修飾酵素結合免疫吸着アッセイを用いたヒト血漿中のカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)の検出と定量(英語)

要約

ヒト血漿中のカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)濃度に関する公表されたデータは一貫していません。.これらの不一致は、この神経ペプチドを定量するための標準化された検証済みの方法論の欠如が原因である可能性があります。ここでは、ヒト血漿中のCGRPを精製および定量するための検証済みの酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)プロトコルについて説明します。

要約

カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)は、片頭痛の病態生理学において推定上の役割を果たす血管作動性神経ペプチドであり、バイオマーカー状態の候補となる可能性があります。CGRPは活性化時にニューロン線維から放出され、三叉神経支配を受ける血管系に無菌の神経原性炎症および動脈血管拡張を誘発する。末梢血管系におけるCGRPの存在は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などのプロテオミクスアッセイを使用して、ヒト血漿中のこの神経ペプチドを検出および定量するための研究に拍車をかけました。しかし、その半減期は6.9分であり、アッセイプロトコルの技術的詳細のばらつきは、しばしば完全には説明されていないため、文献では一貫性のないCGRP ELISAデータが得られています。ここでは、ヒト血漿中のCGRPの精製および定量のための修正ELISAプロトコルが提示されている。手順ステップには、サンプルの収集と調製、精製手段としての極性吸着剤を使用した抽出、非特異的結合をブロックするための追加ステップ、およびELISA による 定量が含まれます。さらに、このプロトコルは、希釈実験のスパイクと回収率および直線性で検証されています。この検証されたプロトコルは、理論的には、片頭痛だけでなく、CGRPが役割を果たす可能性のある他の疾患の個人の血漿中のCGRP濃度を定量化するために使用できます。

概要

カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)は、血管周囲局在を有する神経線維および非神経組織に存在する37アミノ酸神経ペプチドである。CGRPの2つの形態、α-とβ-CGRPは、90%以上の相同性を共有し、生理学的機能を共有しています。しかし、αCGRPは中枢神経系および末梢神経系に見られ、βCGRPは腸神経系に見られます^1,2。侵害受容器の活性化およびカルシウム依存性エキソサイトーシスにより、CGRPはニューロンから放出され、動脈血管拡張および血漿タンパク質溢出を含む無菌性神経原性炎症を誘発する³、⁴、^5、6、7。ここから、CGRPは毛細血管後血管に現れ、片頭痛などの求心性侵害受容活性化を引き起こす疾患のバイオマーカーとなる可能性があります⁸、^9、10、11。注目すべきことに、CGRPは血管新生と免疫調節におけるその役割を通じてCOVID-19にも関与しており、好ましくない疾患の進化を予測する可能性があります^12,13。したがって、ヒト血漿中のCGRPを正確に定量するためのプロトコルは、幅広い価値を持つ可能性があります。

おそらく片頭痛におけるCGRPの役割に最も注目されています。前臨床および臨床試験に基づいて、CGRPは片頭痛の可能性のあるバイオマーカーとして、また治療の標的として提示されています3,4,5,6,7,8,9,10。いくつかの研究では、対照参加者と比較して、一時的な片頭痛のあるコホートでCGRPの上昇が見られました^10、14、15。片頭痛治療の臨床試験におけるCGRP阻害剤の成功は、片頭痛の原因因子としてCGRPの上昇を示唆しているようです。ただし、すべての研究者がこれらの結果を裏付けているわけではありません¹⁶、^17、18、19。さらに、片頭痛の非頭痛症状におけるCGRPの役割はまだ解明されていません。現在の研究は、片頭痛の前庭症状におけるCGRPの役割を理解したいという願望によって動機付けられました。

文献中のCGRPイムノアッセイデータの不一致は、いくつかの理由による可能性があります。第一に、末梢血管系におけるCGRPの半減期は、セリンプロテアーゼ21、インスリン分解酵素および他のメタロプロテアーゼ22、中性エンドペプチダーゼ23、およびエンドセリン変換酵素-1 24の活性により、6.9分²⁰である。第二に、CGRPを定量するために使用されるイムノアッセイの可変的な技術的詳細は、そのような研究では完全には説明されていません。最後に、イムノアッセイ方法論の標準化の欠如は、状況をさらに複雑にします。

この記事では、ヒト血漿中のαおよびβCGRPの精製と正確な定量を可能にする修正酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)プロトコルについて説明します。キットの抗体は、アミリン、カルシトニン、またはサブスタンスPと交差反応性がありません。このプロトコルは、スパイクと回復、希釈の直線性など、必要な検証実験を経ており、そのデータはここに示されています。検証を受けたこのようなCGRP ELISAプロトコルは、これまで文献に完全には記載されていない。このプロトコルは、片頭痛、心臓病学2,25、皮膚科26、産科27、リウマチ^28,29、筋骨格^30,31、内分泌32,33、およびCGRPが関与しているウイルス性疾患^12,13の状況において、ヒト血漿中のCGRPを定量するために使用できます。

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プロトコル

このプロトコルは、ジョンズホプキンス治験審査委員会(NA_00092491)の承認を得て、同意した個人からのヒト血漿サンプルを使用して開発されました。

1. サンプルの採取と調製

1. 標準的な静脈穿刺法³⁴を介して、肘前静脈から5 mLの全血を6 mLのバキュテイナーエチレンジアミン四酢酸(EDTA)収集チューブに収集します。
2. 採取後、0.5 mLのアプロチニン(10,000 KIU/mL)競合セリンプロテアーゼ阻害剤をチューブに追加し、標的ペプチドの溶解をブロックします。チューブを10回反転させて、アプロチニンが血液と適切に混合できるようにします。その後、次のステップまでチューブを氷上に保管します。
3. 採血から60分以内にチューブを604 x g で4°Cで4分間遠心分離します。
4. 血漿画分をピペットで取り出し、2 mLの丸底滅菌クライオバイアルに移します。
5. 直ちにクライオバイアルを-80°Cで最大2週間保存してください。

2.血漿サンプルの抽出

1. 抽出カートリッジを15 mLの円錐形遠心分離管の中に置き、カートリッジの外側の隆起部をチューブの外側の隆起部で支えます。
2. 最初に5 mLの100%メタノールを通過させ、次に10 mLの超純水をカートリッジに通して、カートリッジをアクティブにします。
   1. 流体が重力駆動の流れ を介して カートリッジを通過すると、流体はチューブに集まります。
   2. 液体がカートリッジを飲み込まないように、余分な液体が蓄積したら捨てます。
   3. 実験中にカートリッジが乾かないようにしてください。
3. 250 μLの血漿を750 μLの4%酢酸で希釈します。
4. 1 mLの血漿および酢酸溶液をカートリッジにゆっくりと通します。
   注意: このステップは、通過するミリリットルごとに重力駆動の流れ を介して 約30秒かかるはずです。
5. カートリッジを10 mLの4%酢酸で洗浄します。前と同じように、余分な液体が蓄積したら捨てて、液体がカートリッジを飲み込まないようにします。
6. 最後の一滴の酢酸がカートリッジから放出されたら、カートリッジをチューブから取り出し、新しい15 mLの円錐形遠心チューブに入れます。
7. 2.7 mLの4%酢酸と0.3 mLの100%メタノールを混合して、100%メタノールと4%酢酸の10:1溶液を調製します。これを使用して、この溶液を一度に1 mLずつカートリッジに通すことでCGRPを溶出します。通過した溶液の各ミリリットルの間に25分間休止する。溶離液を捨てないでください。
8. チューブには、メタノールと酢酸溶液の最後のミリリットルが通過してから25分後に3mLの溶出液が含まれます。各1 mLの溶離液を1.7 mLの微量遠心チューブに入れます。
   注意: これにより、各カートリッジから3つのマイクロ遠心チューブが生成されます。
9. 各チューブをミニ遠心分離機に1秒間入れて、すべての溶離液が各チューブの底にあることを確認します。
10. 4°Cの真空遠心分離ですべてのサンプルを乾燥させます(水溶液の場合は1,400 rpmで濃縮機能に設定、G力はチューブの位置によって異なるため、130〜250 x gの範囲です)。
    注意: 真空遠心分離機がサンプルを乾燥させるのにかかる時間は、使用するマイクロ遠心チューブの種類によって異なります。
11. アッセイ手順(ステップ4.1)に進む直前に、以前に乾燥したサンプルを酵素免疫測定(EIA)バッファー( 材料の表を参照)で再構成し、室温(RT)または20°Cに解凍します。
    注:乾燥サンプルの再構成に使用されるEIAバッファーの容量は、元のサンプル容量、つまり250μLと等しくなければなりません。

3. ELISAプレートの調製 - 非特異的結合を制限するためのブロッキング

1. 250 μLのトリス緩衝生理食塩水(TBS)/魚ゼラチンブロッキングバッファーをプレート上の各ウェルに加えます。
2. プレートの上にカバーシートを置き、RTで2時間インキュベートします。
3. カバーシートを取り外し、マルチチャンネルピペットを使用して反転または吸引してプレートを空にします。次に、ペーパータオルでプレートを拭き取り、液体の痕跡を捨てます。
4. プレートを層流フードに10分間放置して、プレートを乾燥させます。
5. プレートが目に見えて乾いたら、シリカゲル乾燥剤サシェ付きのグリップシールホイルポーチに入れ、ポーチを-20°Cで24時間保管します。
   注:プレートはプレートインキュベーションから4週間以内に使用する必要があります。

4.アッセイ手順の前

1. キットの指示に従って試薬(EIAバッファー、CGRP標準、CGRP品質管理、CGRPトレーサー、洗浄バッファー)を準備します。16〜20時間のインキュベーション期間が終了した後にのみエルマン試薬を調製してください。
2. 残りのプロトコルを実行する前に、すべてのサンプルと試薬をRTに解凍してください。

5. アッセイ手順

1. ブロックプレート内の各ウェルを、キット付属の洗浄バッファー(300 μL/ウェル)で5回すすぎます。すすぎごとに、洗浄バッファーをウェルに入れてから30秒休止し、マルチチャンネルピペットを使用して液体または吸引液を捨てます。
2. 最後のすすぎの後、反転(プレートを反転させてウェル内の液体を排出する)またはマルチチャンネルピペットを使用した吸引によって、ウェルからすべてのバッファーを取り除きます。最後の一滴をペーパータオルの上に吸い取り、すべての液体がウェルから目に見えて除去されるまで逆さプレートを軽くたたきます。
3. 試薬やバッファーを含まない少なくとも2つのウェルを「ブランク」ウェルとして確保します。次に、非特異的結合(NSB)のために少なくとも2つの他のウェルを確保します。
4. 100 μLのEIAバッファーを各NSBウェルに分注します。
5. 100 μLのCGRP標準物質を適切なウェルに二重に分注します。
6. 100 μLのサンプル(EIAバッファーで再構成)と品質管理を適切なウェルに二重に分注します。
7. NSB、CGRP標準物質、サンプル、および品質管理を含む各ウェルに100 μLのCGRPトレーサー(アセチルコリンエステラーゼに結合した抗CGRP抗体)を分注します。トレーサーを「ブランク」ウェルに分配しないでください。
8. 透明なカバーシートを使用してプレートを覆い、各ウェル内のサンプルと試薬が大幅に蒸発しないように各ウェルを密封します。プレートを4°Cで16〜20時間インキュベートします。
9. インキュベーションが完了したら、キットの指示に従ってエルマン試薬を再構成します。
10. プレートを反転させて、すべての液体を取り除きます。各ウェルを(上記のように)300 μLの洗浄バッファーで3回すすぎます。
11. 3回目のすすぎの後、プレートから液体を取り除き、プレートをシェーカープレートに置き、120rpmで2分間振とうします。
12. プレートをさらに3回洗います。最後のすすぎの後、マルチチャンネルピペットを使用して反転または吸引によってウェルからすべてのバッファーを除去します。液体の最後の一滴をペーパータオルの上に吸い取り、すべての液体がウェルから目に見えて除去されるまで逆さプレートをタップします。
    注意: ELISAマイクロプレートウォッシャーを使用している場合は、この手順で説明する追加の3回の洗浄は必要ない場合があります。
13. 200 μLのエルマン試薬を各ウェルに分注します(「ブランク」ウェルは含まれません)。
14. プレートを新しいカバーシートで覆い、光が当たらないようにアルミホイルで包みます。暗所でRTで1時間インキュベートします。
15. プレートの裏側に、乾いたペーパータオルで裏側を拭いて、分光光度計の読み取り値を混乱させる可能性のある液体がないことを確認してください。
16. プレートの405 nm(黄色)での吸光度を読み取ります。

6.データ分析

1. 各「ブランク」、NSB、標準、品質管理、およびサンプルの平均吸光度を計算します。
2. 標準、品質管理、およびサンプルの吸光度値からNSB平均吸光度値を差し引きます。
3. Y軸に吸光度、X軸に濃度をプロットします。4パラメータのロジスティック回帰モデルを使用して検量線を作成します。
4. 曲線が作成されたら、曲線の式を使用して、x軸で読み取ることができる品質管理とサンプルの補間濃度を決定します。
   注:検量線は、品質管理のために計算された補間濃度が予想される濃度の25%以内である場合にのみ検証されます(通常は125 pg / mLですが、品質管理バイアルのラベルを参照してください)。

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結果

プロトコルには、強調表示する必要があるいくつかの重要なステップがあります。まず、セリンプロテアーゼ阻害剤であるアプロチニンを採取後すぐに全血サンプルに添加して、CGRPのさらなる酵素分解を防ぐ必要があります。セリンプロテアーゼはCGRP代謝に役割を果たすことが示されており、以前の研究では、ヒトのCGRPの定量にもアプロチニンが使用されていました^21,35

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ディスカッション

この記事では、ヒト血漿中のCGRPの検出と定量を可能にする検証済みのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、市販のCGRP ELISAキットがこの分子を正確に定量しないことが判明した後に合成されました。サンプル調製プロトコルと有効な標準曲線を確立した後、スパイクと回収率、および希釈実験の直線性は、回収率が予想よりもはるかに低いことを示しました。同様の結果が、?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube	Sorenson Bioscience, Inc.	11510
99% methanol	ThermoFisher Scientific	L13255.0F
15 mL conical centrifuge tube	Falcon	14-959-49B
2 mL round bottom sterile cryovials	CRYO.S	122263
4% acetic acid	ThermoFisher Scientific	035572.K2
6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube	BD	367863
Allegra 64R benchtop centrifuge	Beckman Coulter, Inc.	367586
Aprotinin	VWR	76344-814
CGRP (human) ELISA kit	Bertin Bioreagent	A05481
CGRP stock	Bertin Bioreagent
EIA Buffer	Bertin Bioreagent	A07000
Ellman's Reagent	Bertin Bioreagent	A09000_49+1
Multichannel pipettes	ThermoFisher Scientific	4661180N
Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges	Waters	WAT094226
Orbital Shaker	Bellco	7744-01010
Precision micropipettes	ThermoFisher Scientific	F144055MG
SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader	Molecular Devices	Part Number M2
TBS/Fish Gelatin	Bioworld, from Fischer Scientific	50-199-167
Ultrapure water ELISA Grade	Bertin Bioreagent	A07001
Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator	Eppendorf	22820109
Wash Buffer	Bertin Bioreagent	A17000