인간 고관절의 미세구조 실패 메커니즘 이미징

요약

이 프로토콜은 대용량 마이크로 CT 스캔, 맞춤형 압축 단계 및 고급 이미지 처리 도구를 결합하여 전체 근위 인간 대퇴골의 뼈 미세 구조 변형과 인성을 측정할 수 있습니다.

초록

점진적으로 증가하는 하중 하에서 뼈 미세 구조를 이미징하면 뼈의 미세 구조 파괴 거동을 관찰할 수 있습니다. 여기에서는 점진적으로 증가하는 변형 하에서 전체 근위 대퇴골의 3차원 미세 구조 이미지 시퀀스를 획득하여 대퇴골 경부의 임상적으로 관련된 골절을 유발하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 인구 내 골밀도의 하단에 있는 66-80세 여성 기증자의 대퇴골 4개를 사용하여 입증되었습니다(T-점수 범위 = −2.09에서 −4.75). 방사선 투명 압축 스테이지는 한쪽 다리 자세를 복제하는 표본을 로딩하는 동시에 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(micro-CT) 이미징 중에 적용된 하중을 기록하도록 설계되었습니다. 시야각은 너비 146mm, 높이 132mm이고 등방성 픽셀 크기는 0.03mm였습니다. 힘 증가는 파괴 하중의 유한 요소 예측을 기반으로 했습니다. 압축 단계는 시편에 변위를 적용하고 규정된 힘 증가를 제정하는 데 사용되었습니다. 대퇴골 경부의 개방 및 전단으로 인한 자본하부 골절은 4-5번의 하중 증가 후에 발생했습니다. 마이크로 CT 영상과 반력 측정을 처리하여 뼈 변형률과 에너지 흡수 능력을 연구했습니다. 피질의 불안정성은 초기 로딩 단계에서 나타났습니다. 대퇴골두의 연골하골은 골절 전 16%에 달하는 큰 변형을 보였고, 골절까지 지지력이 점진적으로 증가했다. 변형 에너지는 변위와 함께 파단까지 선형적으로 증가하는 반면, 강성은 파단 직전에 거의 0에 가까운 값으로 감소합니다. 파괴 에너지의 3/4은 최종 25% 힘 증가 동안 시편에 의해 취해졌습니다. 결론적으로, 개발된 프로토콜은 놀라운 에너지 흡수 능력 또는 손상 내성과 고령 기증자 연령에서 피질과 섬유주 뼈 사이의 시너지 상호 작용을 보여주었습니다.

서문

대퇴골 경부의 골절은 고령 인구에게 큰 부담이 됩니다. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(micro-CT) 영상 및 수반되는 기계적 검사를 통해 뼈 미세 구조를 관찰하고 뼈 강도, 노화 관련 변화 및 하중 ^1,2 하에서의 변위와의 관계를 연구할 수 있습니다. 그러나 최근까지 하중을 받는 뼈에 대한 마이크로 CT 연구는 절제된 골심³, 소동물⁴ 및 인간 척추 단위⁵로 제한되었다. 본 프로토콜은 하중을 받고 골절 후 전체 근위 인간 대퇴골의 미세 구조의 변위를 정량화할 수 있습니다.

인간 대퇴골의 부전을 조사하기 위해 여러 연구가 수행되었으며, 때때로 대조적인 결론에 도달했습니다. 예를 들어, 대뇌피질 및 섬유주 구조의 노화와 관련된 얇아짐은 뼈의 탄성 불안정성을 유발함으로써 골절에 대한 연령 관련 감수성을 결정하는 것으로 생각되며, 이는 탄성 불안정성이 없다고 가정할 때 피질 긴장 및 대퇴골 강도 예측의 높은 결정 계수와 명백한 대조를 이룹니다(^R2 = 0.80-0.97)^8,9. 그럼에도 불구하고, 이러한 연구들은 체계적으로 대퇴골 강도를 과소평가하여(21%-29%), 따라서 모델 ^8,10에서 구현된 부서지기 쉽고 준부서지기 쉬운 뼈 반응에 의문을 제기했습니다. 이러한 명백히 대조적인 발견에 대한 한 가지 가능한 설명은 고립된 뼈 코어와 비교하여 전체 뼈의 다른 골절 거동에 있을 수 있습니다. 따라서 전체 근위 대퇴골에서 뼈 미세구조의 변형 및 골절 반응을 관찰하면 고관절 골절 역학 및 관련 응용 분야에 대한 지식을 발전시킬 수 있습니다.

현재 인간의 뼈 전체를 마이크로미터 해상도로 이미징하는 방법은 제한적입니다. 갠트리와 검출기 크기는 인간 근위 대퇴골을 수용하기에 적합한 작업 부피(약 13cm x 10cm, 너비 x 길이)를 제공해야 하며, 관련 미세 건축적 특징을 캡처할 수 있도록 0.02-0.03mm 정도의 픽셀 크기를 제공해야 한다¹¹. 이러한 사양은 현재 일부 싱크로트론 설비(synchrotron facility)1 및 일부 상업적으로 이용 가능한 대용량 micro-CT 스캐너^(12,13)에 의해 충족될 수 있다. 압축 단계는 X선 감쇠를 최소화하면서 인간 대퇴골에 골절을 일으키기에 충분한 힘(예: 노인 백인 여성의 경우 0.9kN에서 14.3kN 사이)을 생성하기 위해 방사선 투명이어야 합니다¹⁴. 이 큰 파괴 하중 변동은 파괴에 대한 하중 단계 수, 전체 실험 시간 및 생성된 해당 데이터 양의 계획을 복잡하게 만듭니다. 이 문제를 해결하기 위해 임상 컴퓨터 단층 촬영(CT) 이미지 ^1,2에서 표본의 골밀도 분포를 사용하여 유한 요소 모델링을 통해 골절 하중과 위치를 추정할 수 있습니다. 마지막으로, 실험 후 생성된 대량의 데이터는 전체 인간 대퇴골의 고장 메커니즘 및 에너지 손실 용량을 연구하기 위해 처리되어야 합니다.

여기에서, 우리는 점진적으로 증가하는 변형 하에서 전체 근위 대퇴골의 3차원 미세구조 이미지의 시퀀스를 획득하기 위한 프로토콜을 설명하며, 이는 대퇴골 경부의 임상적으로 관련된 골절을 유발한다². 이 프로토콜에는 표본 압축의 단계적 증가 계획, 맞춤형 무선 투명 압축 스테이지 를 통한 로딩, 대용량 마이크로 CT 스캐너를 통한 이미징, 이미지 및 로드 프로파일 처리가 포함됩니다.

프로토콜

이 프로토콜은 시신 기증 프로그램에서 받은 12개의 대퇴골 표본으로 개발 및 테스트되었습니다. 표본을 신선하게 채취하여 플린더스 대학(호주 남호주 톤슬리)의 생체역학 및 임플란트 실험실에서 -20°C에서 보관했습니다. 뼈 수분은 실험 내내 유지되었습니다. 기증자는 백인 여성(66-80세)이었다. 플린더스 대학교(Flinders University)의 사회 및 행동 연구 윤리 위원회(Social and Behavioural Research Ethics Committee, SBREC)로부터 윤리 허가를 받았습니다(프로젝트 # 6380).

1. 시편별 하중 단계 증가 계획

1. 슬라이스 두께와 약 0.5-0.7mm의 면내 픽셀 크기를 대상으로 하는 임상 CT 스캐너를 사용하여 대퇴골 검체를 스캔합니다. 이 단계는 모든 공공 영상 시설의 전문 방사선 기사가 뼈 시각화를 위해 사전 녹화된 표준 영상 프로토콜을 사용하여 완료할 수 있습니다.
2. 표본과 함께 5가지 알려진 농도의 인산수소칼륨(K₂HPO₄, 등가 밀도 범위 약 59mg∙cm−3 및 375mg∙cm⁻³)으로 CT 밀도 측정 보정 팬텀을 스캔합니다.
3. 임상 CT 영상(¹⁵)으로부터 뼈 형상을 분할하고, 뼈의 분할된 형상을 메쉬하고, Schileo et ^al.8에 의해 보고된 밀도-탄성 계수 관계를 사용하여 등방성 재료 특성 요소를 요소별로 보정된 골밀도 값에 매핑합니다. 유한 요소 소프트웨어에서 추가 분석을 위해 메쉬를 저장합니다. 세그멘테이션 및 유한 요소 소프트웨어와 함께 제공되는 관련 지침에 따라 각 단계를 완료합니다.
4. 메시를 유한 요소 소프트웨어로 가져옵니다. 모델의 3-6mm 원단 끝을 완전히 구속합니다. 1,000N의 공칭 힘을 가하여 관상면의 대퇴골 축 축에서 8° 내전하고 대퇴골두의 중심을 통과합니다. 이 로딩 조건은 정적 한 다리 자세 작업(orthoload.com)을 모방합니다.
5. 내장된 PCG 솔버(수렴 허용오차: 1 x 10⁻⁷)를 사용하여 유한 요소 모델을 풉니다.
   참고: 여기서는 유한 요소 소프트웨어 ANSYS가 사용되었습니다.
   1. 다음 명령을 실행하여 요소 중심에서 첫 번째와 세 번째 주변형률 성분을 포함하는 요소 테이블을 생성합니다.
      /포스트1
      에터블,, EPTO1,1
      에테이블,, EPTO3,3
   2. 다음 명령을 실행하여 모델의 첫 번째 및 세 번째 주 변형률 성분과 인장(0.73% 변형률) 및 압축(1.04% 변형률)⁸ 의 뼈 항복 변형률 사이의 변형률을 계산합니다(그림 1).
      SMULT, RFT, EPTO1, ,1/0.0074,1,
      SMULT, RFT, EPTO3, ,1/0.0104,1,
6. 인장과 압축 모두에서 피크 변형률 비율로 공칭 하중을 조정하고 파괴 하중의 추정치를 얻기 위해 둘 중 가장 큰 하중을 버립니다. 하중 증분을 계산된 파괴 하중 1의¹/4로 결정합니다.

그림 1: 파괴 하중 계산. 유한 요소 변형률 맵, 공칭 힘을 파괴 하중으로 변환하는 데 사용되는 방정식(왼쪽), 대퇴골(가운데 오른쪽), 원위 알루미늄(오른쪽 상단) 및 폴리에틸렌 압력 소켓(오른쪽 하단)을 표시하는 하중 체계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 대퇴골 표본 조립체의 준비(그림 2)

1. 냉동실(-20°C)에서 표본을 제거합니다.
2. 뼈 수분을 유지하기 위해 생리학적 용액에 담근 흡수성 물질로 싸인 방수 비닐 봉지에 표본을 보관하면서 실온(RT)에서 24시간 동안 해동합니다.
3. 근위 대퇴골두에서 180mm 떨어진 대퇴골 골격을 자릅니다.
4. 오목한 모양의 폴리에틸렌 압력 소켓(그림 2D)과 대퇴골두를 정렬하여 대퇴골두를 정렬 장비의 수직 축에 중앙에 놓습니다.
5. 대퇴골 경부와 diaphysis 축을 포함하는 평면을 정면 평면에 맞춥니다(그림 2).
6. diaphyseal 축을 8° 내전으로 회전하여 수직 축이 정적 단일 다리 자세 동안 고관절 반력의 방향을 나타내도록 합니다(그림 2).
7. 제조업체의 지침에 따라 치과용 시멘트를 준비합니다.
8. 55mm 깊이의 알루미늄 포팅 컵에 표본의 말단 끝을 포팅하고 알루미늄 컵을 치과용 시멘트로 채웁니다. 시멘트가 경화를 완료할 때까지 30분 이상 기다리십시오.
9. 시편 어셈블리를 -20°C에서 보관하십시오.

그림 2: 정렬 리그 (A) 프레임, (B) 알루미늄 포팅 컵, (C) 합성 대퇴골 모델, (D) 구형 압력 소켓을 보여주는 얼라인먼트 리그의 정면(왼쪽) 및 측면(오른쪽) 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 압축 단계 집합

알림: 압축 단계의 외부 치수는 샘플 제외 직경 245mm, 높이 576mm, 무게 14kg입니다. 압축 단계는 압축 챔버와 액추에이터의 두 가지 주요 부분으로 구성되며 다음과 같이 조립됩니다.

1. 압축 챔버
   1. 폴리에틸렌 압력 소켓(직경 104mm, 높이 60mm)을 알루미늄 실린더(직경 203mm, 벽 두께 3mm)의 바닥에 장착하고 한쪽 끝(하단)은 용접된 알루미늄 판으로 닫힙니다.
2. 작동기
   1. 디스크, 막대 3개, 삼각형 플레이트 및 수직 레일을 사용하여 상단 구조물을 조립합니다(그림 3).
   2. 삼각형 플레이트에 스크류 잭 메커니즘(스트로크: 150mm, 최대 하중: 10,000N, 기어비: 27:1, 회전당 변위: 0.148mm)을 장착합니다.
   3. 앵귤러 어댑터를 선형 레일에 장착합니다.
   4. 마찰이 적은 xy 테이블을 앵귤러 어댑터에 장착합니다.
   5. 6 자유도 로드셀(최대 측정 오차: 0.005%; 최대 힘: 10,000 N; 최대 토크: 500 Nm)을 로드셀의 x-z 평면을 상단 구조물의 정면 평면에 정렬하여 저마찰 테이블에 장착합니다.
   6. 액추에이터 나사를 앵귤러 어댑터에 연결합니다.

그림 3: 맞춤형 방사성 투명 압축 단계 어셈블리. 압축 단계의 사진(왼쪽)과 모델(오른쪽). (A) 바닥에서 닫힌 3mm 두께의 알루미늄 실린더인 압축 챔버; (B) 상기 상부 구조를 갖는 액츄에이터 조립체; (C) 스크류 잭 메커니즘; (D) 저마찰 x-y 테이블; (E) 6축 로드셀이 모델에 표시되고 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 실험 설정

1. 뼈 수분을 유지하기 위해 생리학적 용액에 적신 흡수성 물질로 싸인 방수 비닐 봉지에 보관하면서 표본을 상온에서 24시간 동안 해동합니다.
2. 알루미늄 컵 시편 어셈블리를 시편 어셈블리의 정면면을 액추에이터의 정면면과 정렬하여 로드셀에 장착합니다.
3. 시편을 포함한 상단 구조물을 압축 챔버에 조립합니다. 대퇴골두를 폴리에틸렌 압력 소켓의 구형 오목한 부분에 맞추도록 주의하십시오. 대퇴골두가 맞물려 있지만 압력 소켓의 구형 구멍 내에서 느슨한지 확인하십시오.
4. IMBL(Imaging and Medical Beamline)에 있는 micro-CT 스캐너의 회전 스테이지에 압축 스테이지를 놓습니다.
5. 로드셀(오차 < 0.005%, 최대 힘: 10,000N, 최대 토크: 500Nm)을 스트레인 증폭기에 연결합니다.
6. USB를 통해 스트레인 증폭기를 로드셀과 함께 제공된 어플리케이션 소프트웨어가 장착된 랩톱 컴퓨터에 연결합니다.
7. 압축 단계에서 시편을 압력 소켓 쪽으로 아래쪽으로 이동하면서 노트북의 로드 셀에서 측정한 반력을 모니터링하여 스크류 메커니즘을 작동시킵니다. 100N과 같은 압축력에 도달하면 나사 메커니즘을 중지하십시오. 시편을 50N 예압으로 언로드합니다.
8. 단일 pco.edge 센서 렌즈 결합 신틸레이터 "Ruby"(http://archive.synchrotron.org.au/31-australian-synchrotron/imbl/811-preparation-for-imaging-experiments)를 선택합니다.
9. 시야각을 76.31mm x 64.39mm로 설정하며, 2,560픽셀 x 2,160픽셀 배열 크기의 경우 29.81μm의 픽셀 크기를 제공합니다.
10. 회전 스테이지의 축을 시야 축에서 8mm(수평)로 설정하여(오프셋 스캐닝 모드) 시야를 145.71μm의 픽셀 크기에서 64.39mm x 29.81mm로 확장합니다.
11. 스캐닝 매개변수를 60keV의 빔 에너지, 0.1°의 회전 증분, 180° 회전의 두 배치(오프셋 스캐닝), 50μs의 노출 시간 및 회전 위치당 2개의 프레임 평균으로 설정합니다.
12. 스캔된 볼륨의 총 높이가 132.2mm가 되고 총 스캔 시간이 30분이도록 각각 26mm씩 수직으로 쌓인 연속 스캔을 획득하도록 스캔을 설정합니다.

5. 수반되는 미세 구조 이미징을 사용한 기계적 테스트

1. 기준 조건(변형률이 없는 조건으로 간주)에서 micro-CT(픽셀 크기: 0.03mm) 이미징을 두 번 수행합니다.
2. 라운드당 약 1초(0.1-0.2mm/s)의 일정한 속도로 나사 잭 메커니즘을 수동으로 작동하여 힘 증가를 적용합니다.
3. 마이크로 CT 촬영을 수행합니다.
4. 5.2단계와 5.3단계를 반복하여 반력의 급격한 감소로 표시된 것처럼 시편의 파괴를 일으킵니다.
5. 골절된 표본의 micro-CT 영상을 수행합니다.
6. 1,800개의 프로젝션 이미지(크기 2,560픽셀 x 896픽셀, 너비 x 26.88mm, 너비 x 높이, 32비트 부동 소수점 이미지)를 연결합니다. 이 프로세스는 두 개의 프로젝션 이미지(수평 오프셋 스캐닝 모드에서 촬영)와 수직으로 이동된 5개의 이미지를 스티칭하여 단일 프로젝션 이미지를 생성합니다.
   1. 단면 이미지(4,407개 이미지, 각 이미지 크기 4,888 x 4,888픽셀)의 볼륨을 재구성하고 에 32비트 부동 소수점 파일로 저장합니다. TIFF 형식(392GB의 디스크 공간 차지).
   2. 3 x 3 가우스 필터를 적용하여 노이즈를 줄입니다. 이미지를 8비트(비트맵 형식으로 저장된 256개의 그레이레벨 이미지, 볼륨당 약 100GB 차지)로 변환합니다.
      참고: 이 작업에서 이미지 처리는 IMBL 운영자의 안내에 따라 Australian Synchrotron에서 사용할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.

6. 변위와 변형률장의 계산

1. 단면 이미지를 4개(120μm/픽셀)씩 서브샘플링하여 계산 시간을 단축합니다.
2. 하중을 받고 있는 시편의 이미지를 하중이 가해지지 않은 기준 조건의 시편 이미지와 공간에 엄격하게 공동 정합합니다. 원위 골격을 공동 정합 대상으로 사용합니다(보충 파일 1 및 보충 파일 2).
3. 곡면 3차원 모형(. STL 파일) micro-CT 영상을 이진화한 후 시각화를 위해¹¹.
4. 50픽셀(SDER = 0.076% 변형률 오류, BoneDVC https://bonedvc.insigneo.org/dvc/)과 같은 격자 크기를 사용하여 이미지 볼륨을 참조 볼륨에 탄력적으로 등록하여 격자 노드의 변위를 확인합니다.
5. 그리드를 유한 요소 모델로 변환합니다. BoneDVC에서 계산한 절점 변위를 모델에 적용합니다. 모델을 풀어 전체 골격 체적에 대한 변형 텐서를 결정합니다.
6. 전체 해상도 이미지를 사용하여 가장 높은 변형률 수준을 보여주는 영역에서 분석을 반복합니다.
7. interp3 함수 (Matlab)²와 함께 3차 보간을 사용하여 DVC 변형률 매핑을 전체 해상도 영상에 매핑합니다.
8. 대용량 시각화 및 애니메이션을 위한 변위, 변형률 및 미세 구조 이미지 시각화 (Matlab)².

7. 분석

1. 하중이 가해지지 않은 상태와 골절 후 얻은 이미지를 오버레이하여 뼈의 영구적인 변형(손상)을 표시합니다².
2. 하중이 가해지지 않은 상태에서, 하중 수준이 증가할 때, 골절 후²에서 3차원 모델을 오버레이하여 뼈의 점진적인 미세 구조 변형을 표시합니다.
3. 골절 위치²에서 뼈의 변형을 표시합니다.
4. 변형 에너지, 강성, 변위를 기술통계량과 회귀분석법을 이용하여 분석².

결과

이미지에는 전체 근위 대퇴골, 압력 소켓, 치과용 시멘트, 알루미늄 컵 및 포장 조직이 표시됩니다. 뼈 미세 구조는 골절 전과 골절 후에 하중이 증가함에 따라 점진적으로 변형되는 것을 볼 수 있습니다(그림 4).

그림 4: 랩톱 컴퓨...

토론

본 프로토콜은 고관절 골절의 시간 경과 미세역학을 생체 외에서 3차원으로 연구할 수 있습니다. 인간 대퇴골의 근위 절반에 점진적 변형을 가하고 반력을 측정할 수 있는 방사선 투명(알루미늄) 압축 스테이지가 맞춤 설계, 제조 및 테스트되었습니다. 이 프로토콜에는 대용량 마이크로 CT 스캐너가 사용되어 마이크로미터 해상도에서 점진적 로딩으로 전체 근위 대퇴골을 표시하는 이미지 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent tissue	N/A		Maintain the bone moisture throughout the experiment
Alignment rig	Custom-made		Rig for positioning the specimen in the potting cup
Aluminium potting cup	Custom-made		Potting cup
Bone saw	N/A		Cut the specimen to size
Calibration phantom QCT Pro	Mindways Software, Inc., Austin, USA	CT Calibration 13002	Calibrate grey levels in the images into equivalent bone mineral (ash) density levels
Clinical Computed-Tmography scanner	General Electric Medical Systems Co., Wisconsin, USA	Optima CT660	Preliminary imaging for the prediction of the load step to fracture
Compressive stage	Custom-made		A 10 kg, radiotransparent compressive stage for applying and maintaining throught imaging a prescribed deformation to the specimen.
Dental cement	Soesterberg, The Netherlands	Vertex RS
Femur specimen	Science Care, Phoenix, USA
Finite-element analysis software	ANSYS Inc., Canonsburg, USA	ANSYS Mechanical APDL	Finite-element software package
Freezer	N/A		Store specimens at -20 °C
Hard Drive	Dell		Disk space: 500 GB per volume
Image bnarization and segmentation software	Skyscan-Bruker, Kontich, Belgium	CT analyzer	Image processing software
Image elastic segmentation	The University of Sheffield	Bone DVC	https://bonedvc.insigneo.org/dvc/
Image processing and automation software	The MathWork Inc.	Matlab	Image processing software
Image registration software	Skyscan-Bruker, Kontich, Belgium	DataViewer	Image processing software
Image segmentation and FE modelling software	Simpleware, Exeter, UK	Scan IP	Bone egmentation software
Image stiching script	Australian syncrotron, Clayton, VIC, AU		The script is available at IMBL
Image visualization	Kitware, Clifton Park, NY, USA	Paraview	Image visualization
Image visualization	Australian National University	Dristhi	Image visualization: doi:10.1117/12.935640
Imaging and Medical beamline	Australian syncrotron, Clayton, VIC, AU		Large object micro-CT beamline at the Australian Synchrotron
Laptop	Dell Inc., USA
Low-friction x-y table	THK Co., Tokyo, Japan
NI signal acquisition software	National Instruments, Austin, TX	NI-DAQmx
Phosphate-buffered saline solution	Custom-made		Maintain the bone moisture throughout the experiment
Plastic bag	N/A		Maintain the bone moisture throughout the experiment
Rail	SKF Inc., Lansdale, PA, USA
Screw-jack mechanism	Benzlers, Örebro, Sweden	Serie BD (warm gear unit)	stroke: 150 mm, maximal load: 10,000 N, gear ratio: 27:1, a displacement per revolution: 0.148 mm
Single pco.edge sensor, lens coupled scintillator	Australian syncrotron, Clayton, VIC, AU		Detector Ruby FOV: 141 x 119 mm; 2560 x 2160 px; 55 µm/px; 50 fps
Six axis load cell	ME-Meßsysteme GmbH, Hennigsdorf, GE	K6D6	Maximal measurement error: 0.005%; maximal force: 10000 N; maximal torque: 500 Nm
Strain amplifier	ME-Meßsysteme GmbH, Hennigsdorf, GE	GSV-1A8USB K6D/M16