Rilevazione e quantificazione del peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) nel plasma umano mediante un saggio di immunoassorbimento enzimatico modificato

Riepilogo

I dati pubblicati relativi alle concentrazioni di peptidi correlati al gene della calcitonina (CGRP) nel plasma umano sono incoerenti. Queste incongruenze possono essere dovute alla mancanza di una metodologia standardizzata e convalidata per quantificare questo neuropeptide. Qui, descriviamo un protocollo ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) convalidato per purificare e quantificare CGRP nel plasma umano.

Abstract

Il peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) è un neuropeptide vasoattivo che svolge un ruolo putativo nella fisiopatologia dell'emicrania e può essere un candidato per lo status di biomarcatore. CGRP viene rilasciato dalle fibre neuronali al momento dell'attivazione e induce infiammazione neurogena sterile e vasodilatazione arteriosa nel sistema vascolare che riceve l'innervazione efferente del trigemino. La presenza di CGRP nel sistema vascolaristico periferico ha stimolato indagini per rilevare e quantificare questo neuropeptide nel plasma umano utilizzando saggi proteomici, come il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Tuttavia, la sua emivita di 6,9 minuti e la variabilità nei dettagli tecnici dei protocolli di analisi, che spesso non sono completamente descritti, hanno prodotto dati ELISA CGRP incoerenti in letteratura. Qui viene presentato un protocollo ELISA modificato per la purificazione e la quantificazione del CGRP nel plasma umano. Le fasi procedurali comprendono la raccolta e la preparazione del campione, l'estrazione utilizzando un assorbente polare come mezzo di purificazione, ulteriori fasi per bloccare il legame non specifico e la quantificazione tramite ELISA. Inoltre, il protocollo è stato validato con spike e recupero e linearità degli esperimenti di diluizione. Questo protocollo validato può teoricamente essere utilizzato per quantificare le concentrazioni di CGRP nel plasma di individui non solo con emicrania, ma anche con altre malattie in cui CGRP può svolgere un ruolo.

Introduzione

Il peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) è un neuropeptide di 37 aminoacidi presente nelle fibre neuronali con localizzazione perivascolare e nei tessuti non neuronali. Le due forme di CGRP, α- e β-CGRP, condividono più del 90% di omologia e condividono funzioni fisiologiche; tuttavia, αCGRP si trova nel sistema nervoso centrale e periferico, mentre βCGRP si trova nel sistema nervoso enterico ^1,2. Dopo l'attivazione dei nocicettori e l'esocitosi calcio-dipendente, CGRP viene rilasciato dai neuroni, inducendo un'infiammazione neurogena sterile che coinvolge vasodilatazione arteriosa e stravaso di proteine plasmatiche 3,4,5,6,7. Da qui, CGRP appare nei vasi postcapillari e può essere un biomarcatore per le malattie che causano l'attivazione nocicettiva afferente, come l'emicrania 8,9,10,11. Da notare che la CGRP è stata anche implicata nel COVID-19 attraverso il suo ruolo nell'angiogenesi e nella modulazione immunitaria e può prevedere un'evoluzione sfavorevole della malattia^12,13. Pertanto, un protocollo per la quantificazione accurata del CGRP nel plasma umano potrebbe avere un valore ampio.

La maggiore attenzione è stata forse data al ruolo di CGRP nell'emicrania. Sulla base di studi preclinici e clinici, CGRP è stato proposto come un possibile biomarcatore per l'emicrania e come bersaglio per il trattamento 3,4,5,6,7,8,9,10. Alcuni studi hanno trovato un aumento di CGRP in coorti con emicrania episodica rispetto ai partecipanti di controllo^10,14,15. Il successo degli inibitori CGRP negli studi clinici per il trattamento dell'emicrania sembra implicare un elevato CGRP come fattore causale per l'emicrania. Tuttavia, non tutti gli investigatori hanno confermato questi risultati^16,17,18,19. Inoltre, il ruolo di CGRP nei sintomi non cefalei dell'emicrania deve ancora essere chiarito; il lavoro attuale è stato motivato dal desiderio di comprendere il ruolo del CGRP nei sintomi vestibolari dell'emicrania.

Dati immunologici CGRP incoerenti in letteratura potrebbero essere dovuti a diversi motivi. In primo luogo, l'emivita di CGRP nel sistema vascolare periferico è di 6,9 min²⁰, a causa dell'attività delle proteasi serina 21, degli enzimi che degradano l'insulina e di altre metalloproteasi 22, delle endopeptidasi neutre 23 e dell'enzima di conversione dell'endotelina-1 ²⁴. In secondo luogo, i dettagli tecnici variabili dei saggi immunologici utilizzati per quantificare CGRP non sono completamente descritti in tali studi. Infine, la mancanza di standardizzazione della metodologia di dosaggio immunologico complica ulteriormente il quadro.

Questo articolo descrive un protocollo ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) modificato che consente la purificazione e la quantificazione accurata di α e βCGRP nel plasma umano. Gli anticorpi del kit non sono cross-reattivi con amilina, calcitonina o sostanza P. Questo protocollo è stato sottoposto agli esperimenti di validazione necessari, come spike e recupero e linearità di diluizione, i cui dati sono presentati qui. Tale protocollo ELISA CGRP sottoposto a validazione non è stato precedentemente completamente descritto in letteratura. Questo protocollo può essere utilizzato per quantificare CGRP nel plasma umano nel contesto dell'emicrania e cardiologica^2,25, dermatologica 26, ostetrica 27, reumatologica^28,29, muscoloscheletrica 30,31, endocrina 32,33 e malattie virali ^12,13 in cui CGRP è stato implicato.

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Protocollo

Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando campioni di plasma umano da individui consenzienti con l'approvazione del Johns Hopkins Institutional Review Board (NA_00092491).

1. Raccolta e preparazione dei campioni

1. Raccogliere 5 ml di sangue intero dalla vena antecubitale con metodi di venipuntura standard³⁴ in una provetta di raccolta dell'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) vacutainer da 6 ml.
2. Aggiungere 0,5 mL di aprotinina (10.000 KIU/mL) inibitore competitivo della proteasi serina al tubo dopo la raccolta per bloccare la lisi del peptide bersaglio. Capovolgere il tubo 10 volte per consentire all'aprotinina di mescolarsi adeguatamente con il sangue. Successivamente, conservare i tubi sul ghiaccio fino al passaggio successivo.
3. Centrifugare la provetta a 604 x g per 4 minuti a 4 °C entro 60 minuti dalla raccolta del sangue.
4. Togliere la frazione plasmatica con una pipetta e trasferire a 2 mL di crioviali sterili a fondo tondo.
5. Conservare immediatamente i crioviali a -80 °C per un massimo di 2 settimane.

2. Estrazione dei campioni di plasma

1. Posizionare una cartuccia di estrazione all'interno di una provetta conica da centrifuga da 15 mL con le creste esterne della cartuccia sostenute dalle creste esterne del tubo.
2. Attivare la cartuccia facendo passare prima 5 ml di metanolo al 100% e poi 10 ml di acqua ultrapura attraverso la cartuccia.
   1. Quando il fluido viene fatto passare attraverso la cartuccia attraverso il flusso guidato dalla gravità, si raccoglierà nel tubo.
   2. Eliminare il liquido in eccesso mentre si accumula per assicurarsi che il fluido non inghiottisca la cartuccia.
   3. Assicurarsi che la cartuccia non si asciughi durante il corso dell'esperimento.
3. Diluire 250 μL di plasma con 750 μL di acido acetico al 4%.
4. Far passare lentamente 1 mL di soluzione di plasma e acido acetico attraverso la cartuccia.
   NOTA: questo passaggio dovrebbe richiedere circa 30 s tramite flusso guidato dalla gravità per ogni millilitro passato.
5. Lavare la cartuccia con 10 ml di acido acetico al 4%. Come fatto in precedenza, buttare via il liquido in eccesso mentre si accumula per assicurarsi che il fluido non inghiottisca la cartuccia.
6. Dopo che l'ultima goccia di acido acetico è stata rilasciata dalla cartuccia, rimuovere la cartuccia dal tubo e posizionarla in una nuova provetta conica da centrifuga da 15 ml.
7. Preparare una soluzione 10:1 di metanolo al 100% e acido acetico al 4% mescolando 2,7 ml di acido acetico al 4% e 0,3 ml di metanolo al 100%. Utilizzare questo per eluire il CGRP facendo passare questa soluzione attraverso la cartuccia 1 mL alla volta. Pausa per 25 minuti tra ogni millilitro di soluzione passata. NON buttare via l'eluente.
8. Il tubo conterrà 3 ml di fluido eluito 25 minuti dopo il passaggio dell'ultimo millilitro della soluzione di metanolo e acido acetico. Introdurre ogni 1 mL di eluente in una provetta da microcentrifuga da 1,7 mL.
   NOTA: Questo dovrebbe produrre tre tubi di microcentrifuga da ogni cartuccia.
9. Mettere ogni tubo in una mini centrifuga per 1 s per assicurarsi che tutto l'eluente sia sul fondo di ogni tubo.
10. Essiccare tutti i campioni mediante centrifugazione sotto vuoto a 4 °C (impostata sulla funzione concentratore, per soluzioni acquose, a 1.400 giri/min; la forza g varia a seconda della posizione dei tubi e quindi varia da 130-250 x g).
    NOTA: Il tempo impiegato dalla centrifuga sottovuoto per asciugare i campioni dipenderà dal tipo di provetta per microcentrifuga utilizzata.
11. Immediatamente prima di procedere alla procedura di analisi (fase 4.1), ricostituire il campione precedentemente essiccato con tampone enzimatico immunologico (EIA) (vedere Tabella dei materiali) scongelato a temperatura ambiente (RT) o 20 °C.
    NOTA: il volume del tampone EIA utilizzato per ricostituire il campione essiccato deve essere uguale al volume originale del campione, ovvero 250 μL.

3. Preparazione della piastra ELISA - bloccaggio per limitare il legame non specifico

1. Aggiungere 250 μL di tampone salino tris-buffered (TBS)/tampone bloccante la gelatina di pesce a ciascun pozzetto sulla piastra.
2. Posizionare un foglio di copertura sopra la piastra e incubare per 2 ore a RT.
3. Rimuovere il foglio di copertura e svuotare la piastra mediante capovolgimento o aspirazione utilizzando una pipetta multicanale. Quindi, asciugare il piatto su un tovagliolo di carta per eliminare qualsiasi traccia di liquido.
4. Asciugare la piastra lasciando la piastra in una cappa a flusso laminare per 10 minuti.
5. Dopo che la piastra è visibilmente asciutta, metterla in una busta di alluminio sigillata con una bustina essiccante in gel di silice e conservare la busta a -20 °C per 24 ore.
   NOTA: Le piastre devono essere utilizzate entro 4 settimane dall'incubazione della piastra.

4. Prima della procedura di analisi

1. Preparare i reagenti (tampone EIA, standard CGRP, controllo qualità CGRP, tracciante CGRP, tampone di lavaggio) secondo le istruzioni del kit. Preparare il reagente di Ellman solo dopo la fine del periodo di incubazione di 16-20 ore.
2. Scongelare tutti i campioni e i reagenti in RT prima di eseguire il resto del protocollo.

5. Procedura di analisi

1. Risciacquare ogni pozzetto nella piastra bloccata cinque volte con un tampone di lavaggio fornito in kit (300 μL/pozzetto). Per ogni risciacquo, mettere in pausa 30 s dopo aver posizionato il tampone di lavaggio nei pozzetti, quindi gettare il liquido o aspirare utilizzando una pipetta multicanale.
2. Dopo il risciacquo finale, rimuovere tutto il tampone dai pozzetti mediante inversione (invertendo la piastra per espellere il liquido all'interno dei pozzetti) o aspirazione utilizzando una pipetta multicanale. Tamponare le ultime gocce su un tovagliolo di carta e picchiettare la piastra rovesciata fino a quando tutto il liquido è visibilmente rimosso dai pozzetti.
3. Mettere da parte almeno due pozzi senza reagenti o tampone per essere noti come pozzi "vuoti". Quindi, mettere da parte almeno altri due pozzetti per il legame non specifico (NSB).
4. Erogare 100 μL di tampone EIA in ciascun pozzetto NSB.
5. Erogare 100 μL degli standard CGRP in duplice copia in pozzi appropriati.
6. Erogare 100 μL di campioni (ricostituiti in tampone EIA) e controllo qualità in duplicato in appositi pozzetti.
7. Erogare 100 μL di tracciante CGRP (anticorpo anti-CGRP attaccato all'acetilcolinesterasi) a ciascun pozzetto contenente NSB, standard CGRP, campioni e controllo qualità. Non dispensare tracciante ai pozzi "Blank".
8. Coprire la piastra con un foglio di copertura trasparente, sigillando ciascun pozzetto in modo che i campioni e i reagenti in ciascun pozzetto non evaporino in modo significativo. Incubare la piastra per 16-20 ore a 4 °C.
9. Al termine dell'incubazione, ricostituire il reagente di Ellman secondo le istruzioni del kit.
10. Capovolgere la piastra per rimuovere tutto il liquido. Risciacquare ogni pozzetto (come descritto sopra) tre volte con 300 μL di tampone di lavaggio.
11. Dopo il terzo risciacquo, rimuovere il liquido dalle piastre, posizionare la piastra su una piastra agitatrice e agitare a 120 giri / min per 2 minuti.
12. Lavare il piatto altre tre volte. Dopo il risciacquo finale, rimuovere tutto il tampone dai pozzetti mediante inversione o aspirazione utilizzando una pipetta multicanale. Tamponare le ultime gocce di liquido su un tovagliolo di carta e picchiettare la piastra rovesciata fino a quando tutto il liquido è visibilmente rimosso dai pozzetti.
    NOTA: i tre lavaggi aggiuntivi descritti in questo passaggio potrebbero non essere necessari se si utilizza una lavapiastre ELISA.
13. Erogare 200 μL di reagente di Ellman in ciascun pozzetto (esclusi i pozzetti "Blank").
14. Coprire la piastra con un nuovo foglio di copertura e avvolgerla in un foglio di alluminio per evitare qualsiasi esposizione alla luce. Incubare al buio a RT per 1 ora.
15. Assicurarsi che non vi sia liquido sul retro della piastra che possa confondere la lettura dello spettrofotometro strofinando il retro con un tovagliolo di carta asciutto.
16. Leggere la piastra per l'assorbanza a 405 nm (colore giallo).

6. Analisi dei dati

1. Calcolare l'assorbanza media per ogni "Blank", NSB, standard, controllo qualità e campioni.
2. Sottrarre i valori medi di assorbanza NSB dai valori standard, controllo qualità e assorbanza del campione.
3. Tracciare l'assorbanza sull'asse y e la concentrazione sull'asse x. Costruire una curva standard utilizzando un modello di regressione logistica a quattro parametri.
4. Una volta costruita la curva, utilizzare l'equazione della curva per determinare le concentrazioni interpolate per il controllo qualità e i campioni, che possono essere letti sull'asse x.
   NOTA: La curva standard è convalidata solo se la concentrazione interpolata calcolata per il controllo di qualità è entro il 25% della concentrazione prevista (di solito 125 pg/ml, ma vedere l'etichetta del flaconcino di controllo qualità).

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Risultati

Ci sono diversi passaggi chiave nel protocollo che dovrebbero essere evidenziati. In primo luogo, l'aprotinina, un inibitore della proteasi serina, deve essere aggiunta ai campioni di sangue intero immediatamente dopo la raccolta per prevenire un'ulteriore degradazione enzimatica di CGRP. Le proteasi serina hanno dimostrato di svolgere un ruolo nel metabolismo della CGRP e uno studio precedente ha anche utilizzato l'aprotinina per quantificare la CGRP nell'uomo^21,35

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Discussione

Questo articolo descrive un protocollo convalidato che consente la rilevazione e la quantificazione di CGRP nel plasma umano. Questo protocollo è stato sintetizzato dopo che i kit commerciali CGRP ELISA sono stati trovati per non quantificare accuratamente questa molecola. Dopo aver stabilito un protocollo di preparazione del campione e una curva standard valida, gli esperimenti di spike e recupero e linearità della diluizione hanno mostrato che la percentuale di recuperi era molto più bassa del previsto. Risultati si...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube	Sorenson Bioscience, Inc.	11510
99% methanol	ThermoFisher Scientific	L13255.0F
15 mL conical centrifuge tube	Falcon	14-959-49B
2 mL round bottom sterile cryovials	CRYO.S	122263
4% acetic acid	ThermoFisher Scientific	035572.K2
6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube	BD	367863
Allegra 64R benchtop centrifuge	Beckman Coulter, Inc.	367586
Aprotinin	VWR	76344-814
CGRP (human) ELISA kit	Bertin Bioreagent	A05481
CGRP stock	Bertin Bioreagent
EIA Buffer	Bertin Bioreagent	A07000
Ellman's Reagent	Bertin Bioreagent	A09000_49+1
Multichannel pipettes	ThermoFisher Scientific	4661180N
Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges	Waters	WAT094226
Orbital Shaker	Bellco	7744-01010
Precision micropipettes	ThermoFisher Scientific	F144055MG
SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader	Molecular Devices	Part Number M2
TBS/Fish Gelatin	Bioworld, from Fischer Scientific	50-199-167
Ultrapure water ELISA Grade	Bertin Bioreagent	A07001
Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator	Eppendorf	22820109
Wash Buffer	Bertin Bioreagent	A17000