Eine einfache Technik zur Bestimmung der lokomotorischen Aktivität in Drosophila

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll bewertet die Bewegungsaktivität von Drosophila , indem es die Bewegung von Fliegen in einer handgefertigten Arena unter Verwendung der Open-Source-Software Fidschi verfolgt und analysiert, die mit Plugins kompatibel ist, um Pixel jedes Frames basierend auf hochauflösenden Videoaufzeichnungen zu segmentieren, um Parameter wie Geschwindigkeit, Entfernung usw. zu berechnen.

Zusammenfassung

Drosophila melanogaster ist aufgrund seiner Fülle an fortschrittlichen genetischen Manipulationstechniken und vielfältigen Verhaltensmerkmalen ein idealer Modellorganismus für die Erforschung verschiedener Krankheiten. Die Identifizierung von Verhaltensstörungen in Tiermodellen ist ein entscheidendes Maß für den Schweregrad der Erkrankung, zum Beispiel bei neurodegenerativen Erkrankungen, bei denen Patienten häufig Beeinträchtigungen der Motorik erfahren. Mit der Verfügbarkeit verschiedener Systeme zur Verfolgung und Bewertung motorischer Defizite in Fliegenmodellen, wie z. B. medikamentös behandelten oder transgenen Individuen, fehlt jedoch noch ein wirtschaftliches und benutzerfreundliches System zur präzisen Auswertung aus mehreren Blickwinkeln. Hier wird eine Methode entwickelt, die auf dem Application-Programming Interface (API) AnimalTracker basiert und mit dem Fidschi-Bildverarbeitungsprogramm kompatibel ist, um die Bewegungsaktivitäten sowohl adulter als auch larvaler Individuen aus aufgezeichneten Videos systematisch auszuwerten und so deren Tracking-Verhalten zu analysieren. Diese Methode erfordert nur eine hochauflösende Kamera und eine Hardwareintegration für Computerperipheriegeräte, um das Verhalten aufzuzeichnen und zu analysieren, was sie zu einem erschwinglichen und effektiven Ansatz für das Screening von Fliegenmodellen mit transgenen oder umweltbedingten Verhaltensmängeln macht. Beispiele für Verhaltenstests mit pharmakologisch behandelten Fliegen werden gegeben, um zu zeigen, wie die Techniken Verhaltensänderungen sowohl bei erwachsenen Fliegen als auch bei Larven auf hochgradig wiederholbare Weise erkennen können.

Einleitung

Drosophila melanogaster ist ein hervorragender Modellorganismus für die Untersuchung zellulärer und molekularer Funktionen in neuronalen Krankheitsmodellen, die durch Genmodifikation¹, medikamentöse Behandlung² und Seneszenz³ entstanden sind. Die hohe Erhaltung biologischer Signalwege, physikalischer Eigenschaften und krankheitsassoziierter Homologgene zwischen Mensch und Drosophila macht die Fruchtfliege zu einem idealen Nachahmer von der molekularen bis zur Verhaltensebene⁴. In vielen Krankheitsmodellen ist die Verhaltensschwäche ein wichtiger Index, der ein hilfreiches Modell für verschiedene menschliche Neuropathien darstellt ^5,6. Drosophila wird heute verwendet, um mehrere menschliche Krankheiten, die neurologische Entwicklung und neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson und amyotrophe Lateralsklerose zu untersuchen ^7,8. Die Detektion der motorischen Fähigkeiten der Krankheitsmodelle ist entscheidend für das Verständnis des pathogenen Verlaufs und könnte eine phänotypische Korrelation zu den molekularen Mechanismen liefern, die dem Krankheitsprozess zugrunde liegen.

In jüngster Zeit wurden kommerziell erhältliche Software-Tools und kostengünstige Programme für Strategien zur Detektion des Bewegungsapparates von Drosophila entwickelt, wie z. B. Hochdurchsatztests in gruppierten Fliegen^9,10 und Messungen der Fortbewegung in Echtzeit^11,12. Ein solcher konventioneller Ansatz ist die schnelle interaktive negative Geotaxis (RING), auch Kletterassay genannt, der mehrere Kanäle umfasst, die es ermöglichen, eine große Fliegenpopulation mit gleichem Geschlecht und Alter einzudämmen, wodurch die Variation reduziert wird, während die Daten gesammelt werden ^9,13. Ein weiteres Vortestverfahren zur Analyse des Bewegungsverhaltens ist der TriKinetics Drosophila Activity Monitor (DAM), eine Vorrichtung, die mehrere Strahlen verwendet, um die Bewegung der Fliegenaktivität innerhalb eines dünnen Glasröhrchens¹⁴ zu erfassen. Die Vorrichtung zeichnet kontinuierlich die Position auf, die eine automatisierte Fortbewegung darstellt, indem die Strahlkreuzungen berechnet werden, um die Aktivität und den circadianen Rhythmus von Fliegen über einen längeren Zeitraum zu untersuchen¹⁵. Obwohl diese Methoden bei der Analyse von Verhaltensfehlern bei Fruchtfliegen weit verbreitet sind, um Veränderungen in der Verhaltensfortbewegung zu bestimmen, erfordern sie immer spezielle Testgeräte oder komplexe Analyseprozesse und schränken ihre Anwendung in einigen Modellen mit einem begrenzten, einfachen Gerät ein. Gruppenbasierte Strategien zur Tierverfolgung zum Testen der adulten Drosophila, wie z. B. FlyGrAM¹¹ und der Drosophila Island Assay¹⁰, implementieren soziale Rekrutierung und individuelles Tracking in einem vordefinierten Bereich. Nichtsdestotrotz können sich soziale individuelle Einschränkungen in benachteiligten Gebieten negativ auf die Identifizierung in den Bildern auswirken, verursacht durch die Kollision oder Überlappung von Fliegen. Auch wenn einige materialbasierte Open-Source-Methoden wie TRex¹⁶, MARGO 12 und FlyPi¹⁷ einen Notfall haben, können sie die Fliegen mit flexiblem Einsatz in Verhaltenstests schnell verfolgen. Diese Testansätze sind mit aufwendigen Versuchsapparaturen, speziellen Softwareanforderungen oder professionellen Computersprachen verbunden. Bei Larven sind die Messung der Gesamtstrecke, die über die Anzahl der Gitterbegrenzungslinien pro Zeiteinheit¹⁸ zurückgelegt wird, oder die grobe Zählung der Körperwandkontraktionen für Individuen¹⁹ die vorherrschenden Methoden zur Beurteilung ihrer Bewegungsfähigkeit. Aufgrund der mangelnden Präzision von Geräten oder Vorrichtungen und Analysemethoden kann es vorkommen, dass einige Verhaltensbewegungen von Larven nicht entdeckt werden, was es schwierig macht, Verhaltensbewegungen, insbesondere feine Bewegungen, genau zu beurteilen¹⁵.

Die hier entwickelte Methode nutzt die AnimalTracker-Programmierschnittstelle (API), die mit dem Fidschi-Bildverarbeitungsprogramm (ImageJ) kompatibel ist, um die Bewegungsaktivität sowohl von adulten als auch von Larvenfliegen systematisch zu bewerten, indem ihr Tracking-Verhalten aus hochauflösenden (HD) Videos analysiert wird. Fiji ist eine Open-Source-Software-ImageJ-Distribution, die robuste Softwarebibliotheken mit zahlreichen Skriptsprachen kombinieren kann, was zu einem schnellen Prototyping von Bildverarbeitungsalgorithmen führt, was sie bei Biologen wegen ihrer Bildanalysefunktionen beliebt macht²⁰. Im aktuellen Ansatz wird die Integration von Fidschi in die AnimalTracker-API genutzt, um einen einzigartigen Drosophila-Verhaltensassay mit personalisierter Algorithmus-Einfügung zu entwickeln, und bietet einen nützlichen Schritt für detaillierte Dokumentationen und Tutorials, um robuste analytische Fähigkeiten des Bewegungsverhaltens zu unterstützen (Abbildung 1). Um die Komplikation der objektiven Identifizierung in den Bildern zu umgehen, die durch die Kollision oder Überlappung von Fliegen verursacht wird, ist jede Arena darauf beschränkt, nur eine Fliege zu beherbergen. Nach der Bewertung der Tracking-Präzision des Ansatzes wurde er implementiert, um die Bewegungsbewegungen von Drosophila zu verfolgen und zu quantifizieren, die mit dem toxischen Medikament Rotenon verabreicht wurden, das im Allgemeinen für Tiermodelle der Parkinson-Krankheit verwendet wird, und schließlich eine Beeinträchtigung der Fortbewegung in der medikamentösen Behandlung entdeckte²¹. Diese Methodik, die Open-Source- und freie Software verwendet, erfordert keine kostspieligen Instrumente und kann die Verhaltensbewegung von Drosophila präzise und reproduzierbar analysieren.

Protokoll

Für die vorliegende Studie wurden W¹¹¹⁸ adulte Fliegen und Larven im dritten Stadium verwendet.

1. Versuchsvorbereitung

HINWEIS: Eine Freilandarena für die Fortbewegungsverfolgung von Drosophila besteht aus einem farb- und geruchlosen Kieselgel.

1. Mischen Sie Reagenz A und Reagenz B im Verhältnis 1:10 gemäß den Anweisungen des Herstellers für das Kieselsäure-Kit (siehe Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass der Mischung Natriumbicarbonat durch Rühren zugesetzt wird, bis die Farbe weiß wird. Die Mischung in eine saubere Petrischale geben und bei 40 °C zum Trocknen für 48 Stunden in den Ofen stellen.
2. Stellen Sie die HD-Kamera (siehe Materialtabelle) auf ein Stativ und stellen Sie sie so ein, dass das Kameraobjektiv senkrecht zur Oberfläche der Siliziumdioxidarena steht. Stellen Sie durch Einstellen der Brennweite und der Blendenöffnungen der Kamera sicher, dass die Kamera auf die Oberfläche des Siliziumdioxids fokussiert ist und das Display ausreichend beleuchtet ist. Der Versuchsaufbau ist in Abbildung 1 dargestellt.
3. Bringen Sie eine Fliege in die Freilandarena, um ein kontinuierliches Video von mindestens 61 s aufzunehmen.
   HINWEIS: In Anbetracht der Trägheit der Larven wird eine Videoaufnahmezeit von mehr als 10 Minuten empfohlen.
   1. Öffnen Sie das Video mit Fidschi, ziehen Sie den Fortschrittsbalken auf das erste Bild und stimmen Sie stillschweigend zu. Wählen Sie den gesamten Körper der Fliege mit dem Werkzeug "Freihandauswahl" aus (Abbildung 2B, C).
   2. Klicken Sie auf das Bild > passen Sie > Helligkeit und Kontrast an, um den Weißabgleich anzupassen, bis sich der Grauwert des ausgewählten Bereichs dem breiten Hintergrund nähert (Abbildung 2D-F).
      HINWEIS: Die Hintergrundhomogenisierung des ersten Frames ermöglicht es der Software, den Hintergrund ohne Objekte zu unterscheiden und einen Kontrast zu erzeugen, wenn eine Fliege vorhanden ist, sodass die Software sie verfolgen kann.
4. Führen Sie das gesamte Experiment in einer Testumgebung mit 25 °C und 60 % relativer Luftfeuchtigkeit in einem ruhigen Bereich durch, der keinem hellen Licht ausgesetzt ist.

2. Videoaufzeichnung und -vorverarbeitung

1. Nach einer kurzen Narkosezeit mit 95 % Kohlendioxid (CO₂₎ bringen Sie eine Fliege in die offene Arena und drücken Sie die Aufnahmetaste an der Kameraanwendung, um die Videoaufnahme zu starten.
   Anmerkungen: Um die Wirkung des Anästhetikums auf die Fortbewegung zu minimieren, lassen Sie die Fliegen 10 Minuten lang sich erholen, bevor Sie mit der Videoaufzeichnung beginnen. Eine kühle Betäubung durch Kühlung wird ebenfalls empfohlen.
   1. Sobald sich die Fliegen von der Narkose erholt haben, stellen Sie die Arenaschale mit der Fliege unter die Kamera und schütteln Sie die Platte schnell von einer Seite zur anderen, um sicherzustellen, dass die Fliege in Bewegung ist, wenn die Aufnahme beginnt.
2. Drücken Sie nach Abschluss der Aufnahme die Stopp-Taste , um die Videoaufnahme zu beenden.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Videoaufzeichnungszeit die Zielverfolgungszeit geringfügig überschreitet. Um die experimentelle Effizienz zu verbessern, ist es außerdem möglich, mehrere Fliegen spontan zu verfolgen. Dies hängt von der Auflösung der Kamera ab, um einen qualitativ hochwertigen Videoausschnitt zu ermöglichen.
3. Konvertieren Sie die aufgenommenen Videos in das AVI-Format mit MJPEG-Kodierung, damit sie mit Fidschi geöffnet und analysiert werden können. Stellen Sie in der Zwischenzeit die Bildrate pro Sekunde (fps) des Videos auf 15 fps für erwachsene Fliegen und 12 fps für Larven ein.

3. Videoanalyse

1. Öffnen Sie das Video, das transformiert wurde, mit "Virtuellen Stapel verwenden" und "In Graustufen konvertieren", zwei Optionen im Popup-Fenster, wenn Sie das Video mit Fidschi öffnen (Abbildung 2A).
2. Erstellen Sie einen leeren ersten Frame, wie oben erwähnt.
3. Erhalten Sie ein Verarbeitungsfenster, indem Sie das Werkzeug "Aktives Bild setzen" des AnimalTracker-Plugins verwenden, und erstellen Sie mit dem Werkzeug "Oval" einen Tracking-Bereich, der die Arena im ursprünglichen Videofenster umkreist (Abbildung 3A).
4. Stellen Sie die Filter (Abbildung 3A,3) und die Parameter der beiden Filter (Abbildung 4A-G) für das erste leere Bild im Verarbeitungsfenster ein. Wählen Sie dann das nächste Bild im ursprünglichen Videofenster aus und wählen Sie die gefilterte Oberfläche des Verarbeitungsfensters aus (Abbildung 5A-C).
   HINWEIS: Der Filterschritt dient dazu, das Bildrauschen zu verringern und/oder den Hintergrund zu entfernen, wodurch es einfacher wird, den Vordergrund beim Binarisieren der Frames vom Hintergrund zu trennen.
5. Sobald ein gefiltertes Verarbeitungsfenster ausgewählt ist, drehen Sie die verfolgte Fliege mit einem roten Profil, das im Verarbeitungsfenster verdeckt ist, indem Sie das Werkzeug "Schwellenwert festlegen" verwenden (Abbildung 3A, 4, Abbildung 5D-E und Abbildung 6A).
6. Verwenden Sie den "set blob-detector", damit der Computer die Fliege mit einem roten Profil erkennen kann, das im Verarbeitungsfenster abgedeckt ist (Abbildung 3A, 5 und Abbildung 6B).
7. Legen Sie Frame 901 als letztes Frame für die erwachsene Fliege fest, berechnet anhand der Aufnahmedauer und der fps des Videos (Abbildung 3A,6, Abbildung 6C).
   HINWEIS: Das folgende Experiment mit Larven wurde 10 Minuten lang verfolgt, daher ist Frame 7200 als letzter Frame festgelegt.
8. Verwenden Sie das Werkzeug "Blobs anzeigen", um ein Tracking-Rechteck im ursprünglichen Videofenster darzustellen (Abbildung 3A,7 und Abbildung 6D,E). Starten Sie dann das Tracking und exportieren Sie die Tracking-Datei, nachdem die Überwachung abgeschlossen ist (Abbildung 3A,8,9 und Abbildung 7A,B).

4. Tracking-Dateianalyse

1. Laden Sie die Track- und Zonendateien mit dem Animal Tracker > Tracking Analyzer-Plug-in (Abbildung 8A).
2. Wählen Sie den gewünschten Index mithilfe der Zoneneinstellungen aus und ändern Sie die Parametereinstellungen (Abbildung 8). Berechnen Sie die Zeit des Frame-Intervalls anhand der Framerate.
   HINWEIS: In diesem Zustand beträgt die Bildrate 15 fps und das Bildintervall beträgt ca. 0,067 s, was der Standardeinstellung entspricht (Abbildung 8D).
3. Erstellen Sie die quantitativen Analysediagramme mit der Tabellenkalkulationssoftware und GraphPad Prism, nachdem sie im Tracking Analyzer analysiert wurden (Abbildung 9).

5. Analyse pro Frame

1. Führen Sie eine Geschwindigkeitsanalyse pro Frame-Intervall durch. Analysieren Sie die Track-Datei ohne Fidschi, wenn eine detailliertere Recherche erforderlich ist.
   1. Öffnen Sie die Track-Datei, kopieren Sie alle Koordinaten in Microsoft Office Excel, und teilen Sie die Zellen mit der Leertaste.
      HINWEIS: Wenn die Datei beispielsweise in die Spalten "C" und "D" unterteilt wurde, wird die Geschwindigkeit von Drosophila pro Frame-Intervall mit der Formel SQRT((C5-C4)^ 2+(D5-D4)^2) berechnet, die in der Spalte "E" angezeigt wird (Abbildung 10A). Die Daten in Spalte "E" geben die Anzahl der Pixel an, die die Fliege zwischen zwei Frames bewegt hat, wobei der erste Frame nicht berücksichtigt wird. Wählen Sie alle berechneten Ergebnisse aus und fügen Sie ein Liniendiagramm ein, um eine intuitive Flugbewegungsgeschwindigkeit pro Frame-Intervall mit einem Peak auf dem Liniendiagramm anzuzeigen (Abbildung 10B).
2. Berechnen Sie die Immobilitätszeit pro Frame-Intervall. Nachdem die Datei in die Spalten "C" und "D" aufgeteilt wurde, berechnen Sie den Immobilitätsstatus von Drosophila pro Frame-Intervall mit der Formel IF(SQRT((C6-C5)^ 2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), die in der Spalte "E" angezeigt wird. (Abbildung 10C).
   HINWEIS: Im Gegensatz zur Geschwindigkeitsanalyse wurden die Ergebnisse des ersten Frames definiert. Fliegen, die sich weniger als 20 Pixel bewegten, galten als unbeweglich und wurden als "0" in Spalte "E" aufgezeichnet.
   1. Wählen Sie alle berechneten Ergebnisse aus, und fügen Sie ein Säulendiagramm ein, um die Immobilitätszeit am Rand des gesamten Säulendiagramms visuell darzustellen (Abbildung 10D).
3. Stellen Sie sicher, dass sich der Richtungswinkel ändert.
   HINWEIS: Die Analyse des Richtungswinkels stellt die Richtungswahl der Fliegen dar. Nachdem die Datei in die Spalten "C" und "D" aufgeteilt wurde, wird der Winkel der Richtungsänderung mit der Formel ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*(SQRT((C7-C6)^ 2+(D7-D6)^2)))*180/PI(), die in der Spalte "E" dargestellt ist (Abbildung 10E). Die berechneten Ergebnisse geben den Winkel zwischen drei Koordinaten an.
   1. Wählen Sie alle berechneten Ergebnisse aus und fügen Sie ein Streudiagramm ein, um den Winkel der Richtungsänderung der Fliegenbewegung zu veranschaulichen (Abbildung 10F).

Ergebnisse

In der vorliegenden Arbeit wurden lokomotorische Defizite bei adulten Fliegen und Larven im dritten Stadium, die mit Rotenon behandelt wurden, untersucht und in ihrer motorischen Aktivität mit der einer Kontrollfliege verglichen, die mit dem Wirkstofflösungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) gefüttert wurde. Es hat sich gezeigt, dass die Behandlung mit Rotenon bei Drosophila zu einem Verlust von dopaminergen Neuronen im Gehirn führt²² und zu signifikanten lokomotorischen Defiziten

Diskussion

Wir haben eine Methode entwickelt, die auf dem Open-Source-Material AnimalTracker API basiert, das mit dem Fidschi-Bildverarbeitungsprogramm kompatibel ist und es Forschern ermöglicht, die Bewegungsaktivität systematisch zu bewerten, indem sie sowohl erwachsene als auch einzelne Larvenfliegen verfolgen. AnimalTracke ist ein in Java geschriebenes Tool, das sich leicht in bestehende Datenbanken oder andere Tools integrieren lässt, um die Analyse des von der Anwendung entworfenen Tierverfolgungsverhalte...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal tracker	Hungarian Brain Research Program	version: 1.7	pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads
Camera software	Microsoft	version: 2021.105.10.0	built-in windows 10 system
Computer	DELL	Vostro-14-5480	a comupter running win 10 system is available
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation	Wu han Yihong technology	#YHDFPCO2-018	official website: http://www.yhkjwh.com/
Fiji software	Fiji team	version: 1.53v	official website: https://fiji.sc/
Format factory software	Pcfreetime	version: X64 5.4.5	official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html
Graph pad prism	GraphPad Software	version: 8.0.2	official website: https://www.graphpad-prism.cn
Hight definition camera	TTQ	Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm)	official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35
Office software	Microsoft	version: office 2019	official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office
Petri dish	Bkman	110301003	size: 60 mm
Silica gel	DOW	SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Mix well according to the instructions
Sodium bicarbonate	Macklin	#144-55-8	Mix well with silica gel