변형된 효소 결합 면역흡착 분석을 사용한 인간 혈장 내 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)의 검출 및 정량화

요약

인간 혈장 내 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP) 농도와 관련된 발표된 데이터는 일관성이 없습니다. 이러한 불일치는 이 신경펩티드를 정량화하기 위한 표준화되고 검증된 방법론이 없기 때문일 수 있습니다. 여기에서는 인간 혈장에서 CGRP를 정제하고 정량화하기 위한 검증된 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 프로토콜을 설명합니다.

초록

칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)는 편두통의 병태생리학에서 추정되는 역할을 하는 혈관활성 신경펩타이드이며 바이오마커 상태의 후보가 될 수 있습니다. CGRP는 활성화시 신경 섬유에서 방출되어 삼차 원심성 신경 분포를받는 혈관 구조에서 멸균 신경 인성 염증 및 동맥 혈관 확장을 유도합니다. 말초 맥관 구조에서 CGRP의 존재는 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)과 같은 단백질체 분석을 사용하여 인간 혈장에서이 신경 펩티드를 검출하고 정량화하기위한 연구에 박차를 가했다. 그러나 6.9분의 반감기와 종종 완전히 설명되지 않은 분석 프로토콜의 기술적 세부 사항의 가변성으로 인해 문헌에서 일관되지 않은 CGRP ELISA 데이터가 생성되었습니다. 여기서, 인간 혈장에서 CGRP의 정제 및 정량화를위한 수정 된 ELISA 프로토콜이 제시된다. 절차적 단계에는 시료 수집 및 준비, 정제 수단으로 극성 흡착제를 사용한 추출, 비특이적 결합을 차단하기 위한 추가 단계, ELISA를 통한 정량화가 포함됩니다. 또한, 이 프로토콜은 희석 실험의 스파이크 및 회수 및 선형성으로 검증되었습니다. 이 검증 된 프로토콜은 이론적으로 편두통뿐만 아니라 CGRP가 역할을 할 수있는 다른 질병이있는 개인의 혈장에서 CGRP 농도를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)는 혈관주위 국소화가 있는 뉴런 섬유와 비뉴런 조직에 존재하는 37개 아미노산 뉴로펩타이드입니다. CGRP의 두 가지 형태 인 α-CGRP와 β-CGRP는 90 % 이상의 상 동성을 공유하고 생리 기능을 공유합니다. 그러나 αCGRP는 중추 신경계 및 말초 신경계에서 발견되는 반면 βCGRP는 장 신경계에서 발견됩니다 ^1,2. 통각 수용체 활성화 및 칼슘 의존성 엑소 사이토 시스시, CGRP는 뉴런에서 방출되어 동맥 혈관 확장 및 혈장 단백질 유출을 포함하는 무균 신경 인성 염증을 유도합니다 3,4,5,6,7. 여기에서 CGRP는 모세 혈관 후 혈관에 나타나며 편두통 8,9,10,11과 같은 구 심성 통각 수용 활성화를 유발하는 질병에 대한 바이오 마커 일 수 있습니다. 참고로, CGRP는 혈관 신생 및 면역 조절에서의 역할을 통해 COVID-19와 관련이 있으며 바람직하지 않은 질병 진화를 예측할 수 있습니다^12,13. 따라서, 인간 혈장에서 CGRP의 정확한 정량화를위한 프로토콜은 광범위한 가치를 가질 수있다.

편두통에서 CGRP의 역할에 가장 많은 관심을 기울였을 것입니다. 전임상 및 임상 연구를 기반으로 CGRP는 편두통에 대한 가능한 바이오 마커 및 치료 표적으로 제시되었습니다 3,4,5,6,7,8,9,10. 일부 연구에서는 대조군 참가자^10,14,15에 비해 일시적인 편두통이 있는 코호트에서 CGRP의 상승을 발견했습니다. 편두통 치료를위한 임상 시험에서 CGRP 억제제의 성공은 편두통의 원인 인자로서 CGRP 상승을 암시하는 것으로 보인다. 그러나 모든 조사자가 이러한 결과를 확증한 것은 아닙니다^(16,17,18,19). 또한, 편두통의 비 두통 증상에서 CGRP의 역할은 아직 밝혀지지 않았다. 현재의 연구는 편두통의 전정 증상에서 CGRP의 역할을 이해하고자하는 열망에 의해 동기가 부여되었습니다.

문헌에서 일관되지 않은 CGRP 면역 분석 데이터는 몇 가지 이유 때문일 수 있습니다. 첫째, 말초 맥관 구조에서 CGRP의 반감기는 세린 프로테아제 21, 인슐린 분해 효소 및 기타 메탈로 프로테아제 22, 중성 엔도 펩티다아제 23 및 엔도 텔린 전환 효소 -1 24의 활성으로 인해 6.9 분 ²⁰이다. 둘째, CGRP를 정량화하는 데 사용되는 면역 측정법의 다양한 기술적 세부 사항은 그러한 연구에서 완전히 설명되지 않았습니다. 마지막으로, 면역 분석 방법론의 표준화 부족은 그림을 더욱 복잡하게 만듭니다.

이 기사에서는 인간 혈장에서 α- 및 βCGRP의 정제 및 정확한 정량화를 허용하는 수정된 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 프로토콜에 대해 설명합니다. 키트의 항체는 아밀린, 칼시토닌 또는 물질 P와 교차 반응하지 않습니다. 이 프로토콜은 스파이크 및 회수 및 희석의 선형성과 같은 필요한 검증 실험을 거쳤으며, 이에 대한 데이터는 여기에 제시되어 있습니다. 검증을 거친 이러한 CGRP ELISA 프로토콜은 이전에 문헌에 완전히 설명되지 않았습니다. 이 프로토콜은 편두통뿐만 아니라^심장 2,25, 피부과 26, 산부인과 27, 류마티스^28,29, 근골격계^30,31, 내분비 32,33 및 바이러스 성 질환^12,13의 맥락에서 인간 혈장에서 CGRP를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Johns Hopkins Institutional Review Board(NA_00092491)의 승인을 받아 동의한 개인의 인간 혈장 샘플을 사용하여 개발되었습니다.

1. 시료 채취 및 준비

1. 표준 정맥 천자 방법³⁴를 통해 전주복 정맥에서 5mL의 전혈을 6mL 진공 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 수집 튜브에 수집합니다.
2. 표적 펩티드의 용해를 막기 위하여 수집 후에 관에 aprotinin (10,000 KIU/mL)의 aprotinin (10,000 KIU/mL) 경쟁적인 세린 프로테아제 저해제의 0.5 mL를 추가하십시오. 아프로티닌이 혈액과 적절하게 섞일 수 있도록 튜브를 10번 뒤집습니다. 그런 다음 다음 단계까지 튜브를 얼음에 보관하십시오.
3. 혈액 수집 후 60분 이내에 4°C에서 4분 동안 튜브를 604 x g 에서 원심분리합니다.
4. 피펫으로 혈장 분획을 제거하고 2mL 둥근 바닥 멸균 극저온 생물로 옮깁니다.
5. 극저온 난자를 즉시 -80°C에서 최대 2주 동안 보관합니다.

2. 혈장 시료 추출

1. 추출 카트리지를 15mL 원뿔형 원심분리기 튜브 안에 넣고 카트리지의 외부 돌출부가 튜브의 외부 돌출부로 지지되도록 합니다.
2. 먼저 5mL의 100% 메탄올을 통과시킨 다음 10mL의 초순수를 카트리지에 통과시켜 카트리지를 활성화합니다.
   1. 유체가 중력 구동 흐름을 통해 카트리지를 통과하면 튜브에 모입니다.
   2. 액체가 카트리지를 삼키지 않도록 과도한 액체가 쌓이면 버리십시오.
   3. 실험 과정에서 카트리지가 마르지 않는지 확인하십시오.
3. 혈장 250μL를 4% 아세트산 750μL로 희석합니다.
4. 1mL의 혈장과 아세트산 용액을 카트리지에 천천히 통과시킵니다.
   알림: 이 단계는 통과된 각 밀리리터에 대해 중력 구동 흐름을 통해 약 30초가 소요됩니다.
5. 카트리지를 4% 아세트산 10mL로 세척합니다. 이전과 마찬가지로 액체가 카트리지를 삼키지 않도록 축적된 초과 유체를 버리십시오.
6. 카트리지에서 마지막 아세트산 한 방울을 제거한 후 튜브에서 카트리지를 꺼내 새 15mL 원추형 원심분리기 튜브에 넣습니다.
7. 4% 아세트산 2.7mL와 100% 메탄올 0.3mL를 혼합하여 100% 메탄올과 4% 아세트산의 10:1 용액을 준비한다. 이 용액을 한 번에 1mL의 카트리지에 통과시켜 CGRP를 용출시키는 데 사용하십시오. 통과 된 각 밀리리터의 용액 사이에 25 분 동안 일시 중지하십시오. 용리액을 버리지 마십시오.
8. 튜브에는 메탄올과 아세트산 용액의 마지막 밀리리터가 통과한 후 25분 후에 용출된 유체 3mL가 들어 있습니다. 각 1mL의 용리액을 1.7mL 미세원심분리기 튜브에 넣습니다.
   알림: 이렇게 하면 각 카트리지에서 3개의 미세 원심분리기 튜브가 생성됩니다.
9. 각 튜브를 미니 원심분리기에 1초 동안 넣어 모든 용리액이 각 튜브의 바닥에 오도록 합니다.
10. 4 ° C에서 진공 원심 분리로 모든 샘플을 건조시킵니다 (수용액의 경우 1,400 rpm에서 농축기 기능으로 설정, g- 힘은 튜브의 위치에 따라 달라 지므로 130-250 x g 범위).
    알림: 진공 원심분리기가 샘플을 건조하는 데 걸리는 시간은 사용되는 미세 원심분리기 튜브의 유형에 따라 다릅니다.
11. 분석 절차(단계 4.1)를 진행하기 직전에, 실온(RT) 또는 20°C로 해동된 효소면역분석법(EIA) 완충액( 재료 표 참조)으로 이전에 건조된 샘플을 재구성한다.
    알림: 건조된 샘플을 재구성하는 데 사용되는 EIA 버퍼의 부피는 원래 샘플과 같아야 합니다.amp부피 또는 250μL.

3. ELISA 플레이트의 제조 - 비특이적 결합을 제한하기 위한 차단

1. 플레이트의 각 웰에 250μL의 트리스 완충 식염수(TBS)/생선 젤라틴 차단 완충액을 추가합니다.
2. 플레이트 위에 커버 시트를 놓고 RT에서 2시간 동안 배양합니다.
3. 커버 시트를 제거하고 멀티채널 피펫을 사용하여 반전 또는 흡인으로 플레이트를 비웁니다. 그런 다음 종이 타월로 접시를 닦아 액체의 흔적을 버립니다.
4. 플레이트를 층류 후드에 10분 동안 그대로 두어 플레이트를 건조시킵니다.
5. 플레이트가 눈에 띄게 건조되면 실리카겔 건조제 봉지와 함께 그립 밀봉 호일 파우치에 넣고 파우치를 -20°C에서 24시간 동안 보관합니다.
   참고: 플레이트는 플레이트 배양 후 4주 이내에 사용해야 합니다.

4. 분석 절차 전

1. 키트 지침에 따라 시약 (EIA 버퍼, CGRP 표준, CGRP 품질 관리, CGRP 추적기, 세척 버퍼)을 준비하십시오. 16-20 시간 배양 기간이 끝난 후에 만 Ellman의 시약을 준비하십시오.
2. 모든 샘플을 해동하고 나머지 프로토콜을 수행하기 전에 RT로 시약을 투여합니다.

5. 분석 절차

1. 키트에서 제공하는 세척 완충액(300μL/웰)으로 차단된 플레이트의 각 웰을 5회 헹굽니다. 각 헹굼에 대해 세척 버퍼를 웰에 넣은 후 30초 동안 일시 중지한 다음 액체를 버리거나 다중 채널 피펫을 사용하여 흡인합니다.
2. 최종 헹굼 후, 반전(웰 내의 액체를 배출하기 위해 플레이트 반전) 또는 다중 채널 피펫을 사용한 흡인에 의해 웰에서 모든 완충액을 제거합니다. 마지막 방울을 종이 타월에 닦아내고 모든 액체가 우물에서 눈에 띄게 제거 될 때까지 거꾸로 된 판을 두드립니다.
3. "블랭크" 웰로 알려진 시약이나 완충액이 없는 웰을 최소 2개 이상 따로 보관하십시오. 그런 다음 비특이적 결합(NSB)을 위해 적어도 두 개의 다른 웰을 따로 보관하십시오.
4. 100μL의 EIA 버퍼를 각 NSB 웰에 분배합니다.
5. 100 μL의 CGRP 표준물질을 적절한 웰에 이중으로 분배합니다.
6. 100 μL의 시료(EIA 완충액에서 재구성됨)와 품질 관리를 적절한 웰에 이중으로 분배합니다.
7. 100 μL의 CGRP 추적자 (아세틸 콜린 에스테라아제에 부착 된 항 -CGRP 항체)를 NSB, CGRP 표준물질, 샘플 및 품질 관리가 포함 된 각 웰에 분배합니다. "블랭크" 웰에 추적기를 분배하지 마십시오.
8. 투명 커버 시트를 사용하여 플레이트를 덮고 각 웰의 샘플과 시약이 크게 증발하지 않도록 각 웰을 밀봉합니다. 플레이트를 4°C에서 16-20시간 동안 인큐베이션합니다.
9. 배양이 완료된 후 키트 지침에 따라 Ellman의 시약을 재구성합니다.
10. 플레이트를 뒤집어 모든 액체를 제거합니다. 각 웰(위에서 설명한 대로)을 300μL의 세척 완충액으로 3회 헹굽니다.
11. 세 번째 헹굼 후 플레이트에서 액체를 제거하고 플레이트를 셰이커 플레이트에 놓고 120rpm에서 2분 동안 흔들어 줍니다.
12. 접시를 세 번 더 씻으십시오. 최종 헹굼 후, 멀티채널 피펫을 사용하여 반전 또는 흡인에 의해 웰로부터 모든 완충액을 제거한다. 마지막 액체 방울을 종이 타월에 닦아내고 모든 액체가 우물에서 눈에 띄게 제거될 때까지 거꾸로 된 판을 두드립니다.
    알림: ELISA 마이크로플레이트 세척기를 사용하는 경우 이 단계에서 설명한 추가 3회 세척이 필요하지 않을 수 있습니다.
13. Ellman의 시약 200μL을 각 웰에 분주합니다("블랭크" 웰 제외).
14. 새 커버 시트로 플레이트를 덮고 알루미늄 호일로 싸서 빛에 노출되지 않도록 합니다. RT에서 어둠 속에서 1 시간 동안 배양하십시오.
15. 마른 종이 타월로 뒷면을 닦아 분광 광도계 판독을 혼란스럽게 할 수 있는 플레이트 뒷면에 액체가 없는지 확인하십시오.
16. 플레이트의 405nm(노란색)에서의 흡광도를 판독합니다.

6. 데이터 분석

1. 각 "Blank", NSB, 표준물질, 품질 관리 및 샘플에 대한 평균 흡광도를 계산합니다.
2. 표준물질, 품질 관리 및 시료 흡광도 값에서 NSB 평균 흡광도 값을 뺍니다.
3. y축에 흡광도를, x축에 농도를 표시합니다. 4개 매개변수 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 표준 곡선을 구성합니다.
4. 곡선이 구성되면 곡선의 방정식을 사용하여 품질 관리 및 샘플에 대한 보간된 농도를 결정하며, 이는 x축에서 읽을 수 있습니다.
   알림: 표준 곡선은 품질 관리를 위해 계산된 보간 농도가 예상 농도의 25% 이내인 경우에만 검증됩니다(일반적으로 125pg/mL이지만 품질 관리 바이알의 라벨 참조).

결과

프로토콜에는 강조해야 할 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 세린 프로테아제 억제제 인 아프로티닌은 CGRP의 추가 효소 분해를 방지하기 위해 수집 즉시 전혈 샘플에 첨가되어야합니다. 세린 프로테아제는 CGRP 대사에 중요한 역할을하는 것으로 나타 났으며, 이전 연구에서는 인간^21,35에서 CGRP를 정량화하는 데 아 프로 티닌을 사용했습니다. 프로테?...

토론

이 기사에서는 인간 혈장에서 CGRP의 검출 및 정량화를 허용하는 검증된 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 상용 CGRP ELISA 키트가이 분자를 정확하게 정량화하지 못하는 것으로 밝혀진 후에 합성되었습니다. 샘플 준비 프로토콜과 유효한 표준 곡선을 확립한 후, 희석 실험의 스파이크 및 회수율 및 선형성은 회수율이 예상보다 훨씬 낮다는 것을 보여주었다. 상이한 상용 CGRP ELISA 키트를 사...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube	Sorenson Bioscience, Inc.	11510
99% methanol	ThermoFisher Scientific	L13255.0F
15 mL conical centrifuge tube	Falcon	14-959-49B
2 mL round bottom sterile cryovials	CRYO.S	122263
4% acetic acid	ThermoFisher Scientific	035572.K2
6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube	BD	367863
Allegra 64R benchtop centrifuge	Beckman Coulter, Inc.	367586
Aprotinin	VWR	76344-814
CGRP (human) ELISA kit	Bertin Bioreagent	A05481
CGRP stock	Bertin Bioreagent
EIA Buffer	Bertin Bioreagent	A07000
Ellman's Reagent	Bertin Bioreagent	A09000_49+1
Multichannel pipettes	ThermoFisher Scientific	4661180N
Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges	Waters	WAT094226
Orbital Shaker	Bellco	7744-01010
Precision micropipettes	ThermoFisher Scientific	F144055MG
SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader	Molecular Devices	Part Number M2
TBS/Fish Gelatin	Bioworld, from Fischer Scientific	50-199-167
Ultrapure water ELISA Grade	Bertin Bioreagent	A07001
Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator	Eppendorf	22820109
Wash Buffer	Bertin Bioreagent	A17000