Détection et quantification d’un peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP) dans le plasma humain à l’aide d’un dosage immuno-enzymatique modifié

Résumé

Les données publiées concernant les concentrations de peptides liés au gène de la calcitonine (CGRP) dans le plasma humain sont incohérentes. Ces incohérences peuvent être dues à l’absence d’une méthodologie standardisée et validée pour quantifier ce neuropeptide. Ici, nous décrivons un protocole validé de dosage immuno-enzymatique (ELISA) pour purifier et quantifier le CGRP dans le plasma humain.

Résumé

Le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP) est un neuropeptide vasoactif qui joue un rôle putatif dans la physiopathologie des migraines et peut être candidat au statut de biomarqueur. Le CGRP est libéré des fibres neuronales lors de l’activation et induit une inflammation neurogène stérile et une vasodilatation artérielle dans le système vasculaire qui reçoit l’innervation efférente du trijumeau. La présence de CGRP dans le système vasculaire périphérique a incité les recherches pour détecter et quantifier ce neuropeptide dans le plasma humain à l’aide de tests protéomiques, tels que le test immuno-enzymatique (ELISA). Cependant, sa demi-vie de 6,9 minutes et la variabilité des détails techniques des protocoles d’essai, qui ne sont souvent pas entièrement décrits, ont donné des données ELISA CGRP incohérentes dans la littérature. Ici, un protocole ELISA modifié pour la purification et la quantification du CGRP dans le plasma humain est présenté. Les étapes de la procédure comprennent la collecte et la préparation des échantillons, l’extraction à l’aide d’un sorbant polaire comme moyen de purification, des étapes supplémentaires pour bloquer la liaison non spécifique et la quantification via ELISA. De plus, le protocole a été validé avec des pics et des expériences de récupération et de linéarité des expériences de dilution. Ce protocole validé peut théoriquement être utilisé pour quantifier les concentrations de CGRP dans le plasma des personnes souffrant non seulement de migraine, mais aussi d’autres maladies dans lesquelles le CGRP peut jouer un rôle.

Introduction

Le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP) est un neuropeptide de 37 acides aminés présent dans les fibres neuronales avec localisation périvasculaire ainsi que dans les tissus non neuronaux. Les deux formes de CGRP, α- et β-CGRP, partagent plus de 90% d’homologie et partagent des fonctions physiologiques; cependant, l’αCGRP se trouve dans le système nerveux central et périphérique, tandis que le βCGRP se trouve dans le système nerveux entérique ^1,2. Lors de l’activation des nocicepteurs et de l’exocytose dépendante du calcium, le CGRP est libéré par les neurones, induisant une inflammation neurogène stérile impliquant une vasodilatation artérielle et une extravasation des protéines plasmatiques 3,4,5,6,7. À partir de là, le CGRP apparaît dans les vaisseaux postcapillaires et peut être un biomarqueur de maladies qui provoquent une activation nociceptive afférente, telles que la migraine 8,9,10,11. Il convient de noter que le CGRP a également été impliqué dans la COVID-19 en raison de son rôle dans l’angiogenèse et la modulation immunitaire, et peut prédire une évolution défavorable de la maladie^12,13. Ainsi, un protocole pour la quantification précise du CGRP dans le plasma humain pourrait avoir une grande valeur.

La plus grande attention a peut-être été accordée au rôle du CGRP dans la migraine. Sur la base d’études précliniques et cliniques, le CGRP a été proposé comme biomarqueur possible de la migraine et comme cible pour le traitement 3,4,5,6,7,8,9,10. Certaines études ont révélé une élévation du CGRP dans les cohortes souffrant de migraine épisodique par rapport aux participants témoins^10,14,15. Le succès des inhibiteurs du CGRP dans les essais cliniques pour le traitement de la migraine semble impliquer un CGRP élevé comme facteur causal des migraines. Cependant, tous les chercheurs n’ont pas corroboré ces résultats^16,17,18,19. De plus, le rôle du CGRP dans les symptômes de migraine autres que les maux de tête n’a pas encore été élucidé; les travaux actuels ont été motivés par le désir de comprendre le rôle du CGRP dans les symptômes vestibulaires de la migraine.

L’incohérence des données des essais immunologiques du CGRP dans la littérature pourrait être due à plusieurs raisons. Premièrement, la demi-vie du CGRP dans le système vasculaire périphérique est de 6,9 min 20, en raison de l’activité des sérines protéases 21, des enzymes dégradant l’insuline et autres métalloprotéases 22, des endopeptidases neutres 23 et de l’enzyme de conversion de l’endothéline-1 ²⁴. Deuxièmement, les détails techniques variables des immunoessais utilisés pour quantifier le CGRP ne sont pas entièrement décrits dans ces études. Enfin, le manque de standardisation de la méthodologie des immunoessais complique encore plus le tableau.

Cet article décrit un protocole ELISA (Modified Enzyme-linked immunosorbent assay) qui permet la purification et la quantification précise des α et βCGRP dans le plasma humain. Les anticorps du kit ne sont pas réactifs avec l’amyline, la calcitonine ou la substance P. Ce protocole a subi les expériences de validation nécessaires, telles que le pic et la récupération et la linéarité de la dilution, dont les données sont présentées ici. Un tel protocole ELISA du CGRP qui a fait l’objet d’une validation n’a pas encore été entièrement décrit dans la littérature. Ce protocole peut être utilisé pour quantifier le CGRP dans le plasma humain dans le contexte de la migraine ainsi que cardiologique^2,25, dermatologique²⁶, obstétrical 27, rhumatologique^28,29, musculo-squelettique 30,31, endocrinien 32,33, et les maladies virales ^12,13 dans lesquelles le CGRP a été impliqué.

Protocole

Ce protocole a été élaboré à partir d’échantillons de plasma humain provenant de personnes consentantes avec l’approbation du Johns Hopkins Institutional Review Board (NA_00092491).

1. Prélèvement et préparation des échantillons

1. Prélever 5 mL de sang total dans la veine antécubital au moyen de méthodes de ponction veineuse^{standard 34} dans un tube de collecte d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) vacutainer de 6 mL.
2. Ajouter 0,5 mL d’inhibiteur de la sérine protéase compétitive d’aprotinine (10 000 KIU/mL) dans le tube après la collecte pour bloquer la lyse du peptide cible. Retourner le tube 10 fois pour permettre à l’aprotinine de se mélanger adéquatement avec le sang. Ensuite, rangez les tubes sur de la glace jusqu’à l’étape suivante.
3. Centrifuger le tube à 604 x g pendant 4 min à 4 °C dans les 60 minutes suivant le prélèvement sanguin.
4. Prélever la fraction plasmatique à l’aide d’une pipette et transférer dans des cryoflacons stériles à fond rond de 2 mL.
5. Conservez immédiatement les cryoflacons à -80 °C jusqu’à 2 semaines.

2. Extraction des échantillons de plasma

1. Placer une cartouche d’extraction à l’intérieur d’un tube centrifuge conique de 15 mL avec les arêtes extérieures de la cartouche soutenues par les crêtes extérieures du tube.
2. Activez la cartouche en faisant d’abord passer 5 mL de méthanol à 100 %, puis 10 mL d’eau ultrapure à travers la cartouche.
   1. Au fur et à mesure que le fluide passe à travers la cartouche par un flux gravitaire, il s’accumule dans le tube.
   2. Jetez l’excès de liquide au fur et à mesure qu’il s’accumule pour vous assurer que le liquide n’engloutit pas la cartouche.
   3. Assurez-vous que la cartouche ne sèche pas au cours de l’expérience.
3. Diluer 250 μL de plasma avec 750 μL d’acide acétique à 4%.
4. Passez lentement la solution de plasma et d’acide acétique de 1 mL dans la cartouche.
   REMARQUE: Cette étape devrait prendre environ 30 s via un flux entraîné par gravité pour chaque millilitre passé.
5. Lavez la cartouche avec 10 ml d’acide acétique à 4 %. Comme indiqué précédemment, jetez l’excès de liquide au fur et à mesure qu’il s’accumule pour vous assurer que le liquide n’engloutit pas la cartouche.
6. Une fois que la dernière goutte d’acide acétique est libérée de la cartouche, retirez la cartouche du tube et placez-la dans un nouveau tube à centrifuger conique de 15 mL.
7. Préparer une solution 10:1 de méthanol à 100 % et d’acide acétique à 4 % en mélangeant 2,7 mL d’acide acétique à 4 % et 0,3 mL de méthanol à 100 %. Utilisez cette solution pour éluer le CGRP en faisant passer cette solution dans la cartouche 1 mL à la fois. Faites une pause de 25 minutes entre chaque millilitre de solution passé. Ne jetez PAS l’éluant.
8. Le tube contiendra 3 mL du fluide élué 25 min après le passage du dernier millilitre de la solution de méthanol et d’acide acétique. Placer chaque 1 mL d’éluant dans un tube microcentrifuge de 1,7 mL.
   REMARQUE: Cela devrait donner trois tubes de microcentrifugation de chaque cartouche.
9. Placez chaque tube dans une mini-centrifugeuse pendant 1 s pour vous assurer que tout l’éluant est au fond de chaque tube.
10. Sécher tous les échantillons par centrifugation sous vide à 4 °C (réglé sur la fonction concentrateur, pour les solutions aqueuses, à 1 400 tr/min ; la force g varie en fonction de la position des tubes et varie donc de 130 à 250 x g).
    REMARQUE : Le temps nécessaire à la centrifugeuse sous vide pour sécher les échantillons dépendra du type de tube microcentrifuge utilisé.
11. Immédiatement avant de passer à la procédure d’analyse (étape 4.1), reconstituer l’échantillon préalablement séché avec un tampon de dosage immunoenzymatique (EIA) (voir le tableau des matières) décongelé à température ambiante (RT) ou à 20 °C.
    REMARQUE : Le volume de tampon d’AIE utilisé pour reconstituer l’échantillon séché doit être égal au volume d’échantillon original, soit 250 μL.

3. Préparation de la plaque ELISA - blocage pour limiter la liaison non spécifique

1. Ajouter 250 μL de tampon de sérum physiologique tris (TBS)/tampon bloquant la gélatine de poisson à chaque puits de la plaque.
2. Placer une feuille de couverture sur la plaque et incuber pendant 2 h à TA.
3. Retirez la feuille de couverture et videz la plaque par inversion ou aspiration à l’aide d’une pipette multicanal. Ensuite, épongez l’assiette sur une serviette en papier pour éliminer toute trace de liquide.
4. Sécher la plaque en la laissant dans une hotte à flux laminaire pendant 10 min.
5. Une fois la plaque visiblement sèche, placez-la dans un sachet en aluminium scellé avec un sachet déshydratant en gel de silice et conservez le sachet à -20 °C pendant 24 h.
   NOTE: Les plaques doivent être utilisées dans les 4 semaines suivant l’incubation de la plaque.

4. Avant la procédure d’essai

1. Préparez les réactifs (tampon EIA, norme CGRP, contrôle qualité CGRP, traceur CGRP, tampon de lavage) conformément aux instructions du kit. Préparez le réactif d’Ellman seulement après la fin de la période d’incubation de 16 à 20 heures.
2. Décongeler tous les échantillons et les réactifs à TA avant d’effectuer le reste du protocole.

5. Procédure de dosage

1. Rincer cinq fois chaque puits dans la plaque bloquée à l’aide d’un tampon de lavage fourni en kit (300 μL/puits). Pour chaque rinçage, faire une pause de 30 s après avoir placé le tampon de lavage dans les puits, puis jeter le liquide ou aspirer à l’aide d’une pipette multicanal.
2. Après le rinçage final, retirer tout le tampon des puits par inversion (inversion de la plaque pour expulser le liquide à l’intérieur des puits) ou aspiration à l’aide d’une pipette multicanaux. Épongez les dernières gouttes sur une serviette en papier et tapotez la plaque inversée jusqu’à ce que tout le liquide soit visiblement retiré des puits.
3. Mettez de côté au moins deux puits sans réactifs ni tampons appelés puits « vierges ». Ensuite, réserver au moins deux autres puits pour la liaison non spécifique (NSB).
4. Distribuer 100 μL de tampon EIA dans chaque puits NSB.
5. Distribuer 100 μL des étalons du PRMC en double dans les puits appropriés.
6. Distribuer 100 μL d’échantillons (reconstitués dans un tampon EIA) et le contrôle de la qualité en double dans des puits appropriés.
7. Distribuer 100 μL de traceur CGRP (anticorps anti-CGRP attaché à l’acétylcholinestérase) à chaque puits contenant NSB, normes CGRP, échantillons et contrôle de la qualité. Ne distribuez pas de traceur aux puits « vierges ».
8. Couvrir la plaque à l’aide d’une feuille de couverture transparente, en scellant chaque puits de manière à ce que les échantillons et les réactifs de chaque puits ne s’évaporent pas de manière significative. Incuber la plaque pendant 16-20 h à 4 °C.
9. Une fois l’incubation terminée, reconstituer le réactif d’Ellman conformément aux instructions du kit.
10. Retourner la plaque pour enlever tout liquide. Rincer chaque puits (comme décrit ci-dessus) trois fois avec 300 μL de tampon de lavage.
11. Après le troisième rinçage, retirer le liquide des plaques, placer la plaque sur une plaque vibrante et agiter à 120 tr/min pendant 2 min.
12. Lavez l’assiette trois fois de plus. Après le rinçage final, retirer tout le tampon des puits par inversion ou aspiration à l’aide d’une pipette multicanal. Épongez les dernières gouttes de liquide sur une serviette en papier et tapotez la plaque inversée jusqu’à ce que tout le liquide soit visiblement retiré des puits.
    REMARQUE : Les trois lavages supplémentaires décrits à cette étape peuvent ne pas être nécessaires si vous utilisez une laveuse de microplaques ELISA.
13. Distribuer 200 μL de réactif d’Ellman dans chaque puits (sans compter les puits « Blank »).
14. Couvrez la plaque avec une nouvelle feuille de couverture et enveloppez-la dans du papier d’aluminium pour éviter toute exposition à la lumière. Incuber dans le noir à TA pendant 1 h.
15. Assurez-vous qu’il n’y a pas de liquide à l’arrière de la plaque qui pourrait confondre la lecture du spectrophotomètre en essuyant l’arrière avec une serviette en papier sèche.
16. Lire la plaque pour l’absorbance à 405 nm (couleur jaune).

6. Analyse des données

1. Calculez l’absorbance moyenne pour chaque « blanc », NSB, étalon, contrôle de qualité et échantillons.
2. Soustrayez les valeurs d’absorbance moyennes NSB des valeurs d’absorbance standard, de contrôle de la qualité et d’absorbance de l’échantillon.
3. Tracer l’absorbance sur l’axe des y et la concentration sur l’axe des abscisses. Construisez une courbe standard à l’aide d’un modèle de régression logistique à quatre paramètres.
4. Une fois la courbe construite, utilisez l’équation de la courbe pour déterminer les concentrations interpolées pour le contrôle de la qualité et les échantillons, qui peuvent être lues sur l’axe des abscisses.
   NOTA : La courbe standard n’est validée que si la concentration interpolée calculée pour le contrôle de la qualité se situe à moins de 25 % de la concentration prévue (habituellement 125 pg/mL, mais voir l’étiquette du flacon de contrôle de la qualité).

Résultats

Plusieurs étapes clés du protocole doivent être soulignées. Tout d’abord, l’aprotinine, un inhibiteur de la sérine protéase, doit être ajoutée aux échantillons de sang total immédiatement après le prélèvement pour empêcher une dégradation enzymatique supplémentaire du CGRP. Il a été démontré que les protéases à sérine jouent un rôle dans le métabolisme du CGRP, et une étude antérieure a également utilisé l’aprotinine pour quantifier le CGRP chez l’homme^21,35

Discussion

Cet article décrit un protocole validé permettant la détection et la quantification du CGRP dans le plasma humain. Ce protocole a été synthétisé après que les kits ELISA commerciaux du CGRP se sont avérés ne pas quantifier avec précision cette molécule. Après avoir établi un protocole de préparation des échantillons et une courbe standard valide, les pics et la récupération ainsi que la linéarité des expériences de dilution ont montré que le pourcentage de récupérations était beaucoup plus faible...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube	Sorenson Bioscience, Inc.	11510
99% methanol	ThermoFisher Scientific	L13255.0F
15 mL conical centrifuge tube	Falcon	14-959-49B
2 mL round bottom sterile cryovials	CRYO.S	122263
4% acetic acid	ThermoFisher Scientific	035572.K2
6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube	BD	367863
Allegra 64R benchtop centrifuge	Beckman Coulter, Inc.	367586
Aprotinin	VWR	76344-814
CGRP (human) ELISA kit	Bertin Bioreagent	A05481
CGRP stock	Bertin Bioreagent
EIA Buffer	Bertin Bioreagent	A07000
Ellman's Reagent	Bertin Bioreagent	A09000_49+1
Multichannel pipettes	ThermoFisher Scientific	4661180N
Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges	Waters	WAT094226
Orbital Shaker	Bellco	7744-01010
Precision micropipettes	ThermoFisher Scientific	F144055MG
SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader	Molecular Devices	Part Number M2
TBS/Fish Gelatin	Bioworld, from Fischer Scientific	50-199-167
Ultrapure water ELISA Grade	Bertin Bioreagent	A07001
Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator	Eppendorf	22820109
Wash Buffer	Bertin Bioreagent	A17000