JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

İnsan plazmasındaki kalsitonin gen ilişkili peptid (CGRP) konsantrasyonları ile ilgili yayınlanmış veriler tutarsızdır. Bu tutarsızlıklar, bu nöropeptidi ölçmek için standartlaştırılmış, doğrulanmış bir metodolojinin eksikliğinden kaynaklanıyor olabilir. Burada, insan plazmasındaki CGRP'yi saflaştırmak ve ölçmek için doğrulanmış bir enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) protokolünü açıklıyoruz.

Özet

Kalsitonin geni ile ilişkili peptid (CGRP), migren baş ağrılarının patofizyolojisinde varsayılan bir rol oynayan ve biyobelirteç statüsü için aday olabilen vazoaktif bir nöropeptittir. CGRP, aktivasyon üzerine nöronal liflerden salınır ve trigeminal efferent innervasyon alan vaskülatürde steril nörojenik inflamasyon ve arteriyel vazodilatasyonu indükler. Periferik vaskülatüründe CGRP'nin varlığı, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) gibi proteomik tahliller kullanarak insan plazmasında bu nöropeptidi tespit etmek ve ölçmek için araştırmaları teşvik etmiştir. Bununla birlikte, 6.9 dakikalık yarılanma ömrü ve genellikle tam olarak tanımlanamayan tahlil protokollerinin teknik detaylarındaki değişkenlik, literatürde tutarsız CGRP ELISA verileri vermiştir. Burada, insan plazmasında CGRP'nin saflaştırılması ve nicelleştirilmesi için modifiye edilmiş bir ELISA protokolü sunulmaktadır. Prosedürel adımlar, numune toplama ve hazırlama, saflaştırma aracı olarak polar sorbent kullanarak ekstraksiyon, spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için ek adımlar ve ELISA yoluyla nicelleştirmeyi içerir. Ayrıca, protokol spike ve geri kazanım ve seyreltme deneylerinin doğrusallığı ile doğrulanmıştır. Bu doğrulanmış protokol teorik olarak sadece migren ile değil, aynı zamanda CGRP'nin rol oynayabileceği diğer hastalıklarla da bireylerin plazmasındaki CGRP konsantrasyonlarını ölçmek için kullanılabilir.

Giriş

Kalsitonin geni ile ilişkili peptid (CGRP), perivasküler lokalizasyonu olan nöronal liflerde ve nöronal olmayan dokularda bulunan 37 amino asitlik bir nöropeptittir. CGRP'nin iki formu, α- ve β-CGRP,% 90'dan fazla homolojiyi paylaşır ve fizyolojik fonksiyonları paylaşır; Bununla birlikte, αCGRP merkezi ve periferik sinir sisteminde, βCGRP ise enterik sinir sisteminde bulunur 1,2. Nosiseptör aktivasyonu ve kalsiyuma bağımlı ekzositoz üzerine, CGRP nöronlardan salınır ve arteriyel vazodilatasyon ve plazma protein ekstravazasyonunu içeren steril nörojenik inflamasyonu indükler 3,4,5,6,7. Buradan, CGRP postkapiller damarlarda görülür ve migren 8,9,10,11 gibi afferent nosiseptif aktivasyona neden olan hastalıklar için bir biyobelirteç olabilir. CGRP, anjiyogenez ve immün modülasyondaki rolü nedeniyle COVID-19'a da dahil edilmiştir ve olumsuz hastalık evrimini öngörebilir12,13. Bu nedenle, insan plazmasında CGRP'nin doğru bir şekilde ölçülmesi için bir protokol geniş bir değere sahip olabilir.

Belki de en çok dikkat CGRP'nin migrendeki rolüne verilmiştir. Preklinik ve klinik çalışmalara dayanarak, CGRP migren için olası bir biyobelirteç ve tedavi için bir hedef olarak ortaya konmuştur 3,4,5,6,7,8,9,10. Bazı çalışmalar, kontrol katılımcılarına göre epizodik migreni olan kohortlarda CGRP yüksekliği bulmuştur10,14,15. CGRP inhibitörlerinin migren baş ağrısı tedavisi için klinik çalışmalardaki başarısı, migren baş ağrıları için nedensel bir faktör olarak yüksek CGRP'yi ima ediyor gibi görünmektedir. Bununla birlikte, tüm araştırmacılar bu sonuçları doğrulamamıştır16,17,18,19. Ayrıca, CGRP'nin migrenin baş ağrısı olmayan semptomlarındaki rolü henüz aydınlatılmamıştır; Mevcut çalışma, migrenin vestibüler semptomlarında CGRP'nin rolünü anlama arzusuyla motive edildi.

Literatürdeki tutarsız CGRP immünoassay verileri çeşitli nedenlere bağlı olabilir. İlk olarak, CGRP'nin periferik vaskülatürdeki yarı ömrü, serin proteazlar 21, insülin parçalayıcı enzimler ve diğer metaloproteazlar 22, nötral endopeptidazlar23 ve endotelin dönüştürücü enzim-124'ün aktivitesi nedeniyle 6.9 dakika 20'dir. İkincisi, CGRP'yi ölçmek için kullanılan immünoassayların değişken teknik detayları bu tür çalışmalarda tam olarak tanımlanmamıştır. Son olarak, immünoassay metodolojisinin standardizasyon eksikliği resmi daha da karmaşıklaştırmaktadır.

Bu makalede, insan plazmasında α- ve βCGRP'nin saflaştırılmasına ve doğru bir şekilde nicelleştirilmesine izin veren modifiye enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) protokolü açıklanmaktadır. Kitin antikorları amilin, kalsitonin veya P maddesi ile çapraz reaktif değildir. Bu protokol, verileri burada sunulan ani artış ve geri kazanım ve seyreltmenin doğrusallığı gibi gerekli doğrulama deneylerinden geçmiştir. Validasyondan geçen böyle bir CGRP ELISA protokolü daha önce literatürde tam olarak tanımlanmamıştır. Bu protokol, migrenin yanı sıra kardiyolojik 2,25, dermatolojik26, obstetrik 27, romatolojik28,29, kas-iskelet sistemi30,31, endokrin 32,33 ve CGRP'nin ilişkili olduğu viral hastalıklar12,13 bağlamında insan plazmasındaki CGRP'yi ölçmek için kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu protokol, Johns Hopkins Kurumsal İnceleme Kurulu'nun (NA_00092491) onayı ile rıza gösteren bireylerden alınan insan plazma örnekleri kullanılarak geliştirilmiştir.

1. Numune toplama ve hazırlama

  1. Standart venipunktur yöntemleri 34 ile antekübital venden 5 mL tam kan toplayınve 6 mL'lik bir vakuminer etilendiamintetraasetik asit (EDTA) toplama tüpüne alın.
  2. Hedef peptidin lizizini bloke etmek için toplandıktan sonra tüpe 0.5 mL aprotinin (10.000 KIU / mL) rekabetçi serin proteaz inhibitörü ekleyin. Aprotinin'in kanla yeterince karışmasını sağlamak için tüpü 10 kez ters çevirin. Daha sonra, tüpleri bir sonraki adıma kadar buz üzerinde saklayın.
  3. Tüpü 604 x g'de 4 dakika boyunca 4 ° C'de kan toplanmasından sonraki 60 dakika içinde santrifüj edin.
  4. Plazma fraksiyonunu bir pipetle çıkarın ve 2 mL yuvarlak tabanlı steril kriyovyallere aktarın.
  5. Kriyoviyalleri hemen -80 ° C'de 2 haftaya kadar saklayın.

2. Plazma örneklerinin ekstraksiyonu

  1. 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpünün içine, kartuşun dış çıkıntıları tüpün dış çıkıntıları tarafından desteklenen bir ekstraksiyon kartuşu yerleştirin.
  2. Kartuştan önce 5 mL% 100 metanol ve ardından 10 mL ultra saf su geçirerek kartuşu etkinleştirin.
    1. Sıvı, yerçekimi tahrikli akış yoluyla kartuştan geçirilirken, tüpte toplanacaktır.
    2. Sıvının kartuşu yutmamasını sağlamak için biriken fazla sıvıyı dışarı atın.
    3. Deney sırasında kartuşun kurumadığından emin olun.
  3. 250 μL plazmayı 750 μL% 4 asetik asit ile seyreltin.
  4. 1 mL plazma ve asetik asit çözeltisini kartuştan yavaşça geçirin.
    NOT: Bu adım, geçirilen her mililitre için yerçekimi güdümlü akış yoluyla yaklaşık 30 s sürmelidir.
  5. Kartuşu 10 mL% 4 asetik asit ile yıkayın. Daha önce yapıldığı gibi, sıvının kartuşu yutmamasını sağlamak için fazla sıvıyı biriktikçe atın.
  6. Son asetik asit damlası kartuştan serbest bırakıldıktan sonra, kartuşu tüpten çıkarın ve yeni bir 15 mL konik santrifüj tüpüne yerleştirin.
  7. 2.7 mL% 4 asetik asit ve% 0.3 mL% 100 metanol karıştırarak% 100 metanol ve% 4 asetik asitten oluşan 10: 1'lik bir çözelti hazırlayın. Bu çözeltiyi kartuştan bir seferde 1 mL geçirerek CGRP'yi etkisiz hale getirmek için bunu kullanın. Geçirilen her mililitre çözelti arasında 25 dakika duraklayın. Elüenti atmayın.
  8. Tüp, metanol ve asetik asit çözeltisinin son mililitresi geçtikten 25 dakika sonra 3 mL salınan sıvıyı içerecektir. Elüentin her 1 mL'sini 1,7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
    NOT: Bu, her kartuştan üç mikrosantrifüj tüpü vermelidir.
  9. Tüm elüentin her tüpün dibinde olduğundan emin olmak için her tüpü 1 s boyunca mini bir santrifüje yerleştirin.
  10. Tüm numuneleri 4 °C'de vakum santrifüjleme ile kurutun (sulu çözeltiler için 1.400 rpm'de yoğunlaştırıcı işlevine ayarlayın; g-kuvveti tüplerin konumuna bağlı olarak değişir ve bu nedenle 130-250 x g arasında değişir).
    NOT: Vakumlu santrifüjün numuneleri kurutması için geçen süre, kullanılan mikrosantrifüj tüpünün tipine bağlı olacaktır.
  11. Tahlil prosedürüne geçmeden hemen önce (adım 4.1), önceden kurutulmuş numuneyi oda sıcaklığına (RT) veya 20 ° C'ye çözülmüş enzim immünoassay (EIA) tamponu (bakınız Malzeme Tablosu) ile yeniden oluşturun.
    NOT: Kurutulmuş numuneyi yeniden oluşturmak için kullanılan ÇED tamponunun hacmi, orijinal numune hacmine veya 250 μL'ye eşit olmalıdır.

3. ELISA plakasının hazırlanması - spesifik olmayan bağlamayı sınırlamak için bloke etme

  1. Tabaktaki her bir kuyucuğa 250 μL tris tamponlu salin (TBS)/balık jelatin bloke edici tampon ekleyin.
  2. Plakanın üzerine bir kapak tabakası yerleştirin ve RT'de 2 saat boyunca inkübe edin.
  3. Kapak tabakasını çıkarın ve çok kanallı pipet kullanarak ters çevirerek veya aspirasyon yaparak plakayı boşaltın. Ardından, herhangi bir sıvı izini atmak için plakayı bir kağıt havlu üzerinde kurutun.
  4. Plakayı laminer akış başlığında 10 dakika boyunca bırakarak kurutun.
  5. Plaka gözle görülür şekilde kuruduktan sonra, silika jel kurutucu poşet ile kavrama sızdırmaz bir folyo torbaya yerleştirin ve torbayı -20 ° C'de 24 saat boyunca saklayın.
    NOT: Plakalar, plaka inkübasyonundan sonraki 4 hafta içinde kullanılmalıdır.

4. Tahlil prosedüründen önce

  1. Reaktifleri (ÇED tamponu, CGRP standardı, CGRP kalite kontrol, CGRP izleyici, yıkama tamponu) kit talimatlarına göre hazırlayın. Ellman'ın reaktifini ancak 16-20 saatlik inkübasyon süresi sona erdikten sonra hazırlayın.
  2. Protokolün geri kalanını gerçekleştirmeden önce tüm numuneleri ve reaktifleri RT'ye çözün.

5. Tahlil prosedürü

  1. Bloke plakadaki her bir kuyucuğu, kit tarafından sağlanan bir yıkama tamponu (300 μL / kuyu) ile beş kez durulayın. Her durulama için, yıkama tamponunu kuyucuklara yerleştirdikten sonra 30 s duraklatın, ardından sıvıyı dışarı atın veya çok kanallı bir pipet kullanarak aspire edin.
  2. Son durulamadan sonra, ters çevirerek (kuyucukların içindeki sıvıyı dışarı atmak için plakayı ters çevirerek) veya çok kanallı bir pipet kullanarak aspirasyon yaparak tüm tamponu kuyucuklardan çıkarın. Son damlaları bir kağıt havluya yerleştirin ve tüm sıvı kuyucuklardan gözle görülür şekilde çıkarılana kadar ters çevrilmiş plakaya dokunun.
  3. "Boş" kuyular olarak bilinmesi için reaktifleri veya tamponları olmayan en az iki kuyucuğu bir kenara koyun. Ardından, spesifik olmayan bağlama (NSB) için en az iki kuyu daha ayırın.
  4. Her NSB kuyucuğuna 100 μL ÇED tamponu dağıtın.
  5. CGRP standartlarının 100 μL'sini uygun kuyucuklara çift olarak dağıtın.
  6. 100 μL numuneyi (ÇED tamponunda yeniden yapılandırılmış) ve kalite kontrolünü uygun kuyucuklara çift olarak dağıtın.
  7. NSB, CGRP standartları, numuneler ve kalite kontrol içeren her bir kuyucuğa 100 μL CGRP izleyici (asetilkolinesteraza bağlı anti-CGRP antikoru) dağıtın. İzleyiciyi "Boş" kuyucuklara dağıtmayın.
  8. Plakayı şeffaf bir kapak tabakası kullanarak örtün, her bir kuyucuğu kapatın, böylece her bir kuyucuktaki numuneler ve reaktifler önemli ölçüde buharlaşmaz. Plakayı 4 ° C'de 16-20 saat inkübe edin.
  9. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, Ellman'ın reaktifini kit talimatlarına göre yeniden oluşturun.
  10. Tüm sıvıyı çıkarmak için plakayı ters çevirin. Her bir kuyucuğu (yukarıda açıklandığı gibi) 300 μL yıkama tamponu ile üç kez durulayın.
  11. Üçüncü durulamadan sonra, sıvıyı plakalardan çıkarın, plakayı bir çalkalayıcı plakaya yerleştirin ve 2 dakika boyunca 120 rpm'de çalkalayın.
  12. Plakayı üç kez daha yıkayın. Son durulamadan sonra, çok kanallı bir pipet kullanarak ters çevirme veya aspirasyon yoluyla tüm tamponları kuyucuklardan çıkarın. Son damla sıvıyı bir kağıt havluya yerleştirin ve tüm sıvı kuyucuklardan gözle görülür şekilde çıkarılana kadar ters çevrilmiş plakaya dokunun.
    NOT: Bu adımda açıklanan ilave üç yıkama, bir ELISA mikroplaka yıkayıcı kullanılıyorsa gerekli olmayabilir.
  13. Her bir kuyucuğa 200 μL Ellman reaktifi dağıtın ("Boş" kuyucuklar hariç).
  14. Plakayı yeni bir kapak tabakasıyla örtün ve ışığa maruz kalmayı önlemek için alüminyum folyoya sarın. RT'de karanlıkta 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
  15. Arka tarafı kuru bir kağıt havluyla silerek plakanın arka tarafında, spektrofotometre okumasını karıştırabilecek sıvı olmadığından emin olun.
  16. 405 nm'de (sarı renk) absorbans için plakayı okuyun.

6. Veri analizi

  1. Her "Boş", NSB, standart, kalite kontrol ve numuneler için ortalama absorbansı hesaplayın.
  2. NSB ortalama absorbans değerlerini standart, kalite kontrol ve numune absorbans değerlerinden çıkarın.
  3. Y eksenindeki absorbansı ve x eksenindeki konsantrasyonu çizin. Dört parametreli lojistik regresyon modeli kullanarak standart bir eğri oluşturun.
  4. Eğri oluşturulduktan sonra, x ekseninde okunabilen kalite kontrol ve numuneler için enterpolasyonlu konsantrasyonları belirlemek için eğrinin denklemini kullanın.
    NOT: Standart eğri, yalnızca kalite kontrol için hesaplanan enterpolasyonlu konsantrasyon beklenen konsantrasyonun% 25'i içindeyse doğrulanır (genellikle 125 pg / mL, ancak kalite kontrol şişesinin etiketine bakın).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Protokolde vurgulanması gereken birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, bir serin proteaz inhibitörü olan aprotinin, CGRP'nin daha fazla enzimatik bozulmasını önlemek için toplandıktan hemen sonra tam kan örneklerine eklenmelidir. Serin proteazların CGRP metabolizmasında rol oynadığı gösterilmiştir ve önceki bir çalışmada da insanlarda CGRP'nin ölçülmesinde aprotinin kullanılmıştır21,35. Proteaz inhibitörleri kullanılmazsa ve numu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu makalede, insan plazmasında CGRP'nin tespitine ve miktarına izin veren doğrulanmış bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, ticari CGRP ELISA kitlerinin bu molekülü doğru bir şekilde ölçmediği tespit edildikten sonra sentezlendi. Bir numune hazırlama protokolü ve geçerli bir standart eğri oluşturduktan sonra, spike ve geri kazanım ve seyreltme deneylerinin doğrusallığı, iyileşme yüzdesinin beklenenden çok daha düşük olduğunu göstermiştir. Farklı bir ticari CGRP ELISA kiti kullanıl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların ekleyeceği başka bir açıklama yoktur.

Teşekkürler

Robert N. Cole, Lauren R. DeVine ve Marcos Iglesias'a bu protokolle ilgili yararlı tartışmaları için teşekkür ederiz. Bu kısmen Amerikan Otoloji Derneği (Fellowship Grant, PSK), Amerikan İşitme Araştırma Vakfı (90066548/90072266, JPC) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin (NIH) bir bileşeni olan Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi (NCATS) ve NIH Tıbbi Araştırma Yol Haritası (UL1 TR003098, NSF) tarafından finanse edilerek desteklenmiştir. Yayının içeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Johns Hopkins ICTR, NCATS veya NIH'nin resmi görüşünü temsil etmek zorunda değildir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.7 mL Safeseal microcentrifuge tubeSorenson Bioscience, Inc.11510
99% methanolThermoFisher ScientificL13255.0F
15 mL conical centrifuge tubeFalcon14-959-49B
2 mL round bottom sterile cryovialsCRYO.S122263
4% acetic acidThermoFisher Scientific035572.K2
6.0 mL Vacutainer EDTA collection tubeBD367863
Allegra 64R benchtop centrifugeBeckman Coulter, Inc.367586
AprotininVWR76344-814
CGRP (human) ELISA kitBertin BioreagentA05481
CGRP stockBertin Bioreagent
EIA BufferBertin BioreagentA07000
Ellman's ReagentBertin BioreagentA09000_49+1
Multichannel pipettesThermoFisher Scientific4661180N
Oasis HLB 3 cc Vac CartridgesWatersWAT094226
Orbital ShakerBellco7744-01010
Precision micropipettesThermoFisher ScientificF144055MG
SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate readerMolecular DevicesPart Number M2
TBS/Fish GelatinBioworld, from Fischer Scientific50-199-167
Ultrapure water ELISA GradeBertin BioreagentA07001
Vacufuge plus - Centrifuge ConcentratorEppendorf22820109
Wash BufferBertin BioreagentA17000

Referanslar

  1. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. -J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  2. Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
  3. Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., McCulloch, J., Uddman, R. Calcitonin gene-related peptide and cerebral blood vessels: distribution and vasomotor effects. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 7 (6), 720-728 (1987).
  4. Donnerer, J., Stein, C. Evidence for an increase in the release of CGRP from sensory nerves during inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 657, 505-506 (1992).
  5. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
  6. Markowitz, S., Saito, K., Moskowitz, M. A. Neurogenically mediated leakage of plasma protein occurs from blood vessels in dura mater but not brain. The Journal of Neuroscience. 7 (12), 4129-4136 (1987).
  7. Saito, K., Markowitz, S., Moskowitz, M. A. Ergot alkaloids block neurogenic extravasation in dura mater: proposed action in vascular headaches. Annals of Neurology. 24 (6), 732-737 (1988).
  8. Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
  9. Cady, R. K., Vause, C. V., Ho, T. W., Bigal, M. E., Durham, P. L. Elevated saliva calcitonin gene-related peptide levels during acute migraine predict therapeutic response to rizatriptan. Headache. 49 (9), 1258-1266 (2009).
  10. Cernuda-Morollón, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
  11. Messlinger, K. The big CGRP flood-sources, sinks and signalling sites in the trigeminovascular system. The Journal of Headache and Pain. 19, 22(2018).
  12. Ochoa-Callejero, L., et al. Circulating levels of calcitonin gene-related peptide are lower in COVID-19 patients. Journal of the Endocrine Society. 5 (3), (2021).
  13. Rizzi, M., et al. CGRP plasma levels correlate with the clinical evolution and prognosis of hospitalized acute COVID-19 patients. Viruses. 14 (10), 2123(2022).
  14. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
  15. Sarchielli, P., et al. Clinical-biochemical correlates of migraine attacks in rizatriptan responders and non-responders. Cephalalgia. 26 (3), 257-265 (2006).
  16. Greco, R., et al. Plasma levels of CGRP and expression of specific microRNAs in blood cells of episodic and chronic migraine subjects: towards the identification of a panel of peripheral biomarkers of migraine. The Journal of Headache and Pain. 21 (1), 122(2020).
  17. Tvedskov, J. F., et al. No increase of calcitonin gene-related peptide in jugular blood during migraine. Annals of Neurology. 58 (4), 561-568 (2005).
  18. Pellesi, L., et al. Plasma levels of CGRP during a 2-h infusion of VIP in healthy volunteers and patients with migraine: An exploratory study. Frontiers in Neurology. 13, 871176(2022).
  19. Kruuse, C., Iversen, H. K., Jansen-Olesen, I., Edvinsson, L., Olesen, J. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) levels during glyceryl trinitrate (GTN)-induced headache in healthy volunteers. Cephalalgia. 30 (4), 467-474 (2010).
  20. Kraenzlin, M. E., Ch'ng, J. L., Mulderry, P. K., Ghatei, M. A., Bloom, S. R. Infusion of a novel peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP) in man. Pharmacokinetics and effects on gastric acid secretion and on gastrointestinal hormones. Regulatory Peptides. 10 (2-3), 189-197 (1985).
  21. Brain, S. D., Williams, T. J. Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide. Nature. 335 (6185), 73-75 (1988).
  22. Kim, Y. -G., Lone, A. M., Nolte, W. M., Saghatelian, A. Peptidomics approach to elucidate the proteolytic regulation of bioactive peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8523-8527 (2012).
  23. Katayama, M., et al. Catabolism of calcitonin gene-related peptide and substance P by neutral endopeptidase. Peptides. 12 (3), 563-567 (1991).
  24. Hartopo, A. B., et al. Endothelin-converting enzyme-1 gene ablation attenuates pulmonary fibrosis via CGRP-cAMP/EPAC1 pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 465-476 (2013).
  25. Mair, J., et al. Plasma CGRP in acute myocardial infarction. Lancet. 335 (8682), 168(1990).
  26. Antúnez, C., et al. Calcitonin gene-related peptide modulates interleukin-13 in circulating cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive T cells in patients with atopic dermatitis. The British Journal of Dermatology. 161 (3), 547-553 (2009).
  27. Gangula, P. R., et al. Pregnancy and steroid hormones enhance the vasodilation responses to CGRP in rats. The American Journal of Physiology. 276 (1), H284-H288 (1999).
  28. Hernanz, A., Medina, S., de Miguel, E., Martín-Mola, E. Effect of calcitonin gene-related peptide, neuropeptide Y, substance P, and vasoactive intestinal peptide on interleukin-1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha production by peripheral whole blood cells from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Regulatory Peptides. 115 (1), 19-24 (2003).
  29. Takeba, Y., Suzuki, N., Kaneko, A., Asai, T., Sakane, T. Evidence for neural regulation of inflammatory synovial cell functions by secreting calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism. 42 (11), 2418-2429 (1999).
  30. Ahmed, M., Srinivasan, G. R., Theodorsson, E., Schultzberg, M., Kreicbergs, A. Effects of surgical denervation on substance P and calcitonin gene-related peptide in adjuvant arthritis. Peptides. 16 (4), 569-579 (1995).
  31. Neugebauer, V., Rümenapp, P., Schaible, H. G. Calcitonin gene-related peptide is involved in the spinal processing of mechanosensory input from the rat's knee joint and in the generation and maintenance of hyperexcitability of dorsal horn-neurons during development of acute inflammation. Neuroscience. 71 (4), 1095-1109 (1996).
  32. Wang, L. H., et al. Serum levels of calcitonin gene-related peptide and substance P are decreased in patients with diabetes mellitus and coronary artery disease. The Journal of International Medical Research. 40 (1), 134-140 (2012).
  33. Zelissen, P. M., Koppeschaar, H. P., Lips, C. J., Hackeng, W. H. Calcitonin gene-related peptide in human obesity. Peptides. 12 (4), 861-863 (1991).
  34. World Health Organization. WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. 3, Blood-sampling systems. World Health Organization. , Geneva. (2010).
  35. Raffaelli, B., et al. Plasma calcitonin gene-related peptide (CGRP) in migraine and endometriosis during the menstrual cycle. Annals of Clinical and Translational Neurology. 8 (6), 1251-1259 (2021).
  36. Andreasson, U., et al. A practical guide to immunoassay method validation. Frontiers in Neurology. 6, 179(2015).
  37. Messlinger, K., et al. CGRP measurements in human plasma-a methodological study. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (13), 1359-1373 (2021).
  38. Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
  39. Lee, J. -E., Kim, S. Y., Shin, S. -Y. Effect of repeated freezing and thawing on biomarker stability in plasma and serum samples. Osong Public Health and Research Perspectives. 6 (6), 357-362 (2015).
  40. Fan, P. -C., Kuo, P. -H., Lee, M. T., Chang, S. -H., Chiou, L. -C. Plasma calcitonin gene-related peptide: A potential biomarker for diagnosis and therapeutic responses in pediatric migraine. Frontiers in Neurology. 10, 10(2019).
  41. Raffaelli, B., et al. Change of CGRP plasma concentrations in migraine after discontinuation of CGRP-(receptor) monoclonal antibodies. Pharmaceutics. 15 (1), 293(2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır