Визуализация механизма микроструктурного разрушения тазобедренного сустава человека

Резюме

Протокол позволяет измерять деформацию микроструктуры кости во всем проксимальном отделе бедренной кости человека и ее прочность, сочетая микрокомпьютерную томографию большого объема, компрессионную стадию, изготовленную по индивидуальному заказу, и передовые инструменты обработки изображений.

Аннотация

Визуализация микроструктуры кости при прогрессивно возрастающих нагрузках позволяет наблюдать за поведением микроструктурного разрушения кости. В данной работе мы описываем протокол получения последовательности трехмерных микроструктурных изображений всего проксимального отдела бедренной кости при прогрессивно нарастающей деформации, вызывающей клинически значимые переломы шейки бедренной кости. Протокол продемонстрирован на примере четырех бедренных костей доноров женского пола в возрасте 66-80 лет с нижней границей минеральной плотности костной ткани в популяции (диапазон Т-критерия = от −2,09 до −4,75). Радиопрозрачный компрессионный столик был разработан для нагружения образцов, воспроизводящих стойку на одной ноге, с одновременным регистрированием приложенной нагрузки при микрокомпьютерной томографии (микро-КТ). Поле зрения составляло 146 мм в ширину и 132 мм в высоту, а размер изотропного пикселя — 0,03 мм. Приращение силы было основано на конечно-элементных прогнозах нагрузки на разрушение. Стадия сжатия использовалась для приложения смещения к образцу и введения заданного приращения усилия. Субкапитальные переломы из-за вскрытия и сдвига шейки бедренной кости происходили после четырех-пяти приращений нагрузки. Микро-КТ-изображения и измерения силы реакции были обработаны для изучения деформации кости и способности поглощать энергию. Нестабильность коры головного мозга проявилась на ранних этапах нагрузки. Субхондральная кость головки бедренной кости демонстрировала большие деформации, достигавшие 16% до перелома, и прогрессирующее увеличение опорной способности вплоть до перелома. Энергия деформации линейно возрастала со смещением вплоть до разрушения, в то время как жесткость снижалась до околонулевых значений непосредственно перед разрушением. Три четверти энергии разрушения было поглощено образцом во время заключительного 25-процентного приращения силы. В заключение, разработанный протокол показал замечательную способность поглощать энергию, или устойчивость к повреждениям, а также синергетическое взаимодействие между кортикальной и трабекулярной костью в пожилом возрасте донора.

Введение

Переломы шейки бедренной кости являются серьезным бременем для стареющего населения. Микрокомпьютерная томография (микро-КТ) и сопутствующее механическое исследование позволяют наблюдать микроструктуру кости и изучать ее связь с прочностью кости, ее возрастными изменениями и смещениями под нагрузкой ^1,2. Однако до недавнего времени микро-КТ исследований костей под нагрузкой ограничивались иссеченными костными ядрами³, мелкими животными⁴ и позвоночником человека⁵. Настоящий протокол позволяет количественно оценить смещение микроструктуры всего проксимального отдела бедренной кости человека под нагрузкой и после перелома.

Было проведено несколько исследований по изучению недостаточности бедренной кости человека, и иногда они приходили к противоположным выводам. Например, считается, что возрастное истончение кортикальных и трабекулярных структур определяет возрастную предрасположенность к переломам, вызывая эластическую нестабильность кости^6,7, что явно контрастирует с высоким коэффициентом определения деформации коры и прогнозов прочности бедренной кости при условии отсутствия эластической нестабильности (R² = 0,80-0,97)^8,9. Тем не менее, такие исследования систематически недооценивали прочность бедренной кости (на 21%-29%), что ставит под сомнение хрупкие и квазихрупкие костные реакции, реализованные в моделях ^8,10. Одно из возможных объяснений этих, казалось бы, противоречащих друг другу результатов может заключаться в различном поведении при переломе целых костей по сравнению с изолированными костными ядрами. Таким образом, наблюдение за реакцией на деформацию и перелом микроструктуры кости во всем проксимальном отделе бедренной кости может углубить знания о механике перелома бедра и связанных с ней приложениях.

Существующие методы визуализации целых костей человека с микрометрическим разрешением ограничены. Размер портала и детектора должен обеспечивать подходящий рабочий объем для размещения проксимального отдела бедренной кости человека (примерно 13 см x 10 см, ширина x длина) и, возможно, размер пикселя порядка 0,02-0,03 мм, чтобы обеспечить возможность захвата соответствующих микроархитектурных элементов¹¹. В настоящее время этим спецификациям могут соответствовать некоторые синхротронные^{установки1} и некоторые коммерчески доступные микрокомпьютерные томографы^{большого объема 12,13}. Компрессионная ступень должна быть радиопрозрачной, чтобы свести к минимуму ослабление рентгеновского излучения и создать силу, достаточную для того, чтобы вызвать перелом бедренной кости человека (например, от 0,9 кН до 14,3 кН для пожилых белых женщин)¹⁴. Такое большое изменение нагрузки на трещину усложняет планирование количества этапов нагружения до разрушения, общего времени эксперимента и соответствующего объема получаемых данных. Для решения этой проблемы нагрузка и локализация перелома могут быть оценены с помощью конечно-элементного моделирования с использованием распределения плотности костной ткани образца по изображениям клинической компьютерной томографии (КТ) ^1,2. Наконец, после эксперимента большой объем полученных данных необходимо обработать для изучения механизмов отказа и способности к диссипации энергии во всей бедренной кости человека.

Здесь мы описываем протокол получения последовательности трехмерных микроструктурных изображений всего проксимального отдела бедренной кости при прогрессивно нарастающей деформации, которая вызывает клинически значимые переломы шейки бедренной кости². Протокол включает в себя планирование ступенчатого приращения сжатия образца, нагружение с помощью специальной радиопрозрачной компрессионной ступени, визуализацию с помощью микрокомпьютерного томографа большого объема и обработку изображений и профилей нагрузки.

протокол

Протокол был разработан и протестирован на 12 образцах бедренной кости, полученных в рамках программы донорства тела. Образцы получали свежими и хранили при температуре −20 °C в Лаборатории биомеханики и имплантатов Университета Флиндерса (Тонсли, Южная Австралия, Австралия). Влажность костей поддерживалась на протяжении всего эксперимента. Донорами выступили женщины кавказской расы (66-80 лет). Этическое разрешение было получено от Комитета по этике социальных и поведенческих исследований (SBREC) Университета Флиндерса (Project # 6380).

1. Планирование шага нагрузки для конкретного образца

1. Отсканируйте образец бедренной кости с помощью клинического компьютерного томографа, ориентируясь на толщину среза и размер пикселя в плоскости примерно 0,5-0,7 мм. Этот этап может быть выполнен экспертом-рентгенологом в любом общественном учреждении визуализации с использованием стандартных предварительно записанных протоколов визуализации для визуализации костей.
2. Вместе с образцом отсканируйте калибровочный фантом для КТ-денситометрии с пятью известными концентрациями дикалийгидрофосфата (K₂HPO₄, эквивалентный диапазон плотности примерно от 59 мг∙см−3 до 375 мг∙см⁻³).
3. Сегментируйте геометрию кости по клиническим КТ-изображениям¹⁵, создайте сетку сегментированной геометрии кости и сопоставьте изотропные свойства материала элемент за элементом с калиброванными значениями плотности костной ткани, используя зависимость плотности от модуля упругости, о которой сообщили Schileo et ^al.8. Сохраните сетку для дальнейшего анализа в программном обеспечении конечных элементов. Выполняйте каждый шаг, следуя соответствующим рекомендациям, прилагаемым к программному обеспечению сегментации и конечных элементов.
4. Импортируйте сетку в конечно-элементное программное обеспечение. Полностью ограничьте дистальный конец модели на 3-6 мм. Приложите номинальное усилие 1000 Н, приводимое под углом 8° от оси бедренного стержня в корональной плоскости и проходящее через центр головки бедренной кости. Это условие нагружения имитирует статическую задачу стояния на одной ноге (orthoload.com).
5. Решить конечно-элементную модель с помощью встроенного решателя PCG (допуск сходимости: 1 x 10⁻⁷).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовалось конечно-элементное программное обеспечение ANSYS.
   1. Сгенерируйте таблицу элементов, содержащую первый и третий компоненты главной деформации в центроиде элемента, выполнив следующие команды:
      /ПОСТ1
      ETABLE,, EPTO1,1
      ETABLE,, EPTO3,3
   2. Рассчитайте коэффициент деформации между первым и третьим основными компонентами деформации в модели и деформацией текучести кости при растяжении (деформация 0,73%) и сжатии (деформация 1,04%)⁸ (рис. 1), выполнив следующие команды:
      SMULT,RFT,EPTO1, ,1/0.0074,1,
      СМУЛЬТ, РФТ, ЭПТО3, ,1/0,0104,1,
6. Масштабируйте номинальную силу по коэффициенту пиковой деформации как при растяжении, так и при сжатии и отбрасывайте наибольший из двух, чтобы получить оценку нагрузки на разрушение. Определите приращение нагрузки как 1/4 расчетной нагрузки разрушения¹.

Рисунок 1: Расчет нагрузки на разрушение. Карта деформации конечных элементов, уравнения, используемые для преобразования номинальной силы в нагрузку на разрушение (слева), и схема нагружения, отображающая бедренную кость (в центре справа), дистальную алюминиевую чашку (вверху справа) и полиэтиленовую напорную раструбку (внизу справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

2. Подготовка образца бедренной кости в сборе (Рисунок 2)

1. Достаньте образец из морозильной камеры (−20 °C).
2. Разморозьте при комнатной температуре (RT) в течение 24 часов, держа образец в водонепроницаемом полиэтиленовом пакете, завернутом в абсорбирующий материал, пропитанный физиологическим раствором для поддержания влажности кости.
3. Разрезают диафиз бедренной кости на расстоянии 180 мм от проксимального отдела головки бедренной кости.
4. Центрируйте головку бедренной кости по вертикальной оси юстировочной установки, совместив вогнутое полиэтиленовое напорное гнездо (рис. 2D) и головку бедренной кости.
5. Совместите плоскость, содержащую шейку бедренной кости и ось диафиза, с фронтальной плоскостью (рисунок 2).
6. Поверните диафизарную ось до приведения 8° так, чтобы вертикальная ось представляла ориентацию силы реакции бедра во время статической стойки на одной ноге (рис. 2).
7. Приготовьте стоматологический цемент, следуя инструкциям производителя.
8. Поместите дистальный конец образца в алюминиевый стаканчик глубиной 55 мм, заполнив алюминиевый стаканчик стоматологическим цементом. Подождите не менее 30 минут, чтобы цемент полностью затвердел.
9. Храните образец в сборе при температуре −20 °C.

Рисунок 2: Юстировочная установка. Фронтальная (слева) и боковая (справа) фотография юстировочного стенда, на которой изображены (A) рама, (B) алюминиевый стаканчик для заливки, (C) синтетическая модель бедренной кости и (D) напорное гнездо сферической формы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

3. Сборка ступени сжатия

ПРИМЕЧАНИЕ: Внешние размеры ступени сжатия составляют 245 мм в диаметре, 576 мм в высоту и вес 14 кг без учета образца. Ступень сжатия состоит из двух основных частей: камеры сжатия и привода, которые собраны следующим образом:

1. Камера сжатия
   1. Установите полиэтиленовый напорный патрубок (диаметр 104 мм, высота 60 мм) в нижней части алюминиевого баллона (диаметр 203 мм, толщина стенки 3 мм), который закрывается приваренной алюминиевой пластиной с одного конца (снизу).
2. Привод
   1. Соберите верхнюю конструкцию с помощью диска, трех стержней, треугольной пластины и вертикальной направляющей (Рисунок 3).
   2. Установите винтовой домкратный механизм (ход: 150 мм, максимальная нагрузка: 10 000 Н, передаточное число: 27:1, рабочий объем на оборот: 0,148 мм) на треугольной пластине.
   3. Установите угловой адаптер на линейную направляющую.
   4. Установите стол x-y с низким коэффициентом трения на угловой адаптер.
   5. Установите тензодатчик с шестью степенями свободы (максимальная погрешность измерения: 0,005%; максимальная сила: 10 000 Н; максимальный крутящий момент: 500 Нм) на стол с низким коэффициентом трения, совместив плоскость x-z тензодатчика с фронтальной плоскостью верхней конструкции.
   6. Подсоедините винт привода к угловому адаптеру.

Рисунок 3: Изготовленная по индивидуальному заказу радиопрозрачная ступень сжатия. Фотография (слева) и модель (справа) компрессионной ступени. (A) Камера сжатия, представляющая собой алюминиевый цилиндр толщиной 3 мм, закрытый снизу; (B) привод в сборе с верхней конструкцией; (C) винтовой домкратный механизм; (D) таблица x-y с низким коэффициентом трения; и (E) шестиосевой тензодатчик отображаются и указываются на модели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

4. Постановка эксперимента

1. Разморозьте образец в RT в течение 24 часов, храня его в водонепроницаемом пластиковом пакете, завернутом в абсорбирующий материал, пропитанный физиологическим раствором для поддержания влажности кости.
2. Установите узел образца из алюминиевой чашки на тензодатчик, совместив фронтальную плоскость узла образца с плоскостью привода.
3. Соберите верхнюю конструкцию, включая образец, в камеру сжатия. Позаботьтесь о том, чтобы головка бедренной кости совпадала со сферической вогнутостью на полиэтиленовом напорном гнезде. Убедитесь, что головка бедренной кости задействована, но провисает в сферической полости напорной впадины.
4. Поместите компрессионный столик на вращающийся столик микро-КТ-сканера в центре визуализации и медицинского пучка (IMBL).
5. Подключите тензодатчик (погрешность < 0,005%; максимальное усилие: 10 000 Н; максимальный крутящий момент: 500 Нм) к усилителю деформации.
6. Подключите усилитель деформации через USB к портативному компьютеру, оснащенному прикладным программным обеспечением, поставляемым с тензодатчиком.
7. Приводите в действие винтовой механизм на стадии сжатия, перемещая образец вниз к нажимному гнезду, одновременно контролируя силу реакции, измеряемую тензодатчиком в ноутбуке. Остановите винтовой механизм, как только будет достигнуто усилие сжатия, равное 100 Н. Выгрузите образец до предварительной нагрузки 50 Н.
8. Выберите сцинтиллятор с одним датчиком pco.edge "Ruby" (http://archive.synchrotron.org.au/31-australian-synchrotron/imbl/811-preparation-for-imaging-experiments).
9. Установите поле зрения 76,31 мм x 64,39 мм, что для размера массива 2 560 x 2 160 пикселей обеспечивает размер пикселя 29,81 мкм.
10. Установите ось вращающегося столика на расстоянии 8 мм (по горизонтали) от оси поля зрения (режим сканирования со смещением), чтобы расширить поле зрения до 145,71 мм x 64,39 мм при размере пикселя 29,81 мкм.
11. Установите параметры сканирования на энергию луча 60 кэВ, приращение вращения 0,1°, две партии поворота на 180° (сканирование со смещением), время экспозиции 50 мкс и усреднение кадров по два на положение вращения.
12. Настройте сканирование на получение пяти последовательных вертикальных сканов со сдвигом по вертикали на 26 мм каждое, чтобы общая высота сканируемого тома составляла 132,2 мм при общем времени сканирования 30 минут.

5. Механические испытания с сопутствующей микроструктурной визуализацией

1. Выполните микрокомпьютерную томографию (размер пикселя: 0,03 мм) дважды в эталонном состоянии (принятом как условие нулевой деформации).
2. Приращение усилия осуществляется путем ручного приведения в действие винтового домкрата с постоянной скоростью примерно 1 с на патрон (0,1-0,2 мм/с).
3. Выполните микрокомпьютерную томографию.
4. Повторите шаги 5.2 и 5.3 до тех пор, пока образец не будет разрушен, на что указывает внезапное падение силы реакции.
5. Выполните микрокомпьютерную томографию образца с переломом.
6. Сшите 1 800 проекционных изображений (размер 2 560 пикселей x 896 пикселей, 76,8 мм x 26,88 мм, ширина x высота, 32-битные изображения с плавающей запятой). В ходе этого процесса сшиваются два проекционных изображения (снятых в режиме горизонтального офсетного сканирования) и пять изображений, сдвинутых по вертикали, в результате чего получается единое проекционное изображение.
   1. Восстановите объем изображений поперечного сечения (4 407 изображений, каждое изображение размером 4 888 x 4 888 пикселей) и сохраните их в виде 32-разрядных файлов с плавающей запятой в формате . Формат TIFF (занимающий 392 ГБ дискового пространства).
   2. Примените фильтр Гаусса 3 x 3 для уменьшения шума. Преобразуйте изображения в 8-битные (256 изображений с уровнями серого, сохраненных в растровом формате, занимающих примерно 100 ГБ на том).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В данной работе обработка изображений проводилась с использованием программного обеспечения, имеющегося на Австралийском синхротроне, под руководством оператора IMBL.

6. Расчет поля перемещений и деформаций

1. Субдискретизация изображений поперечного сечения на четыре (120 мкм/пиксель) для сокращения времени вычисления.
2. Жесткая совместная регистрация в пространстве изображений образца под нагрузкой с изображениями образца в ненагруженном эталонном состоянии. Используйте дистальный диафиз в качестве мишени для совместной регистрации (Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2).
3. Создание трехмерных моделей поверхностей (. STL) для визуализации после бинаризации микро-КТ изображений¹¹.
4. Упруго зарегистрируйте объем изображения до эталонного объема, используя размер сетки, равный 50 пикселям (SDER = 0,076% погрешности деформации, BoneDVC, https://bonedvc.insigneo.org/dvc/) для определения смещений в узлах сетки.
5. Преобразуйте сетку в конечно-элементную модель. Примените к модели узловое смещение, рассчитанное с помощью BoneDVC. Решите модель, чтобы определить тензор деформации по всему объему кости.
6. Повторите анализ в области, показывающей самые высокие уровни деформации, используя изображения с полным разрешением.
7. Сопоставьте карты деформации DVC с изображениями с полным разрешением с помощью кубической интерполяции с функцией interp3 (Matlab)².
8. Визуализация изображений смещений, деформаций и микроструктур для визуализации больших объемов и анимации (Matlab)².

7. Анализ

1. Отображение остаточной деформации кости (повреждения) путем наложения изображений, полученных в ненагруженных условиях и после перелома².
2. Отображение прогрессирующей микроструктурной деформации кости путем наложения трехмерных моделей в ненагруженных условиях, при возрастающих уровнях нагрузки и после перелома².
3. Отобразите деформацию кости в месте перелома².
4. Анализ энергии деформации, жесткости и смещения с использованием описательной статистики и методов регрессии².

Результаты

На изображениях видна вся проксимальная часть бедренной кости, прижимная впадина, зубной цемент, алюминиевая чашка и оберточная ткань. Микроархитектура кости прогрессивно деформируется по мере увеличения нагрузки до и после перелома (рис. 4).

Обсуждение

Настоящий протокол позволяет изучать микромеханику переломов шейки бедра в трех измерениях ex vivo. Радиопрозрачная (алюминиевая) компрессионная ступень, способная оказывать прогрессирующую деформацию на проксимальную половину бедренной кости человека и измерять силу реакции, бы?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent tissue	N/A		Maintain the bone moisture throughout the experiment
Alignment rig	Custom-made		Rig for positioning the specimen in the potting cup
Aluminium potting cup	Custom-made		Potting cup
Bone saw	N/A		Cut the specimen to size
Calibration phantom QCT Pro	Mindways Software, Inc., Austin, USA	CT Calibration 13002	Calibrate grey levels in the images into equivalent bone mineral (ash) density levels
Clinical Computed-Tmography scanner	General Electric Medical Systems Co., Wisconsin, USA	Optima CT660	Preliminary imaging for the prediction of the load step to fracture
Compressive stage	Custom-made		A 10 kg, radiotransparent compressive stage for applying and maintaining throught imaging a prescribed deformation to the specimen.
Dental cement	Soesterberg, The Netherlands	Vertex RS
Femur specimen	Science Care, Phoenix, USA
Finite-element analysis software	ANSYS Inc., Canonsburg, USA	ANSYS Mechanical APDL	Finite-element software package
Freezer	N/A		Store specimens at -20 °C
Hard Drive	Dell		Disk space: 500 GB per volume
Image bnarization and segmentation software	Skyscan-Bruker, Kontich, Belgium	CT analyzer	Image processing software
Image elastic segmentation	The University of Sheffield	Bone DVC	https://bonedvc.insigneo.org/dvc/
Image processing and automation software	The MathWork Inc.	Matlab	Image processing software
Image registration software	Skyscan-Bruker, Kontich, Belgium	DataViewer	Image processing software
Image segmentation and FE modelling software	Simpleware, Exeter, UK	Scan IP	Bone egmentation software
Image stiching script	Australian syncrotron, Clayton, VIC, AU		The script is available at IMBL
Image visualization	Kitware, Clifton Park, NY, USA	Paraview	Image visualization
Image visualization	Australian National University	Dristhi	Image visualization: doi:10.1117/12.935640
Imaging and Medical beamline	Australian syncrotron, Clayton, VIC, AU		Large object micro-CT beamline at the Australian Synchrotron
Laptop	Dell Inc., USA
Low-friction x-y table	THK Co., Tokyo, Japan
NI signal acquisition software	National Instruments, Austin, TX	NI-DAQmx
Phosphate-buffered saline solution	Custom-made		Maintain the bone moisture throughout the experiment
Plastic bag	N/A		Maintain the bone moisture throughout the experiment
Rail	SKF Inc., Lansdale, PA, USA
Screw-jack mechanism	Benzlers, Örebro, Sweden	Serie BD (warm gear unit)	stroke: 150 mm, maximal load: 10,000 N, gear ratio: 27:1, a displacement per revolution: 0.148 mm
Single pco.edge sensor, lens coupled scintillator	Australian syncrotron, Clayton, VIC, AU		Detector Ruby FOV: 141 x 119 mm; 2560 x 2160 px; 55 µm/px; 50 fps
Six axis load cell	ME-Meßsysteme GmbH, Hennigsdorf, GE	K6D6	Maximal measurement error: 0.005%; maximal force: 10000 N; maximal torque: 500 Nm
Strain amplifier	ME-Meßsysteme GmbH, Hennigsdorf, GE	GSV-1A8USB K6D/M16