Detecção e quantificação de peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) em plasma humano usando um ensaio imunoenzimático modificado

Resumo

Os dados publicados relativos às concentrações de peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) no plasma humano são inconsistentes. Essas inconsistências podem ser devidas à falta de uma metodologia padronizada e validada para quantificar esse neuropeptídeo. Aqui, descrevemos um protocolo validado de ensaio imunoenzimático (ELISA) para purificar e quantificar CGRP em plasma humano.

Resumo

O peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) é um neuropeptídeo vasoativo que desempenha um papel putativo na fisiopatologia das enxaquecas e pode ser um candidato ao status de biomarcador. A CGRP é liberada das fibras neuronais após a ativação e induz inflamação neurogênica estéril e vasodilatação arterial na vasculatura que recebe inervação eferente do trigêmeo. A presença de CGRP na vasculatura periférica tem estimulado investigações para detectar e quantificar esse neuropeptídeo no plasma humano usando ensaios proteômicos, como o ensaio imunoenzimático (ELISA). No entanto, sua meia-vida de 6,9 min e a variabilidade nos detalhes técnicos dos protocolos de ensaio, que muitas vezes não são totalmente descritos, têm gerado dados inconsistentes de ELISA CGRP na literatura. Aqui, um protocolo ELISA modificado para purificação e quantificação de CGRP em plasma humano é apresentado. As etapas processuais envolvem coleta e preparação da amostra, extração usando um sorvente polar como meio de purificação, etapas adicionais para bloquear a ligação não específica e quantificação via ELISA. Além disso, o protocolo foi validado com experimentos de spike e recuperação e linearidade de diluição. Este protocolo validado pode, teoricamente, ser usado para quantificar as concentrações de CGRP no plasma de indivíduos não apenas com enxaqueca, mas também com outras doenças nas quais a CGRP pode desempenhar um papel.

Introdução

O peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) é um neuropeptídeo de 37 aminoácidos que está presente em fibras neuronais com localização perivascular, bem como em tecidos não neuronais. As duas formas de CGRP, α- e β-CGRP, compartilham mais de 90% de homologia e compartilham funções fisiológicas; entretanto, o αCGRP é encontrado no sistema nervoso central e periférico, enquanto o βCGRP é encontrado no sistema nervoso entérico ^1,2. Após a ativação do nociceptor e exocitose cálcio-dependente, a CGRP é liberada dos neurônios, induzindo inflamação neurogênica estéril envolvendo vasodilatação arterial e extravasamento de proteínas plasmáticas 3,4,5,6,7. A partir daí, a CGRP surge nos vasos pós-capilares e pode ser um biomarcador para doenças que causam ativação nociceptiva aferente, como a migrânea8,9,10,11. De notar, CGRP igualmente tem sido implicado em COVID-19 através de seu papel na angiogénese e modulação imune, e pode prever a evolução desfavorável da doença^12,13. Assim, um protocolo para a quantificação precisa de CGRP em plasma humano poderia ter um valor amplo.

A maior atenção talvez tenha sido dada ao papel da CGRP na enxaqueca. Com base em estudos pré-clínicos e clínicos, a CGRP tem sido apontada como um possível biomarcador para enxaqueca e como alvo de tratamento 3,4,5,6,7,8,9,10. Alguns estudos encontraram elevação da CGRP em coortes com migrânea episódica em relação aos participantes controles^10,14,15. O sucesso dos inibidores de CGRP em ensaios clínicos para o tratamento da enxaqueca parece implicar CGRP elevado como um fator causal para enxaqueca. Entretanto, nem todos os pesquisadores corroboraram esses resultados^16,17,18,19. Além disso, o papel da CGRP nos sintomas não cefálicos da enxaqueca ainda não foi elucidado; o presente trabalho foi motivado pelo desejo de compreender o papel da CGRP nos sintomas vestibulares da migrânea.

Dados inconsistentes de imunoensaio de CGRP na literatura podem ser devidos a várias razões. Em primeiro lugar, a meia-vida da CGRP na vasculatura periférica é de 6,9 min 20, devido à atividade de serinoproteases 21, enzimas degradadoras de insulina e outras metaloproteases 22, endopeptidases neutras 23 e enzima conversora de endotelina-1 ²⁴. Em segundo lugar, os detalhes técnicos variáveis dos imunoensaios usados para quantificar a CGRP não são totalmente descritos nesses estudos. Por fim, a falta de padronização da metodologia de imunoensaio complica ainda mais o quadro.

Este artigo descreve um protocolo de ensaio imunoenzimático modificado (ELISA) que permite a purificação e quantificação precisa de α- e βCGRP em plasma humano. Os anticorpos do kit não são reativos cruzados com amilina, calcitonina ou substância P. Esse protocolo passou pelos experimentos de validação necessários, como spike e recuperação e linearidade de diluição, cujos dados são aqui apresentados. Este protocolo de ELISA CGRP que passou por validação não foi descrito anteriormente na literatura. Esse protocolo pode ser utilizado para quantificar a CGRP no plasma humano no contexto da migrânea, bem como das doenças cardiológicas2,25, dermatológicas26, obstétricas27, reumatológicas28,29, musculoesqueléticas30,31, endócrinas32,33 e virais12,13, nas quais a CGRP tem sido implicada.

Protocolo

Este protocolo foi desenvolvido utilizando amostras de plasma humano de indivíduos consentidos, com aprovação do Johns Hopkins Institutional Review Board (NA_00092491).

1. Coleta e preparo das amostras

1. Coletar 5 mL de sangue total da veia antecubital por métodos padrão de punção venosa³⁴ em um tubo de coleta de 6 mL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) vacutainer.
2. Adicionar 0,5 mL de inibidor competitivo de serinoprotease de aprotinina (10.000 KUI/mL) ao tubo após a coleta para bloquear a lise do peptídeo alvo. Inverter o tubo 10 vezes para permitir que a aprotinina se misture adequadamente com o sangue. Depois, guarde os tubos no gelo até a próxima etapa.
3. Centrifugar o tubo a 604 x g durante 4 minutos a 4 °C no prazo de 60 minutos após a colheita de sangue.
4. Retire a fração de plasma com uma pipeta e transfira para crióvios estéreis de fundo redondo de 2 mL.
5. Conservar imediatamente os crióscos a -80 °C até 2 semanas.

2. Extração das amostras de plasma

1. Coloque um cartucho de extracção dentro de um tubo de centrífuga cónica de 15 ml com as cristas exteriores do cartucho apoiadas pelas cristas exteriores do tubo.
2. Ative o cartucho passando primeiro 5 mL de metanol a 100% e, em seguida, 10 mL de água ultrapura através do cartucho.
   1. À medida que o fluido é passado através do cartucho através do fluxo impulsionado pela gravidade, ele se acumulará no tubo.
   2. Jogue fora o excesso de líquido à medida que ele se acumula para garantir que o fluido não engula o cartucho.
   3. Certifique-se de que o cartucho não seque durante o curso do experimento.
3. Diluir 250 μL de plasma com 750 μL de ácido acético a 4%.
4. Passar lentamente o 1 ml de solução de plasma e ácido acético através do cartucho.
   NOTA: Esta etapa deve levar aproximadamente 30 s via fluxo acionado por gravidade para cada mililitro passado.
5. Lave o cartucho com 10 mL de ácido acético a 4%. Como feito anteriormente, jogue fora o excesso de líquido à medida que ele se acumula para garantir que o fluido não engula o cartucho.
6. Depois que a última gota de ácido acético for liberada do cartucho, retire o cartucho do tubo e coloque-o em um novo tubo de centrífuga cônica de 15 mL.
7. Preparar uma solução 10:1 de metanol a 100% e ácido acético a 4%, misturando 2,7 ml de ácido acético a 4% e 0,3 ml de metanol a 100%. Use-o para eluir o CGRP passando esta solução através do cartucho 1 mL de cada vez. Pausa por 25 min entre cada mililitro de solução passado. NÃO jogue fora o eluente.
8. O tubo conterá 3 mL do líquido eluído 25 minutos após a passagem do último mililitro da solução de metanol e ácido acético. Colocar cada 1 ml do eluente num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
   NOTA: Isso deve render três tubos de microcentrífuga de cada cartucho.
9. Coloque cada tubo em uma mini centrífuga por 1 s para garantir que todo o eluente esteja no fundo de cada tubo.
10. Secar todas as amostras por centrifugação a vácuo a 4 °C (regulado para função concentradora, para soluções aquosas, a 1.400 rpm; a força g varia de acordo com a posição dos tubos e, portanto, varia de 130-250 x g).
    NOTA: O tempo necessário para a centrífuga a vácuo secar as amostras dependerá do tipo de tubo de microcentrífuga utilizado.
11. Imediatamente antes de proceder ao procedimento de ensaio (passo 4.1), reconstituir a amostra previamente seca com tampão de ensaio imunoenzimático (EIA) (ver Tabela de Materiais) descongelada à temperatura ambiente (RT) ou a 20 °C.
    NOTA: O volume de tampão EIA utilizado para reconstituir a amostra seca deve ser igual ao volume da amostra original ou 250 μL.

3. Preparação da placa ELISA - bloqueio para limitar a ligação inespecífica

1. Adicionar 250 μL de solução salina tris-tamponada (TBS)/tampão de bloqueio de gelatina de peixe a cada poço no prato.
2. Coloque uma folha de cobertura sobre a placa e incube por 2 h no TR.
3. Retire a folha de cobertura e esvazie a placa por inversão ou aspiração usando uma pipeta multicanal. Em seguida, coloque o prato em um papel toalha para descartar qualquer vestígio de líquido.
4. Seque a placa deixando a placa em uma capela de fluxo laminar por 10 min.
5. Depois que a placa estiver visivelmente seca, coloque-a em uma bolsa de papel alumínio selada com uma saqueta dessecante de sílica gel e guarde a bolsa a -20 °C por 24 horas.
   NOTA: As placas devem ser usadas dentro de 4 semanas após a incubação da placa.

4. Antes do procedimento de ensaio

1. Preparar reagentes (tampão EIA, padrão CGRP, controle de qualidade CGRP, traçador CGRP, tampão de lavagem) de acordo com as instruções do kit. Prepare o reagente de Ellman somente após o término do período de incubação de 16-20 h.
2. Descongelar todas as amostras e reagentes para RT antes de realizar o restante do protocolo.

5. Procedimento de ensaio

1. Enxaguar cada poço na placa bloqueada cinco vezes com um tampão de lavagem fornecido pelo kit (300 μL/poço). Para cada enxágue, pause 30 s depois de colocar o tampão de lavagem nos poços e, em seguida, jogue fora o líquido ou aspirar usando uma pipeta multicanal.
2. Após o enxágue final, remova todo o tampão dos poços por inversão (invertendo a placa para expelir o líquido dentro dos poços) ou aspiração usando uma pipeta multicanal. Coloque as últimas gotas em um papel toalha e bata na placa invertida até que todo o líquido seja visivelmente removido dos poços.
3. Separe pelo menos dois poços sem reagentes ou tampão para serem conhecidos como poços "em branco". Em seguida, reserve pelo menos outros dois poços para ligação não específica (NSB).
4. Distribuir 100 μL de tampão EIA em cada poço NSB.
5. Distribuir 100 μL dos padrões CGRP em duplicata em poços apropriados.
6. Dispensar 100 μL de amostras (reconstituídas em tampão EIA) e controle de qualidade em duplicata em poços apropriados.
7. Dispensar 100 μL do traçador CGRP (anticorpo anti-CGRP ligado à acetilcolinesterase) para cada poço contendo NSB, padrões CGRP, amostras e controle de qualidade. Não dispense traçador para os poços "em branco".
8. Cubra a placa com uma folha de cobertura transparente, selando cada poço de modo que as amostras e reagentes em cada poço não evaporem significativamente. Incubar a placa durante 16-20 h a 4 °C.
9. Após a conclusão da incubação, reconstitua o reagente de Ellman de acordo com as instruções do kit.
10. Inverta a placa para retirar todo o líquido. Enxaguar cada poço (conforme descrito acima) três vezes com 300 μL de tampão de lavagem.
11. Após o terceiro enxágue, retire o líquido das placas, coloque a placa em uma placa agitadora e agite a 120 rpm por 2 min.
12. Lave o prato mais três vezes. Após o enxágue final, remova todo o tampão dos poços por inversão ou aspiração usando uma pipeta multicanal. Coloque as últimas gotas de líquido em um papel toalha e bata na placa invertida até que todo o líquido seja visivelmente removido dos poços.
    NOTA: As três lavagens adicionais descritas nesta etapa podem não ser necessárias se estiver usando uma lavadora de microplacas ELISA.
13. Distribuir 200 μL do reagente de Ellman em cada poço (não incluindo os poços "Blank").
14. Cubra a placa com uma nova folha de cobertura e envolva-a em papel alumínio para evitar qualquer exposição à luz. Incubar no escuro em TR por 1 h.
15. Certifique-se de que não há líquido na parte de trás da placa que possa confundir a leitura do espectrofotômetro limpando a parte de trás com uma toalha de papel seca.
16. Leia a placa para absorbância a 405 nm (cor amarela).

6. Análise dos dados

1. Calcule a absorbância média para cada "Blank", NSB, padrão, controle de qualidade e as amostras.
2. Subtrair os valores médios de absorbância do NSB dos valores padrão, de controle de qualidade e de absorbância da amostra.
3. Plotar a absorbância no eixo y e a concentração no eixo x. Construa uma curva padrão usando um modelo de regressão logística de quatro parâmetros.
4. Uma vez que a curva é construída, use a equação da curva para determinar as concentrações interpoladas para controle de qualidade e amostras, que podem ser lidas no eixo x.
   NOTA: A curva padrão só é validada se a concentração interpolada calculada para o controlo de qualidade estiver dentro de 25% da concentração esperada (normalmente 125 pg/ml, mas consulte o rótulo do frasco para injetáveis de controlo de qualidade).

Resultados

Existem várias etapas importantes no protocolo que devem ser destacadas. Em primeiro lugar, a aprotinina, um inibidor da serina protease, deve ser adicionada às amostras de sangue total imediatamente após a coleta para evitar maior degradação enzimática da CGRP. Demonstrou-se que as serinoproteases desempenham um papel no metabolismo do CGRP, e um estudo anterior também utilizou a aprotinina na quantificação do CGRP em humanos^21,35. Se inibidores de prot...

Discussão

Este artigo descreve um protocolo validado que permite a detecção e quantificação de CGRP em plasma humano. Este protocolo foi sintetizado depois que kits comerciais de ELISA CGRP não quantificaram com precisão esta molécula. Após o estabelecimento de um protocolo de preparo da amostra e de uma curva padrão válida, os experimentos de spike e recuperação e linearidade da diluição mostraram que a porcentagem de recuperações foi muito menor do que o esperado. Resultados semelhantes foram encontrados com outr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube	Sorenson Bioscience, Inc.	11510
99% methanol	ThermoFisher Scientific	L13255.0F
15 mL conical centrifuge tube	Falcon	14-959-49B
2 mL round bottom sterile cryovials	CRYO.S	122263
4% acetic acid	ThermoFisher Scientific	035572.K2
6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube	BD	367863
Allegra 64R benchtop centrifuge	Beckman Coulter, Inc.	367586
Aprotinin	VWR	76344-814
CGRP (human) ELISA kit	Bertin Bioreagent	A05481
CGRP stock	Bertin Bioreagent
EIA Buffer	Bertin Bioreagent	A07000
Ellman's Reagent	Bertin Bioreagent	A09000_49+1
Multichannel pipettes	ThermoFisher Scientific	4661180N
Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges	Waters	WAT094226
Orbital Shaker	Bellco	7744-01010
Precision micropipettes	ThermoFisher Scientific	F144055MG
SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader	Molecular Devices	Part Number M2
TBS/Fish Gelatin	Bioworld, from Fischer Scientific	50-199-167
Ultrapure water ELISA Grade	Bertin Bioreagent	A07001
Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator	Eppendorf	22820109
Wash Buffer	Bertin Bioreagent	A17000