זיהוי וכימות של פפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP) בפלזמה אנושית באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים שונה

Summary

נתונים שפורסמו בנוגע לריכוזי פפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP) בפלזמה אנושית אינם עקביים. חוסר עקביות זה עשוי לנבוע מהיעדר מתודולוגיה מתוקננת ומתוקפת לכימות נוירופפטיד זה. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול מאומת של בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA) לטיהור וכימות CGRP בפלזמה אנושית.

Abstract

פפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP) הוא נוירופפטיד וזואקטיבי הממלא תפקיד משוער בפתופיזיולוגיה של מיגרנות, ועשוי להיות מועמד למצב של סמן ביולוגי. CGRP משתחרר מסיבים עצביים עם הפעלתו וגורם לדלקת נוירוגנית סטרילית ולהרחבת כלי דם עורקיים בכלי הדם המקבלים עצבוב טריגמינלי תוסס. נוכחותו של CGRP בכלי הדם ההיקפיים דרבנה חקירות לזהות ולכמת נוירופפטיד זה בפלזמה אנושית באמצעות בדיקות פרוטאומיות, כגון בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA). עם זאת, זמן מחצית החיים של 6.9 דקות והשונות בפרטים הטכניים של פרוטוקולי הבדיקה, שלעתים קרובות אינם מתוארים במלואם, הניבו נתוני CGRP ELISA לא עקביים בספרות. כאן מוצג פרוטוקול ELISA שונה לטיהור וכימות CGRP בפלזמה אנושית. השלבים הפרוצדורליים כוללים איסוף והכנת דגימות, חילוץ באמצעות סורבנט קוטבי כאמצעי לטיהור, צעדים נוספים לחסימת קשירה לא ספציפית, וכימות באמצעות ELISA. יתר על כן, הפרוטוקול אומת עם ספייק והתאוששות ולינאריות של ניסויי דילול. פרוטוקול מאומת זה יכול לשמש באופן תיאורטי לכימות ריכוזי CGRP בפלזמה של אנשים לא רק עם מיגרנה, אלא גם עם מחלות אחרות שבהן CGRP עשוי לשחק תפקיד.

Introduction

פפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP) הוא נוירופפטיד של 37 חומצות אמינו שנמצא בסיבים עצביים עם לוקליזציה פריווסקולרית, כמו גם ברקמות שאינן עצביות. שתי הצורות של CGRP, α ו-β-CGRP, חולקות יותר מ-90% הומולוגיה וחולקות תפקודים פיזיולוגיים; עם זאת, αCGRP נמצא במערכת העצבים המרכזית וההיקפית, בעוד βCGRP נמצא במערכת העצבים האנטרית ^1,2. עם הפעלת nociceptor ואקסוציטוזה תלוית סידן, CGRP משתחרר מנוירונים, וגורם לדלקת נוירוגנית סטרילית המערבת הרחבת כלי דם עורקיים ואקסטרווזיה של חלבון פלזמה 3,4,5,6,7. מכאן, CGRP מופיע בכלי הדם שלאחר הנימים ועשוי להיות סמן ביולוגי למחלות הגורמות להפעלה נוסיספטיבית afferent, כגון מיגרנה 8,9,10,11. יש לציין כי CGRP היה מעורב גם ב- COVID-19 באמצעות תפקידו באנגיוגנזה ובאפנון חיסוני, ועשוי לחזות אבולוציה שלילית של מחלות^12,13. לפיכך, פרוטוקול לכימות מדויק של CGRP בפלזמה אנושית יכול להיות בעל ערך רחב.

תשומת הלב הרבה ביותר הוקדשה אולי לתפקיד של CGRP במיגרנה. בהתבסס על מחקרים פרה-קליניים וקליניים, CGRP הוצג כסמן ביולוגי אפשרי למיגרנה וכיעד לטיפול 3,4,5,6,7,8,9,10. מחקרים מסוימים מצאו עלייה של CGRP בקבוצות עם מיגרנה אפיזודית ביחס למשתתפי הביקורת^10,14,15. נראה כי ההצלחה של מעכבי CGRP בניסויים קליניים לטיפול במיגרנה מרמזת על CGRP מוגבר כגורם סיבתי למיגרנות. עם זאת, לא כל החוקרים אישרו תוצאות אלה^16,17,18,19. יתר על כן, תפקידו של CGRP בסימפטומים שאינם כאבי ראש של מיגרנה טרם הובהר; העבודה הנוכחית הונעה על ידי הרצון להבין את התפקיד של CGRP בסימפטומים שיווי המשקל של מיגרנה.

נתוני בדיקת CGRP לא עקביים בספרות יכולים לנבוע מכמה סיבות. ראשית, זמן מחצית החיים של CGRP בכלי הדם ההיקפיים הוא 6.9 דקות 20, בשל הפעילות של פרוטאזות סרין 21, אנזימים מפרקים אינסולין ומטלופרוטאזות אחרות 22, אנדופפטידאזות ניטרליות 23, ואנזים ממיר אנדותלין-1 ²⁴. שנית, הפרטים הטכניים המשתנים של הבדיקות החיסוניות המשמשות לכימות CGRP אינם מתוארים במלואם במחקרים כאלה. לבסוף, חוסר הסטנדרטיזציה של מתודולוגיית החיסון מסבך את התמונה עוד יותר.

מאמר זה מתאר פרוטוקול שונה של בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) המאפשר טיהור וכימות מדויק של α ו- βCGRP בפלזמה אנושית. הנוגדנים של הערכה אינם צולבים עם עמילין, קלציטונין או חומר P. פרוטוקול זה עבר את ניסויי התיקוף הנדרשים, כגון ספייק ושחזור ולינאריות של דילול, שהנתונים עבורם מוצגים כאן. פרוטוקול CGRP ELISA כזה שעבר אימות לא תואר בעבר במלואו בספרות. פרוטוקול זה יכול לשמש לכימות CGRP בפלזמה אנושית בהקשר של מיגרנה, כמו גם קרדיולוגית^2,25, דרמטולוגית 26, מיילדותית 27, ראומטולוגית^28,29, שרירים ושלד 30,31, אנדוקרינית 32,33, ומחלות ויראליות^12,13 שבהן CGRP היה מעורב.

Protocol

פרוטוקול זה פותח באמצעות דגימות פלזמה אנושיות מאנשים מוסכמים באישור מועצת הביקורת המוסדית של ג'ונס הופקינס (NA_00092491).

1. איסוף דוגמאות והכנתן

1. לאסוף 5 מ"ל של דם שלם מן הווריד antecubital באמצעות שיטות venipuncture סטנדרטיות³⁴ לתוך 6 מ"ל vacutainer ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) צינור איסוף.
2. הוסף 0.5 מ"ל של מעכב פרוטאז סרין תחרותי (10,000 KIU/mL) לצינור לאחר האיסוף כדי לחסום את הליזה של פפטיד המטרה. הפוך את הצינור 10 פעמים כדי לאפשר לאפרוטנין להתערבב כראוי עם הדם. לאחר מכן, אחסנו את הצינורות על קרח עד לשלב הבא.
3. צנטריפוגה את הצינור ב 604 x גרם במשך 4 דקות ב 4 ° C בתוך 60 דקות של איסוף הדם.
4. מורידים את חלק הפלזמה עם פיפטה ומעבירים ל 2 מ"ל קריובלים סטריליים עגולים למטה.
5. מיד לאחסן את cryovials ב -80 ° C למשך עד שבועיים.

2. מיצוי דגימות הפלזמה

1. מניחים מחסנית חילוץ בתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל כאשר הרכסים החיצוניים של המחסנית נתמכים על ידי הרכסים החיצוניים של הצינור.
2. הפעל את המחסנית על ידי העברת 5 מ"ל תחילה של 100% מתנול ולאחר מכן 10 מ"ל של מים טהורים במיוחד דרך המחסנית.
   1. כאשר נוזל מועבר דרך המחסנית באמצעות זרימה מונעת כוח הכבידה, הוא ייאסף בצינור.
   2. יש לזרוק את עודפי הנוזל כשהם מצטברים כדי להבטיח שהנוזל לא יבלע את המחסנית.
   3. ודא שהמחסנית אינה מתייבשת במהלך הניסוי.
3. לדלל 250 μL של פלזמה עם 750 μL של 4% חומצה אצטית.
4. העבר את 1 מ"ל של פלזמה ותמיסת חומצה אצטית באיטיות דרך המחסנית.
   הערה: שלב זה אמור להימשך כ-30 שניות באמצעות זרימה מונעת כבידה עבור כל מיליליטר שעובר.
5. שטוף את המחסנית עם 10 מ"ל של 4% חומצה אצטית. כפי שנעשה בעבר, לזרוק את הנוזל העודף כפי שהוא מצטבר כדי להבטיח כי הנוזל לא לבלוע את המחסנית.
6. לאחר שהטיפה האחרונה של חומצה אצטית משתחררת מהמחסנית, הסר את המחסנית מהצינור והנח אותה בצינור צנטריפוגה חרוטי חדש של 15 מ"ל.
7. הכינו תמיסה ביחס 10:1 של 100% מתנול ו-4% חומצה אצטית על ידי ערבוב של 2.7 מ"ל של 4% חומצה אצטית ו-0.3 מ"ל של 100% מתנול. השתמש באפשרות זו כדי להפתיע את ה- CGRP על-ידי העברת פתרון זה דרך המחסנית 1 מ"ל בכל פעם. הפסקה של 25 דקות בין כל מיליליטר של תמיסה עבר. אל תזרקו את ה-eluent.
8. הצינור יכיל 3 מ"ל של הנוזל המדולל 25 דקות לאחר שהמיליליטר האחרון של תמיסת המתנול והחומצה האצטית עבר. מניחים כל 1 מ"ל של המוציא לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל.
   הערה: פעולה זו אמורה להניב שלושה צינורות מיקרו-צנטריפוגות מכל מחסנית.
9. מקם כל צינור בצנטריפוגה קטנה למשך שנייה אחת כדי להבטיח שכל הנוזל נמצא בתחתית כל צינור.
10. יבש את כל הדגימות על ידי צנטריפוגת ואקום ב 4 ° C (מוגדר לפעולת רכז, עבור תמיסות מימיות, ב 1,400 סל"ד; כוח G משתנה בהתאם למיקום של צינורות ולכן נע בין 130-250 x גרם).
    הערה: הזמן שייקח לצנטריפוגת הוואקום לייבש את הדגימות יהיה תלוי בסוג צינור המיקרוצנטריפוגה שבו נעשה שימוש.
11. מיד לפני שתמשיך להליך הבדיקה (שלב 4.1), צור מחדש את הדגימה שיובשה בעבר עם מאגר אנזים חיסוני (EIA) (ראה טבלת חומרים) מופשר לטמפרטורת החדר (RT) או 20 ° C.
    הערה: נפח מאגר EIA המשמש לבנייה מחדש של הדגימה המיובשת צריך להיות שווה לנפח הדגימה המקורי, או 250 μL.

3. הכנת צלחת ELISA - חסימה להגבלת קשירה לא ספציפית

1. הוסיפו 250 μL של חיץ חוסם מלח חוצץ טריס (TBS)/ג'לטין דגים לכל באר בצלחת.
2. מניחים יריעת כיסוי מעל הצלחת ודגרים במשך שעתיים ב-RT.
3. הסר את דף השער ורוקן את הצלחת על ידי היפוך או שאיפה באמצעות פיפטה רב ערוצית. לאחר מכן, כתם את הצלחת על מגבת נייר כדי להשליך כל זכר של נוזל.
4. יבש את הצלחת על ידי השארת הצלחת במכסה מנוע זרימה למינרית למשך 10 דקות.
5. לאחר שהצלחת יבשה באופן ניכר, הניחו אותה בשקיק רדיד אלומיניום אטום עם שקיק מייבש ג'ל סיליקה ואחסנו את השקית בטמפרטורה של -20°C למשך 24 שעות.
   הערה: יש להשתמש בצלחות תוך 4 שבועות מרגע הדגירה.

4. לפני הליך הבדיקה

1. הכן ריאגנטים (מאגר EIA, תקן CGRP, בקרת איכות CGRP, עוקב CGRP, מאגר שטיפה) בהתאם להוראות הערכה. הכינו את המגיב של אלמן רק לאחר סיום תקופת הדגירה של 16-20 שעות.
2. הפשיר את כל הדגימות והריאגנטים ל- RT לפני ביצוע שאר הפרוטוקול.

5. הליך הבדיקה

1. יש לשטוף כל באר בצלחת החסומה חמש פעמים באמצעות חיץ כביסה שסופק על ידי הערכה (300 מיקרוליטר/באר). עבור כל שטיפה, יש להשהות 30 שניות לאחר הנחת חיץ השטיפה בבארות, ולאחר מכן לזרוק את הנוזל או לשאוף באמצעות פיפטה רב ערוצית.
2. לאחר השטיפה הסופית, הסר את כל החיץ מהבארות על ידי היפוך (היפוך הצלחת כדי להוציא את הנוזל בתוך בארות) או שאיפה באמצעות פיפטה רב ערוצית. כתם את הטיפות האחרונות על מגבת נייר והקש על הצלחת ההפוכה עד שכל הנוזלים יוסרו באופן גלוי מהבארות.
3. הקצו לפחות שתי בארות ללא ריאגנטים או חיץ כדי להיקרא בארות "ריקות". לאחר מכן, הקצו לפחות שתי בארות אחרות לכריכה לא ספציפית (NSB).
4. יש לפזר 100 μL של חיץ EIA לכל באר NSB.
5. יש להוציא 100 μL של תקני CGRP בשכפול לבארות מתאימות.
6. יש להוציא 100 μL של דגימות (שהורכבו מחדש במאגר EIA) ובקרת איכות בשכפול לבארות מתאימות.
7. יש להוציא 100 מיקרוליטר של נותב CGRP (נוגדן אנטי-CGRP המחובר לאצטילכולין אסטראז) לכל באר המכילה NSB, תקני CGRP, דגימות ובקרת איכות. אל תחלק נותב לבארות "ריק".
8. מכסים את הצלחת באמצעות יריעת כיסוי שקופה, אוטמים כל באר כך שהדגימות והריאגנטים בכל באר לא יתאדו באופן משמעותי. לדגור על הצלחת במשך 16-20 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
9. לאחר השלמת הדגירה, יש להרכיב מחדש את מגיב אלמן בהתאם להוראות הערכה.
10. הפוך את הצלחת כדי להסיר את כל הנוזלים. יש לשטוף כל באר (כמתואר לעיל) שלוש פעמים עם 300 μL של חיץ כביסה.
11. לאחר השטיפה השלישית מוציאים את הנוזל מהצלחות, מניחים את הצלחת על צלחת שייקר ומנערים במהירות 120 סל"ד למשך 2 דקות.
12. שוטפים את הצלחת שלוש פעמים נוספות. לאחר השטיפה הסופית, הסר את כל החיץ מהבארות על ידי היפוך או שאיפה באמצעות פיפטה רב ערוצית. כתם את טיפות הנוזל האחרונות על מגבת נייר והקש על הצלחת ההפוכה עד שכל הנוזל יוסר באופן גלוי מהבארות.
    הערה: ייתכן שלא יהיה צורך בשלוש הכביסות הנוספות המתוארות בשלב זה אם משתמשים במכונת כביסה מיקרו-צלחות של ELISA.
13. יש לפזר 200 מיקרוליטר של מגיב אלמן לכל באר (לא כולל בארות "ריק").
14. כסו את הצלחת ביריעת כיסוי חדשה ועטפו אותה ברדיד אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור. לדגור בחושך ב RT במשך 1 שעה.
15. ודא שאין נוזל בצד האחורי של הצלחת שעלול לבלבל את קריאת הספקטרופוטומטר על ידי ניגוב החלק האחורי במגבת נייר יבשה.
16. קרא את הלוח לספיגה של 405 ננומטר (צבע צהוב).

6. ניתוח נתונים

1. חשב את הספיגה הממוצעת עבור כל "ריק", NSB, תקן, בקרת איכות, ואת הדגימות.
2. הפחת את ערכי הספיגה הממוצעת של NSB מערכי התקן, בקרת האיכות וספיגת הדגימה.
3. ספיגת העלילה על ציר ה-y והריכוז על ציר ה-x. בניית עקומה סטנדרטית באמצעות מודל רגרסיה לוגיסטית בן ארבעה פרמטרים.
4. לאחר בניית העקומה, השתמש במשוואת העקומה כדי לקבוע את ריכוזי האינטרפולציה עבור בקרת איכות ודגימות, שניתן לקרוא על ציר x.
   הערה: העקומה הסטנדרטית מאומתת רק אם ריכוז האינטרפולציה המחושב עבור בקרת האיכות הוא בטווח של 25% מהריכוז הצפוי (בדרך כלל 125 pg/mL, אך ראה את התווית של בקבוקון בקרת האיכות).

תוצאות

ישנם מספר שלבים מרכזיים בפרוטוקול שיש להדגיש. ראשית, יש להוסיף אפרוטינין, מעכב פרוטאז סרין, לדגימות דם שלמות מיד עם איסופו כדי למנוע פירוק אנזימטי נוסף של CGRP. הודגם כי פרוטאזות סרין ממלאות תפקיד במטבוליזם של CGRP, ומחקר קודם השתמש גם באפרוטינין לכימות CGRP בבני אדם^21,35

Discussion

מאמר זה מתאר פרוטוקול מאומת המאפשר זיהוי וכימות של CGRP בפלזמה אנושית. פרוטוקול זה סונתז לאחר שנמצא כי ערכות CGRP ELISA מסחריות אינן מכמתות במדויק מולקולה זו. לאחר קביעת פרוטוקול הכנת דגימה ועקומה סטנדרטית תקפה, ספייק והתאוששות ולינאריות של ניסויי דילול הראו כי אחוז המחלימים היה נמוך בהרבה מהצפ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube	Sorenson Bioscience, Inc.	11510
99% methanol	ThermoFisher Scientific	L13255.0F
15 mL conical centrifuge tube	Falcon	14-959-49B
2 mL round bottom sterile cryovials	CRYO.S	122263
4% acetic acid	ThermoFisher Scientific	035572.K2
6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube	BD	367863
Allegra 64R benchtop centrifuge	Beckman Coulter, Inc.	367586
Aprotinin	VWR	76344-814
CGRP (human) ELISA kit	Bertin Bioreagent	A05481
CGRP stock	Bertin Bioreagent
EIA Buffer	Bertin Bioreagent	A07000
Ellman's Reagent	Bertin Bioreagent	A09000_49+1
Multichannel pipettes	ThermoFisher Scientific	4661180N
Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges	Waters	WAT094226
Orbital Shaker	Bellco	7744-01010
Precision micropipettes	ThermoFisher Scientific	F144055MG
SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader	Molecular Devices	Part Number M2
TBS/Fish Gelatin	Bioworld, from Fischer Scientific	50-199-167
Ultrapure water ELISA Grade	Bertin Bioreagent	A07001
Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator	Eppendorf	22820109
Wash Buffer	Bertin Bioreagent	A17000