一种测定果蝇运动活性的简单技术

摘要

该协议通过使用开源软件斐济跟踪和分析手工竞技场中苍蝇的运动来评估 果蝇 的运动活动，该软件与插件兼容，以基于高清视频录制分割每帧的像素以计算速度、距离等参数。

摘要

黑腹果蝇 因其丰富的先进遗传操作技术和多样化的行为特征而成为研究各种疾病的理想模式生物。在动物模型中识别行为缺陷是衡量疾病严重程度的关键指标，例如，在神经退行性疾病中，患者经常经历运动功能障碍。然而，随着各种系统可用于跟踪和评估苍蝇模型中的运动缺陷，例如药物治疗或转基因个体，仍然缺乏从多个角度进行精确评估的经济且用户友好的系统。本文开发了一种基于 AnimalTracker 应用程序编程接口（API）的方法，该方法与斐济图像处理程序兼容，以系统地评估记录的视频中成年和幼虫个体的运动活动，从而可以分析其跟踪行为。该方法只需要一个高清摄像头和一个计算机外围硬件集成来记录和分析行为，使其成为筛选具有转基因或环境行为缺陷的苍蝇模型的一种经济有效的方法。给出了使用药理处理的苍蝇的行为测试示例，以展示该技术如何以高度可重复的方式检测成年苍蝇和幼虫的行为变化。

引言

黑腹果蝇 为研究由基因修饰¹、药物治疗² 和衰老³ 创建的神经元疾病模型中的细胞和分子功能提供了一种极好的模式生物。人类和果蝇之间生物途径、物理特性和疾病相关同系物基因的高度保守性使果 蝇 成为从分子到行为水平的理想模仿物⁴.在许多疾病模型中，行为缺陷是一个重要的指标，为各种人类神经病提供了有用的模型^5，6。 果蝇 现在用于研究多种人类疾病、神经发育和神经退行性疾病，如帕金森病和肌萎缩侧索硬化症^7，8。检测疾病模型的运动能力对于了解致病进展至关重要，并且可以提供与疾病过程背后的分子机制的表型相关性。

最近，已经为果蝇运动检测策略开发了商用软件工具和具有成本效益的程序，例如在分组果蝇中进行高通量测试⁹，¹⁰和实时测量运动^11，12。一种这样的传统方法是快速交互式负地理分类（RING），也称为攀爬测定，它包括多个通道，允许包含具有相同性别和年龄的大量苍蝇种群，从而^{在收集数据}的同时减少变异9^，13。另一种用于分析运动行为的预测试方法是TriKinetics果蝇活动监测器（DAM），这是一种使用多个光束来检测细玻璃管内苍蝇活动运动的设备¹⁴。该设备连续记录位置，通过计算光束交叉来表示自动运动，以研究苍蝇在较长时间内的活动和昼夜节律¹⁵。尽管这些方法已广泛用于分析果蝇的行为缺陷以确定行为运动的变化，但它们总是需要特殊的测试设备或复杂的分析过程，并且限制了它们在某些模型中的应用，设备有限，简单。用于测试成年果蝇的基于动物追踪组的策略，例如 FlyGrAM¹¹ 和果蝇岛测定¹⁰，在预定义的区域实施社会招募和个体跟踪。然而，由于苍蝇的碰撞或重叠，在被蹂躏的区域，社会个体限制可能会对图像中的识别产生负面影响。尽管一些基于开源材料的方法，如TRex¹⁶、MARGO 12和FlyPi¹⁷，有紧急情况，但它们可以在行为测试中灵活使用，快速追踪苍蝇。这些测试方法与复杂的实验设备安装、特殊软件要求或专业计算机语言有关。对于幼虫，测量每单位时间穿过网格边界线数量的总距离¹⁸，或粗略计算个体的体壁收缩¹⁹，是评估其运动能力的主要方法。由于设备或装置和分析方法缺乏精确性，幼虫的一些行为运动可能逃脱检测，难以准确评估行为运动，尤其是精细运动¹⁵。

本开发的方法利用与斐济（ImageJ）图像处理程序兼容的 AnimalTracker 应用程序编程接口（API），通过分析成蝇和幼蝇的高清（HD）视频中的跟踪行为，系统地评估其运动活动。斐济是一个开源软件ImageJ发行版，可以将强大的软件库与多种脚本语言相结合，从而快速制作图像处理算法的原型，使其图像分析功能在生物学家中很受欢迎²⁰。在当前的方法中，斐济与 AnimalTracker API 的集成被用来开发具有个性化算法插入的独特果 蝇 行为测定，并为详细文档和教程提供了一个有用的步骤，以支持运动行为的强大分析能力（图 1）。为了避免因苍蝇碰撞或重叠而导致图像中客观识别的复杂性，每个竞技场仅限于容纳一只苍蝇。在评估该方法的跟踪精度后，实施它来追踪和量化与有毒药物鱼藤酮一起给药的果 蝇 运动，该药物通常用于帕金森病的动物模型，最终发现药物治疗中的运动障碍²¹。这种方法采用开源和免费软件，不需要高成本的仪器，并且可以精确和可重复地分析 果蝇 的行为运动。

研究方案

本研究使用W¹¹¹⁸成年苍蝇和第三龄幼虫。

1. 实验准备

注意:用于 果蝇 运动跟踪的露天竞技场由无色无味硅胶制成。

1. 根据制造商对硅胶试剂盒的说明，以 1:10 的比例混合试剂 A 和试剂 B（参见 材料表）。确保通过搅拌将碳酸氢钠添加到混合物中，直到颜色变为白色。将混合物转移到干净的培养皿中，并将其置于40°C的烤箱中干燥48小时。
2. 将高清摄像机（参见 材料表）放在三脚架上，对其进行调整，使摄像机镜头垂直于二氧化硅竞技场的表面。调整相机的焦距和光圈，确保相机聚焦在二氧化硅表面，并且显示器被充分照亮。实验设置如图 1所示。
3. 将一只苍蝇转移到空旷的竞技场中，录制至少 61 秒的连续视频。
   注意:考虑到幼虫的缓慢性质，建议视频录制时间超过10分钟。
   1. 使用斐济打开视频，将进度条拖动到初始帧，然后默许。使用"手绘选择"工具选择苍蝇的整个身体（图2B，C）。
   2. 单击图像>调整>亮度和对比度以调整白平衡，直到所选区域的灰度值接近宽背景（图2D-F）。
      注意:第一帧的背景均匀化使软件能够在没有任何物体的情况下区分背景，并在苍蝇存在时创建对比度，从而允许软件跟踪它。
4. 在25°C和60%相对湿度的测试环境中进行整个实验，在安静且没有暴露在强光下的区域。

2. 视频录制和预处理

1. 使用95%二氧化碳（CO₂）进行短时间麻醉后，将苍蝇转移到露天竞技场，然后按相机应用程序上的录制按钮开始视频录制。
   注意:为了尽量减少麻醉剂对运动的影响，请在开始视频录制之前让苍蝇恢复 10 分钟。还建议通过冷却进行冷麻醉。
   1. 一旦苍蝇从麻醉中恢复过来，将装有苍蝇的竞技场盘放在相机下方，并快速左右摇晃板，以确保记录开始时苍蝇在运动。
2. 录制完成后，按 停止 按钮终止视频录制。
   注意:确保视频录制时间略微超过目标跟踪时间。此外，为了提高实验效率，可以自发地跟踪多只苍蝇。这取决于相机的分辨率，以实现高质量的视频裁剪。
3. 使用MJPEG编码将录制的视频转换为AVI格式，以便可以使用斐济打开和分析它们。同时，将视频的每秒帧数 （fps） 速率设置为成年苍蝇的 15 fps 和幼虫的 12 fps。

3. 视频分析

1. 打开已使用"使用虚拟堆栈"和"转换为灰度"转换的视频，这是使用斐济打开视频时弹出窗口中的两个选项（图2A）。
2. 如上所述，制作空白的第一帧。
3. 使用 AnimalTracker 插件的"设置活动图像"工具获取处理窗口，并使用"椭圆形"工具在原始视频窗口中创建一个环绕竞技场的跟踪区域（图 3A）。
4. 为处理窗口中的第一个空白帧设置过滤器（图3A，3）和两个过滤器的参数（图4A-G）。然后，选择原始视频窗口中的下一帧，并选择处理窗口的过滤表面（图 5A-C）。
   注意:滤波步骤用于减少图像噪声和/或去除背景，从而在帧的二值化中更轻松地将前景与背景分开。
5. 选择过滤后的处理窗口后，使用"设置阈值"工具转动具有处理窗口中覆盖的红色轮廓的跟踪苍蝇（图 3A、4、图 5D-E 和图 6A）。
6. 使用"设置斑点检测器"让计算机识别处理窗口中覆盖的红色轮廓的苍蝇（图 3A、5 和图 6B）。
7. 将第 901 帧设置为成年苍蝇的最后一帧，由视频的录制持续时间和 fps 计算（图 3A、6、图 6C）。
   注意:以下幼虫实验已被跟踪 10 分钟，因此将帧 7200 设置为最后一帧。
8. 使用"显示斑点"工具在原始视频窗口中显示跟踪矩形（图 3A、7 和图 6D，E）。然后，开始跟踪并在监控完成后导出跟踪文件（图 3A、8、9 和图 7A，B）。

4. 跟踪文件分析

1. 使用 动物跟踪器>跟踪分析器插件加载跟踪和 区域文件（图 8A）。
2. 使用区域设置选择所需的索引并更改参数设置（图 8）。使用帧速率计算帧间隔的时间。
   注意:在这种情况下，帧速率为 15 fps，帧间隔约为 0.067 s，这是默认设置（图 8D）。
3. 在跟踪分析仪中进行分析后，使用电子表格软件和GraphPad Prism生成定量分析图表（图9）。

5. 每帧分析

1. 按帧间隔执行速度分析。如果需要更详细的研究，请在没有斐济的情况下分析轨迹文件。
   1. 打开跟踪文件，将所有坐标复制到 Office Excel Microsoft并使用空格键拆分单元格。
      注意:例如，一旦文件被划分为"C"和"D"列，果 蝇 每帧间隔的速度由公式 SQRT（（C5-C4）^2+（D5-D4）^2）计算，如"E"列所示（图10A）。"E"列中的数据表示苍蝇在两帧之间移动的像素数，不考虑第一帧。选择所有计算结果并插入折线图以显示每帧间隔的直观飞行移动速度，并在折线图上显示峰值（图 10B）。
2. 计算每帧间隔的静止时间。将文件拆分为"C"和"D"列后，使用公式IF（SQRT（（C6-C5）^2+（D6-D5）^2）<20，0，1）计算果蝇每帧间隔的不动状态，该公式显示在"E"列中。（图10C）。
   注意: 与速度分析不同，定义了第一帧的结果。移动小于20像素的苍蝇被认为是不动的，并在"E"列中记录为"0"。
   1. 选择所有计算结果并插入柱形图，以通过整个柱形图的边距直观地显示静止时间（图10D）。
3. 确保方向角度发生变化。
   注意:方向变化角度分析代表苍蝇的方向选择。将文件拆分为"C"和"D"列后，方向变化的角度由公式 ACOS（（（SQRT（（（C7-C6）^2+（D7-D6）^2））^2+（SQRT（（C6-C5）^2+（D6-D5）^2））^2-（SQRT（（C7-C5）^2+（D7-D5）^2））^2）/（2*SQRT（（C6-C5）^2+（D6-D5）^2））*（ SQRT（（C7-C6）^2+（D7-D6）^2）））*180/PI（），显示在"E"列中（图 10E）。计算结果表示三个坐标之间的角度。
   1. 选择所有计算结果并插入散点图以说明苍蝇运动的方向变化角度（图10F）。

结果

在本研究中，检查了用鱼藤酮处理的成蝇和第三龄幼虫的运动缺陷，并将其运动活性与用药物溶剂二甲基亚砜（DMSO）喂养的对照苍蝇的运动活性进行了比较。在果蝇中使用鱼藤酮治疗已被证明会导致大脑中的多巴胺能神经元丢失²²并导致显着的运动缺陷²³。如图11和图12所示，与喂食DMSO的对照苍蝇相比，用鱼藤...

讨论

我们设计了一种基于与斐济图像处理程序兼容的开源材料 AnimalTracker API的方法，该方法可以使研究人员通过跟踪成年和个体幼蝇来系统地评估运动活动。 AnimalTracke 是用Java编写的工具，可以很容易地集成到现有的数据库或其他工具中，以促进对应用程序设计的动物跟踪行为的分析²⁴。通过量化成虫和幼虫运动活动的软件计算公式逐帧分析，可以灵活分析几个参数，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal tracker	Hungarian Brain Research Program	version: 1.7	pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads
Camera software	Microsoft	version: 2021.105.10.0	built-in windows 10 system
Computer	DELL	Vostro-14-5480	a comupter running win 10 system is available
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation	Wu han Yihong technology	#YHDFPCO2-018	official website: http://www.yhkjwh.com/
Fiji software	Fiji team	version: 1.53v	official website: https://fiji.sc/
Format factory software	Pcfreetime	version: X64 5.4.5	official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html
Graph pad prism	GraphPad Software	version: 8.0.2	official website: https://www.graphpad-prism.cn
Hight definition camera	TTQ	Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm)	official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35
Office software	Microsoft	version: office 2019	official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office
Petri dish	Bkman	110301003	size: 60 mm
Silica gel	DOW	SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Mix well according to the instructions
Sodium bicarbonate	Macklin	#144-55-8	Mix well with silica gel