verstehen.

Widersprüchliche CGRP-Immunoassay-Daten in der Literatur können mehrere Gründe haben. Erstens beträgt die Halbwertszeit von CGRP in den peripheren Gefäßen 6,9 min 20, was auf die Aktivität der Serinproteasen 21, der insulinabbauenden Enzyme und anderer Metalloproteasen 22, der neutralen Endopeptidasen 23 und des Endothelin-konvertierenden Enzyms-1 ²⁴ zurückzuführen ist. Zweitens werden die unterschiedlichen technischen Details der Immunoassays, die zur Quantifizierung von CGRP verwendet werden, in solchen Studien nicht vollständig beschrieben. Schließlich macht die mangelnde Standardisierung der Immunoassay-Methodik das Bild noch komplizierter.

Dieser Artikel beschreibt ein modifiziertes ELISA-Protokoll (Enzyme-linked Immunosorbent Assay), das die Aufreinigung und genaue Quantifizierung von α- und βCGRP in humanem Plasma ermöglicht. Die Antikörper des Kits sind nicht kreuzreaktiv mit Amylin, Calcitonin oder Substanz P. Dieses Protokoll wurde den notwendigen Validierungsexperimenten unterzogen, wie z. B. Spike und Recovery und Linearität der Verdünnung, deren Daten hier vorgestellt werden. Ein solches CGRP-ELISA-Protokoll, das einer Validierung unterzogen wurde, ist in der Literatur bisher nicht vollständig beschrieben worden. Dieses Protokoll kann zur Quantifizierung von CGRP im menschlichen Plasma im Zusammenhang mit Migräne sowie kardiologisch 2,25, dermatologisch 26, geburtshilflich 27, rheumatologisch^28,29, muskuloskelettal 30,31, endokrin ^32,33 und Viruserkrankungen ^12,13 verwendet werden, an denen CGRP beteiligt ist.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde unter Verwendung menschlicher Plasmaproben von Personen entwickelt, die mit Genehmigung des Johns Hopkins Institutional Review Board (NA_00092491) ausgewählt wurden.

1. Probenentnahme und -vorbereitung

1. Sammeln Sie 5 ml Vollblut aus der Vena antecubitalis über Standard-Venenpunktionsmethoden³⁴ in ein 6-ml-Vacutainer-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Sammelröhrchen.
2. Nach der Entnahme werden 0,5 ml Aprotinin (10.000 KIU/ml) kompetitiver Serinprotease-Inhibitor in das Röhrchen gegeben, um die Lyse des Zielpeptids zu blockieren. Drehen Sie den Schlauch 10 Mal um, damit sich das Aprotinin ausreichend mit dem Blut vermischen kann. Lagern Sie die Röhrchen anschließend bis zum nächsten Schritt auf Eis.
3. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 604 x g für 4 min bei 4 °C innerhalb von 60 min nach der Blutentnahme.
4. Die Plasmafraktion wird mit einer Pipette entnommen und in sterile Kryoflaschen mit rundem Boden von 2 ml überführt.
5. Lagern Sie die Kryoflaschen sofort bei -80 °C für bis zu 2 Wochen.

2. Extraktion der Plasmaproben

1. Setzen Sie eine Extraktionskartusche in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen ein, wobei die äußeren Rippen der Kartusche von den äußeren Rippen des Röhrchens gestützt werden.
2. Aktivieren Sie die Kartusche, indem Sie zuerst 5 ml 100%iges Methanol und dann 10 ml Reinstwasser durch die Kartusche leiten.
   1. Wenn die Flüssigkeit durch die Kartusche durch die Schwerkraft geleitet wird, sammelt sie sich im Rohr.
   2. Schütten Sie überschüssige Flüssigkeit aus, wenn sie sich ansammelt, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit die Kartusche nicht verschlingt.
   3. Stellen Sie sicher, dass die Kartusche während des Experiments nicht austrocknet.
3. 250 μl Plasma mit 750 μl 4%iger Essigsäure verdünnen.
4. 1 ml Plasma und Essigsäurelösung langsam durch die Kartusche geben.
   Anmerkungen: Dieser Schritt sollte für jeden durchgelassenen Milliliter ca. 30 s dauern .
5. Waschen Sie die Kartusche mit 10 ml 4%iger Essigsäure. Werfen Sie wie zuvor die überschüssige Flüssigkeit weg, wenn sie sich ansammelt, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit die Kartusche nicht verschlingt.
6. Nachdem der letzte Tropfen Essigsäure aus der Kartusche abgelassen wurde, nehmen Sie die Kartusche aus dem Röhrchen und legen Sie sie in ein neues konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
7. Bereiten Sie eine 10:1-Lösung aus 100 % Methanol und 4 % Essigsäure vor, indem Sie 2,7 ml 4 % Essigsäure und 0,3 ml 100 % Methanol mischen. Verwenden Sie dies, um das CGRP zu eluieren, indem Sie diese Lösung jeweils 1 ml durch die Kartusche leiten. Zwischen jedem Milliliter der ausgetretenen Lösung eine Pause von 25 Minuten einlegen. Werfen Sie den Eluenten NICHT weg.
8. Das Röhrchen enthält 3 ml der eluierten Flüssigkeit 25 Minuten, nachdem der letzte Milliliter der Methanol- und Essigsäurelösung abgelaufen ist. Geben Sie jeweils 1 ml des Eluenten in ein 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Dies sollte drei Mikrozentrifugenröhrchen aus jeder Kartusche ergeben.
9. Legen Sie jedes Röhrchen für 1 s in eine Minizentrifuge, um sicherzustellen, dass sich der gesamte Eluent am Boden jedes Röhrchens befindet.
10. Trocknen Sie alle Proben durch Vakuumzentrifugation bei 4 °C (bei wässrigen Lösungen auf Konzentratorfunktion bei 1.400 U/min; die g-Kraft variiert je nach Position der Röhrchen und liegt daher zwischen 130 und 250 x g).
    HINWEIS: Die Zeit, die die Vakuumzentrifuge zum Trocknen der Proben benötigt, hängt von der Art des verwendeten Mikrozentrifugenröhrchens ab.
11. Unmittelbar vor dem Fortfahren mit dem Assay-Verfahren (Schritt 4.1) wird die zuvor getrocknete Probe mit einem auf Raumtemperatur (RT) oder 20 °C aufgetauten Enzymimmunoassay-Puffer (EIA) (siehe Materialtabelle) rekonstituiert.
    Anmerkungen: Das Volumen des EIA-Puffers, der zur Rekonstitution der getrockneten Probe verwendet wird, sollte dem ursprünglichen Probenvolumen oder 250 μl entsprechen.

3. Vorbereitung der ELISA-Platte - Blockierung zur Begrenzung der unspezifischen Bindung

1. Geben Sie 250 μl Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS)/Fischgelatine-Blockierungspuffer in jede Vertiefung auf der Platte.
2. Ein Deckblatt über die Platte legen und 2 h bei RT inkubieren.
3. Entfernen Sie das Deckblatt und entleeren Sie die Platte durch Inversion oder Aspiration mit einer Mehrkanalpipette. Tupfen Sie dann den Teller auf ein Papiertuch, um alle Spuren von Flüssigkeit zu entfernen.
4. Trocknen Sie die Platte, indem Sie die Platte 10 Minuten lang in einer Laminar-Flow-Haube belassen.
5. Nachdem die Platte sichtbar trocken ist, legen Sie sie in einen griffversiegelten Folienbeutel mit einem Kieselgel-Trockenmittelbeutel und lagern Sie den Beutel 24 h bei -20 °C.
   Anmerkungen: Die Platten sollten innerhalb von 4 Wochen nach der Inkubation der Platten verwendet werden.

4. Vor dem Testverfahren

1. Bereiten Sie die Reagenzien (EIA-Puffer, CGRP-Standard, CGRP-Qualitätskontrolle, CGRP-Tracer, Waschpuffer) gemäß den Anweisungen des Kits vor. Bereiten Sie das Ellman-Reagenz erst nach Ablauf der Inkubationszeit von 16-20 Stunden vor.
2. Tauen Sie alle Proben und Reagenzien auf RT auf, bevor Sie den Rest des Protokolls durchführen.

5. Ablauf des Assays

1. Spülen Sie jede Vertiefung fünfmal in der verstopften Platte mit einem im Kit enthaltenen Waschpuffer (300 μL/Well). Halten Sie für jede Spülung 30 Sekunden an, nachdem Sie den Waschpuffer in die Vertiefungen gegeben haben, und schütten Sie dann die Flüssigkeit aus oder saugen Sie sie mit einer Mehrkanalpipette ab.
2. Entfernen Sie nach der letzten Spülung den gesamten Puffer aus den Vertiefungen durch Inversion (Umdrehen der Platte, um die Flüssigkeit in den Vertiefungen auszustoßen) oder durch Absaugen mit einer Mehrkanalpipette. Tupfen Sie die letzten Tropfen auf ein Papiertuch und klopfen Sie auf die umgedrehte Platte, bis die gesamte Flüssigkeit sichtbar aus den Vertiefungen entfernt ist.
3. Stellen Sie mindestens zwei Vertiefungen ohne Reagenzien oder Puffer beiseite, die als "leere" Vertiefungen bezeichnet werden. Legen Sie dann mindestens zwei weitere Vertiefungen für die unspezifische Bindung (NSB) beiseite.
4. Geben Sie 100 μl EIA-Puffer in jede NSB-Vertiefung.
5. Geben Sie 100 μl der CGRP-Standards in zweifacher Ausführung in geeignete Vertiefungen ab.
6. 100 μl Proben (rekonstituiert im EIA-Puffer) und Qualitätskontrolle in doppelter Ausführung in geeignete Vertiefungen dosieren.
7. Geben Sie 100 μl CGRP-Tracer (Anti-CGRP-Antikörper, der an die Acetylcholinesterase gebunden ist) in jede Vertiefung, die NSB, CGRP-Standards, Proben und Qualitätskontrollen enthält. Geben Sie Tracer nicht in die "Blank"-Vertiefungen ab.
8. Decken Sie die Platte mit einer durchsichtigen Deckfolie ab und versiegeln Sie jede Vertiefung so, dass die Proben und Reagenzien in jeder Vertiefung nicht wesentlich verdunsten. Die Platte 16-20 h bei 4 °C inkubieren.
9. Rekonstituieren Sie nach Abschluss der Inkubation das Ellman-Reagenz gemäß den Anweisungen des Kits.
10. Drehen Sie die Platte um, um die gesamte Flüssigkeit zu entfernen. Spülen Sie jede Vertiefung (wie oben beschrieben) dreimal mit 300 μl Waschpuffer aus.
11. Entfernen Sie nach dem dritten Spülgang die Flüssigkeit von den Tellern, legen Sie die Platte auf eine Schüttelplatte und schütteln Sie sie 2 Minuten lang bei 120 U/min.
12. Waschen Sie den Teller weitere dreimal. Entfernen Sie nach der letzten Spülung den gesamten Puffer aus den Vertiefungen durch Inversion oder Aspiration mit einer Mehrkanalpipette. Tupfen Sie die letzten Tropfen Flüssigkeit auf ein Papiertuch und klopfen Sie auf die umgedrehte Platte, bis die gesamte Flüssigkeit sichtbar aus den Vertiefungen entfernt ist.
    HINWEIS: Die zusätzlichen drei Waschgänge, die in diesem Schritt beschrieben werden, sind möglicherweise nicht erforderlich, wenn Sie einen ELISA-Mikrotiterplatten-Washer verwenden.
13. Geben Sie 200 μl des Ellman-Reagenzes in jede Vertiefung (ohne die "leeren" Vertiefungen).
14. Decken Sie die Platte mit einem neuen Abdeckblech ab und wickeln Sie sie in Alufolie ein, um eine Lichteinwirkung zu vermeiden. Inkubieren Sie im Dunkeln bei RT für 1 h.
15. Stellen Sie sicher, dass sich keine Flüssigkeit auf der Rückseite der Platte befindet, die den Messwert des Spektralphotometers verfälschen könnte, indem Sie die Rückseite mit einem trockenen Papiertuch abwischen.
16. Lesen Sie die Platte für die Absorption bei 405 nm (gelbe Farbe) ab.

6. Datenanalyse

1. Berechnen Sie die durchschnittliche Absorption für jede "Leer-", NSB-, Standard-, Qualitätskontrolle und die Proben.
2. Subtrahieren Sie die durchschnittlichen NSB-Absorptionswerte von den Standard-, Qualitätskontroll- und Probenabsorptionswerten.
3. Zeichnen Sie die Absorption auf der y-Achse und die Konzentration auf der x-Achse auf. Konstruieren Sie eine Standardkurve mithilfe eines logistischen Regressionsmodells mit vier Parametern.
4. Sobald die Kurve konstruiert ist, verwenden Sie die Gleichung der Kurve, um die interpolierten Konzentrationen für die Qualitätskontrolle und die Proben zu bestimmen, die auf der x-Achse abgelesen werden können.
   HINWEIS: Die Standardkurve wird nur validiert, wenn die berechnete interpolierte Konzentration für die Qualitätskontrolle innerhalb von 25 % der erwarteten Konzentration liegt (normalerweise 125 pg/ml, siehe Etikett des Qualitätskontrollfläschchens).

Ergebnisse

Es gibt mehrere wichtige Schritte im Protokoll, die hervorgehoben werden sollten. Erstens muss Aprotinin, ein Serinproteasehemmer, den Vollblutproben sofort nach der Entnahme zugesetzt werden, um einen weiteren enzymatischen Abbau von CGRP zu verhindern. Es wurde gezeigt, dass Serinproteasen eine Rolle im CGRP-Stoffwechsel spielen, und in einer früheren Studie wurde auch Aprotinin zur Quantifizierung von CGRP beim Menschen verwendet^21,35. Wenn keine Proteasehemm...

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt ein validiertes Protokoll, das den Nachweis und die Quantifizierung von CGRP in humanem Plasma ermöglicht. Dieses Protokoll wurde synthetisiert, nachdem sich herausgestellt hatte, dass kommerzielle CGRP-ELISA-Kits dieses Molekül nicht genau quantifizieren konnten. Nach der Erstellung eines Probenvorbereitungsprotokolls und einer gültigen Standardkurve zeigten die Experimente zur Spitzen- und Ausbeute sowie zur Linearität der Verdünnung, dass der Prozentsatz der Gewinnungsraten viel geringer...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube	Sorenson Bioscience, Inc.	11510
99% methanol	ThermoFisher Scientific	L13255.0F
15 mL conical centrifuge tube	Falcon	14-959-49B
2 mL round bottom sterile cryovials	CRYO.S	122263
4% acetic acid	ThermoFisher Scientific	035572.K2
6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube	BD	367863
Allegra 64R benchtop centrifuge	Beckman Coulter, Inc.	367586
Aprotinin	VWR	76344-814
CGRP (human) ELISA kit	Bertin Bioreagent	A05481
CGRP stock	Bertin Bioreagent
EIA Buffer	Bertin Bioreagent	A07000
Ellman's Reagent	Bertin Bioreagent	A09000_49+1
Multichannel pipettes	ThermoFisher Scientific	4661180N
Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges	Waters	WAT094226
Orbital Shaker	Bellco	7744-01010
Precision micropipettes	ThermoFisher Scientific	F144055MG
SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader	Molecular Devices	Part Number M2
TBS/Fish Gelatin	Bioworld, from Fischer Scientific	50-199-167
Ultrapure water ELISA Grade	Bertin Bioreagent	A07001
Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator	Eppendorf	22820109
Wash Buffer	Bertin Bioreagent	A17000