人髋关节微观结构失效机制的成像

摘要

该协议通过结合大体积显微 CT 扫描、定制的压缩载物台和先进的图像处理工具，能够测量整个人类股骨近端骨微结构的变形及其韧性。

摘要

在逐渐增加的负荷下对骨骼微观结构进行成像可以观察骨骼的微观结构失效行为。在这里，我们描述了一种方案，用于在逐渐增加的变形下获得整个股骨近端的三维微观结构图像序列，导致股骨颈的临床相关骨折。该方案使用来自人群中骨密度较低端的 66-80 岁女性供体的四个股骨来证明（T 分数范围 = -2.09 至 -4.75）。设计了一个无线电透明的压缩载物台，用于加载复制单腿姿势的标本，同时记录显微计算机断层扫描 （micro-CT） 成像期间施加的载荷。视场宽 146 mm，高 132 mm，各向同性像素尺寸为 0.03 mm。力增量基于断裂载荷的有限元预测。压缩台用于将位移施加到试样上并制定规定的力增量。股骨颈张开和剪切导致的股骨头下骨折发生在四到五次负荷增加后。对显微CT图像和反作用力测量值进行处理，研究骨应变和能量吸收能力。皮层的不稳定性出现在早期的加载步骤中。股骨头软骨下骨在骨折前出现大变形，达到16%，支撑能力逐渐增加直至骨折。变形能随位移直至断裂呈线性增加，而刚度在断裂前降至接近零的值。在最后 25% 的力增量中，试样吸收了四分之三的断裂能量。总之，开发的方案揭示了显着的能量吸收能力或损伤耐受性，以及高龄供体皮质骨和小梁骨之间的协同相互作用。

引言

股骨颈骨折是老龄化人口的主要负担。显微计算机断层扫描 （micro-CT） 成像和伴随的机械测试可以观察骨微观结构并研究其与骨强度的关系、与年龄相关的变化以及负荷下的位移 ^1,2。然而，直到最近，负重骨骼的显微 CT 研究仅限于切除的骨芯³、小动物⁴ 和人类脊柱单元⁵。本方案可以量化整个近端人股骨微观结构在负荷下和骨折后的位移。

已经进行了几项研究来调查人类股骨的衰竭，有时，这些研究得出了截然不同的结论。例如，与年龄相关的皮质和小梁结构变薄被认为通过引起骨骼的弹性不稳定性来决定与年龄相关的骨折易感性^6,7，这与假设没有弹性不稳定性的皮质应变和股骨力量预测的高确定系数形成鲜明对比 （R² = 0.80-0.97）^8,9.然而，这些研究系统地低估了股骨强度（21%-29%），从而对模型 ^8,10 中实施的脆性和准脆性骨反应提出了质疑。对于这些明显相反的发现，一种可能的解释可能是与孤立的骨芯相比，整个骨骼的骨折行为不同。因此，观察整个股骨近端骨微结构的变形和骨折反应可能会增进对髋部骨折力学和相关应用的了解。

目前以微米分辨率对整个人体骨骼进行成像的方法有限。龙门架和探测器尺寸必须提供合适的工作体积来容纳人体近端股骨（约 13 cm x 10 cm，宽 x 长），并且可能提供 0.02-0.03 mm 量级的像素尺寸，以确保可以捕获相关的微观结构特征¹¹。目前，一些同步加速器设施¹和一些市售的大体积显微CT扫描仪^12,13可以满足这些规格。压缩阶段必须是无线电透明的，以尽量减少 X 射线衰减，同时产生足以导致人体股骨骨折的力（例如，老年白人女性在 0.9 kN 到 14.3 kN 之间）¹⁴。这种较大的断裂荷载变化使断裂荷载步数、总实验时间和相应产生的数据量的规划变得复杂。为了解决这个问题，可以使用临床计算机断层扫描 （CT） 图像^1,2 中标本的骨密度分布，通过有限元建模来估计骨折载荷和位置。最后，在实验结束后，需要对产生的大量数据进行处理，以研究整个人体股骨的失效机理和耗能能力。

在这里，我们描述了一种协议，用于在逐渐增加的变形下获得整个股骨近端的三维微观结构图像序列，这导致股骨颈的临床相关骨折²。该协议包括规划标本压缩的逐步增量，通过定制的无线电透明压缩台加载，通过大体积显微CT扫描仪成像，以及处理图像和负载曲线。

研究方案

该协议是用从遗体捐赠计划中收到的 12 个股骨标本开发和测试的。将标本新鲜获得并储存在-20°C的弗林德斯大学生物力学和植入物实验室（澳大利亚南澳大利亚州Tonsley）。在整个实验过程中保持骨骼水分。捐赠者是白人妇女（66-80岁）。从弗林德斯大学社会和行为研究伦理委员会（SBREC）获得伦理许可（项目#6380）。

1. 规划特定于试样的载荷阶跃增量

1. 使用临床 CT 扫描仪扫描股骨标本，目标是切片厚度和大约 0.5-0.7 毫米的平面内像素尺寸。此步骤可由任何公共成像机构的专业放射技师使用标准的预先录制的骨骼可视化成像协议完成。
2. 与标本一起，用五种已知浓度的磷酸氢二钾（K₂HPO₄，当量密度范围大约在 59 mg∙^cm-3 和 375 mg∙^cm-3 之间）扫描 CT 密度校准模型。
3. 从临床 CT 图像¹⁵ 中分割骨几何形状，对骨骼的分割几何形状进行网格划分，并使用 Schileo 等人报告的密度-弹性模量关系将各向同性材料属性逐个元素映射到校准的骨密度^值8。保存网格，以便在有限元软件中进一步分析。按照分割和有限元软件提供的相关指南完成每个步骤。
4. 将网格导入有限元软件。完全约束模型的 3-6 mm 远端。施加 1,000 N 的标称力，从冠状面的股骨干轴线内收 8° 并穿过股骨头中心。此负载条件模拟静态单腿站立任务 （orthoload.com）。
5. 使用内置的 PCG 求解器求解有限元模型（收敛容差:1 x 10⁻⁷）。
   注:这里使用的是有限元软件ANSYS。
   1. 通过执行以下命令，生成包含单元质心处的第一和第三个主应变分量的单元表:
      /POST1
      可ETABLE，， EPTO1,1
      可ETABLE，， EPTO3,3
   2. 通过执行以下命令，计算模型中第一和第三主应变分量与拉伸（0.73%应变）和压缩（1.04%应变）⁸ （图1）下的骨屈服应变之间的应变比:
      SMULT，RFT，EPTO1， ，1/0.0074,1，
      SMULT， RFT，EPTO3， ，1/0.0104,1，
6. 将标称力按拉伸和压缩的峰值应变比进行缩放，并丢弃两者中最大的应变比，以获得断裂载荷的估计值。将荷载增量确定为计算出的断裂荷载 1 的¹/4。

图 1:断裂载荷的计算。 有限元应变图、用于将标称力转换为断裂载荷的方程（左）以及显示股骨（右中）、远端铝杯（右上）和聚乙烯压力套筒（右下）的荷载方案。 请点击这里查看此图的较大版本.

2. 股骨试样组件的制备（图2）

1. 从冰箱（-20°C）中取出标本。
2. 在室温（RT）下解冻24小时，同时将标本保存在防水塑料袋中，该塑料袋包裹在浸泡在生理溶液中的吸收材料中，以保持骨骼水分。
3. 在距股骨头近端 180 毫米处切开股骨干。
4. 通过将凹形聚乙烯压力插座（图2D）和股骨头对齐，将股骨头居中在对准装置的垂直轴上。
5. 将包含股骨颈和骨干轴的平面与额平面对齐（图2）。
6. 将骨干轴旋转至8°内收，使垂直轴代表静态单腿站立期间髋关节反作用力的方向（图2）。
7. 按照制造商的说明准备牙科粘结剂。
8. 将试样的远端放入 55 毫米深的铝制灌封杯中，用牙科水泥填充铝杯。水泥完成固化的时间不少于30分钟。
9. 将试样组件储存在-20°C。

图 2:对准装置。 对准装置的正面（左）和侧面（右）照片，显示 （A） 框架，（B） 铝灌封杯，（C） 合成股骨模型，以及 （D） 球形压力插座。 请点击这里查看此图的较大版本.

3.压缩级组装

注意:压缩台的外部尺寸为直径 245 mm、高度 576 mm、重量 14 kg，不包括样品。压缩级由压缩室和执行器两大部分组成，其组装如下:

1. 压缩室
   1. 将聚乙烯压力插座（直径 104 mm，高 60 mm）安装在铝筒（直径 203 mm，壁厚 3 mm）的底部，该圆柱体的一端（底部）由焊接铝板封闭。
2. 驱动器
   1. 使用圆盘、三根杆、三角形板和垂直导轨组装顶部结构（图 3）。
   2. 将螺旋千斤顶机构（行程:150 mm，最大负载:10,000 N，齿轮比:27:1，每转位移:0.148 mm）安装在三角板上。
   3. 将角度适配器安装到线性导轨上。
   4. 将低摩擦 x-y 工作台安装到角度适配器上。
   5. 通过将称重传感器的x-z平面对准顶部结构的正面平面，将六自由度称重传感器（最大测量误差:0.005%;最大力:10,000N/最大扭矩:500Nm）安装到低摩擦工作台上。
   6. 将执行器螺钉连接到角适配器。

图 3:定制的透射线压缩级组件。 压缩阶段的照片（左）和模型（右）。（A） 压缩室，即底部封闭的 3 mm 厚铝制圆柱体;（二）执行机构总成采用顶部结构;（三）螺旋千斤顶机构;（四）低摩擦x-y工作台;（E）在模型上显示和指示六轴称重传感器。 请点击这里查看此图的较大版本.

4. 设置实验

1. 在室温下解冻标本24小时，同时将其保存在浸泡在生理溶液中的吸收性材料包裹的防水塑料袋中以保持骨水分。
2. 通过将试样组件的正面平面与执行器的正面平面对齐，将铝杯试样组件安装到称重传感器上。
3. 将顶部结构（包括试样）组装到压缩室中。注意将股骨头与聚乙烯压力插座上的球形凹面对齐。确保股骨头啮合但在压力窝的球形腔内松弛。
4. 将压缩载物台放在成像和医学光束线（IMBL）处的显微CT扫描仪的旋转载物台上。
5. 将称重传感器（误差<0.005%;最大力:10,000N;最大扭矩:500Nm）连接到应变放大器。
6. 通过USB将应变放大器连接到配备称重传感器随附应用软件的笔记本电脑。
7. 在压缩阶段，通过将试样向下移动到压力插座来启动螺杆机构，同时监测笔记本电脑中称重传感器测量的反作用力。一旦达到等于 100 N 的压缩力，就停止螺杆机构。将试样卸载至 50 N 预紧力。
8. 选择单个 pco.edge 传感器透镜耦合闪烁体"Ruby"（http://archive.synchrotron.org.au/31-australian-synchrotron/imbl/811-preparation-for-imaging-experiments）。
9. 将视场设置为 76.31 mm x 64.39 mm，对于 2,560 像素 x 2,160 像素的阵列大小，提供 29.81 μm 的像素大小。
10. 将旋转载物台的轴线设置为距视场轴线 8 mm（水平）（偏移扫描模式），以将视场扩展到 145.71 mm x 64.39 mm，像素尺寸为 29.81 μm。
11. 将扫描参数设置为光束能量为 60 keV、旋转增量为 0.1°、两批 180° 旋转（偏移扫描）、曝光时间为 50 μs，每个旋转位置的帧平均为 2 个。
12. 将扫描设置为连续采集 5 个垂直堆叠扫描，每个扫描的垂直偏移 26 mm，因此扫描体积的总高度为 132.2 mm，总扫描时间为 30 分钟。

5. 机械测试与伴随的微观结构成像

1. 在参考条件（作为零应变条件）下进行两次显微CT（像素尺寸:0.03mm）成像。
2. 通过以每轮约 1 秒 （0.1-0.2 mm/s） 的恒定速率手动启动螺旋千斤顶机构来施加力增量。
3. 进行显微 CT 成像。
4. 重复步骤5.2和步骤5.3，直至引起试样断裂，如反作用力突然下降所示。
5. 对骨折标本进行显微 CT 成像。
6. 拼接 1,800 个投影图像（尺寸为 2,560 像素 x 896 像素，尺寸为 76.8 mm x 26.88 mm，宽 x 高，32 位浮点图像）。该过程将两张投影图像（在水平偏移扫描模式下拍摄）和五张垂直移动的图像拼接在一起，从而产生单个投影图像。
   1. 重建横截面图像的体积（4,407 张图像，每张图像的大小为 4,888 x 4,888 像素），并将其另存为 32 位浮点文件。TIFF 格式（占用 392 GB 磁盘空间）。
   2. 应用 3 x 3 高斯滤波器以降低噪声。将图像转换为 8 位（256 个灰度图像，以位图格式保存，每个卷占用大约 100 GB）。
      注意:在这项工作中，图像的处理是在IMBL操作员的指导下使用澳大利亚同步加速器提供的软件进行的。

6.位移和应变场的计算

1. 对横截面图像进行四次（120 μm/像素）的子采样，以减少计算时间。
2. 在空间中严格地将载荷下的试样的图像与卸载参考条件下的试样的图像共配准。使用远端骨干作为共同注册的对象（补充文件 1 和 补充文件 2）。
3. 创建曲面三维模型 （.STL 文件）用于对显微 CT 图像进行二值化后的可视化¹¹.
4. 使用等于 50 像素的网格大小（SDER = 0.076% 应变误差、BoneDVC https://bonedvc.insigneo.org/dvc/）将图像体积弹性地注册到参考体积，以确定网格节点处的位移。
5. 将网格转换为有限元模型。将 BoneDVC 计算的节点位移应用于模型。求解模型以确定整个骨体积的应变张量。
6. 使用全分辨率图像在显示最高应变水平的区域中重复分析。
7. 使用带有 interp3 函数 （Matlab）² 的三次插值将 DVC 应变图映射到全分辨率图像。
8. 可视化位移、应变和微观结构图像，以实现大体积可视化和动画 （Matlab）²。

第7章 分析

1. 通过叠加在空载条件下和骨折后获得的图像来显示骨骼的永久变形（损伤）².
2. 通过在空载条件下、增加的载荷水平和骨折后² 下叠加三维模型来显示骨骼的渐进性微观结构变形。
3. 显示骨折位置² 处的骨应变。
4. 使用描述性统计和回归方法分析变形能量、刚度和位移².

结果

这些图像显示了整个股骨近端、压力窝、牙科水泥、铝杯和包裹组织。随着骨折前和骨折后负荷的增加，可以看到骨微结构逐渐变形（图 4）。

图 4:连接到笔记本电脑的 压缩阶段。 （A） 压缩阶段，（B

讨论

本方案允许在 离体的三维空间中研究髋部骨折的时间经过的微观力学。一种能够对人体股骨近端施加渐进变形并测量反作用力的透射线透明（铝）压缩台已经过定制设计、制造和测试。该协议中采用大体积显微CT扫描仪来提供图像体积的时间序列，以微观分辨率显示整个股骨近端，并逐渐加载。在这项工作中，利用图像的弹性共配准计算了位移场和应变场。该协议能够显示股骨近端微观结?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent tissue	N/A		Maintain the bone moisture throughout the experiment
Alignment rig	Custom-made		Rig for positioning the specimen in the potting cup
Aluminium potting cup	Custom-made		Potting cup
Bone saw	N/A		Cut the specimen to size
Calibration phantom QCT Pro	Mindways Software, Inc., Austin, USA	CT Calibration 13002	Calibrate grey levels in the images into equivalent bone mineral (ash) density levels
Clinical Computed-Tmography scanner	General Electric Medical Systems Co., Wisconsin, USA	Optima CT660	Preliminary imaging for the prediction of the load step to fracture
Compressive stage	Custom-made		A 10 kg, radiotransparent compressive stage for applying and maintaining throught imaging a prescribed deformation to the specimen.
Dental cement	Soesterberg, The Netherlands	Vertex RS
Femur specimen	Science Care, Phoenix, USA
Finite-element analysis software	ANSYS Inc., Canonsburg, USA	ANSYS Mechanical APDL	Finite-element software package
Freezer	N/A		Store specimens at -20 °C
Hard Drive	Dell		Disk space: 500 GB per volume
Image bnarization and segmentation software	Skyscan-Bruker, Kontich, Belgium	CT analyzer	Image processing software
Image elastic segmentation	The University of Sheffield	Bone DVC	https://bonedvc.insigneo.org/dvc/
Image processing and automation software	The MathWork Inc.	Matlab	Image processing software
Image registration software	Skyscan-Bruker, Kontich, Belgium	DataViewer	Image processing software
Image segmentation and FE modelling software	Simpleware, Exeter, UK	Scan IP	Bone egmentation software
Image stiching script	Australian syncrotron, Clayton, VIC, AU		The script is available at IMBL
Image visualization	Kitware, Clifton Park, NY, USA	Paraview	Image visualization
Image visualization	Australian National University	Dristhi	Image visualization: doi:10.1117/12.935640
Imaging and Medical beamline	Australian syncrotron, Clayton, VIC, AU		Large object micro-CT beamline at the Australian Synchrotron
Laptop	Dell Inc., USA
Low-friction x-y table	THK Co., Tokyo, Japan
NI signal acquisition software	National Instruments, Austin, TX	NI-DAQmx
Phosphate-buffered saline solution	Custom-made		Maintain the bone moisture throughout the experiment
Plastic bag	N/A		Maintain the bone moisture throughout the experiment
Rail	SKF Inc., Lansdale, PA, USA
Screw-jack mechanism	Benzlers, Örebro, Sweden	Serie BD (warm gear unit)	stroke: 150 mm, maximal load: 10,000 N, gear ratio: 27:1, a displacement per revolution: 0.148 mm
Single pco.edge sensor, lens coupled scintillator	Australian syncrotron, Clayton, VIC, AU		Detector Ruby FOV: 141 x 119 mm; 2560 x 2160 px; 55 µm/px; 50 fps
Six axis load cell	ME-Meßsysteme GmbH, Hennigsdorf, GE	K6D6	Maximal measurement error: 0.005%; maximal force: 10000 N; maximal torque: 500 Nm
Strain amplifier	ME-Meßsysteme GmbH, Hennigsdorf, GE	GSV-1A8USB K6D/M16