Una técnica simple para evaluar la actividad locomotora en Drosophila

Resumen

El presente protocolo evalúa la actividad locomotora de Drosophila mediante el seguimiento y análisis del movimiento de las moscas en una arena hecha a mano utilizando el software de código abierto Fiji, compatible con plugins para segmentar píxeles de cada fotograma basado en grabación de vídeo de alta definición para calcular parámetros de velocidad, distancia, etc.

Resumen

Drosophila melanogaster es un organismo modelo ideal para estudiar diversas enfermedades debido a su abundancia de técnicas avanzadas de manipulación genética y diversas características de comportamiento. La identificación de la deficiencia de comportamiento en modelos animales es una medida crucial de la gravedad de la enfermedad, por ejemplo, en enfermedades neurodegenerativas donde los pacientes a menudo experimentan deficiencias en la función motora. Sin embargo, con la disponibilidad de varios sistemas para rastrear y evaluar los déficits motores en modelos de moscas, como individuos tratados con drogas o transgénicos, todavía falta un sistema económico y fácil de usar para una evaluación precisa desde múltiples ángulos. Aquí se desarrolla un método basado en la interfaz de programación de aplicaciones (API) AnimalTracker , que es compatible con el programa de procesamiento de imágenes de Fiji, para evaluar sistemáticamente las actividades de movimiento de individuos adultos y larvales a partir de video grabado, lo que permite el análisis de su comportamiento de rastreo. Este método requiere solo una cámara de alta definición y una integración de hardware periférico de computadora para registrar y analizar el comportamiento, lo que lo convierte en un enfoque asequible y efectivo para detectar modelos de moscas con deficiencias de comportamiento transgénicas o ambientales. Se dan ejemplos de pruebas de comportamiento con moscas tratadas farmacológicamente para mostrar cómo las técnicas pueden detectar cambios de comportamiento tanto en moscas adultas como en larvas de una manera altamente repetible.

Introducción

Drosophila melanogaster proporciona un excelente organismo modelo para investigar las funciones celulares y moleculares en modelos de enfermedades neuronales creados por modificación génica¹, tratamiento farmacológico² y senescencia³. La alta conservación de las vías biológicas, las propiedades físicas y los genes homólogos asociados a enfermedades entre los humanos y Drosophila hacen que la mosca de la fruta sea una imitación ideal desde el nivel molecular hasta el nivel de comportamiento⁴. En muchos modelos de enfermedad, la deficiencia conductual es un índice importante, proporcionando un modelo útil para diversas neuropatías humanas ^5,6. Drosophila ahora se utiliza para estudiar múltiples enfermedades humanas, neurodesarrollo y enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson y la esclerosis lateral amiotrófica ^7,8. La detección de la capacidad motora de los modelos de enfermedad es crucial para comprender el progreso patogénico y puede proporcionar una correlación fenotípica con los mecanismos moleculares subyacentes al proceso de la enfermedad.

Recientemente, se han desarrollado herramientas de software disponibles comercialmente y programas rentables para las estrategias de detección locomotora de Drosophila, como las pruebas de alto rendimiento en moscas agrupadas^9,10 y la medición de la locomoción en tiempo real^11,12. Uno de estos enfoques convencionales es la geotaxis negativa interactiva rápida (RING), también llamada ensayo de escalada, que incluye múltiples canales que permiten contener una gran población de moscas con el mismo sexo y edad, reduciendo la variación mientras se recopilan datos ^9,13. Otro método de prueba previa para analizar el comportamiento locomotor es el monitor de actividad TriKinetics Drosophila (DAM), un dispositivo que utiliza múltiples haces para detectar el movimiento de la actividad de la mosca dentro de un tubo de vidrio delgado¹⁴. El dispositivo registra la posición continuamente, lo que representa la locomoción automatizada mediante el cálculo de los cruces de haces para estudiar la actividad y el ritmo circadiano de las moscas durante un período de tiempo más largo¹⁵. Aunque estos métodos se han utilizado ampliamente en el análisis de defectos de comportamiento en moscas de la fruta para determinar cambios en la locomoción conductual, siempre requieren equipos de prueba especiales o procesos de análisis complejos, y restringen su aplicación en algunos modelos con un dispositivo limitado y simple. Las estrategias grupales de rastreo de animales para probar la Drosófila adulta, como FlyGrAM¹¹ y el ensayo de la isla Drosophila ¹⁰, implementan el reclutamiento social y el seguimiento individual en un área predefinida. Sin embargo, la restricción social individual en áreas desafiadas podría tener un efecto negativo en las identificaciones en las imágenes, causado por la colisión o superposición de moscas. Aunque algunos métodos basados en materiales de código abierto, como TRex¹⁶, MARGO 12 y FlyPi¹⁷, tienen una emergencia, pueden rastrear rápidamente las moscas con un uso flexible en las pruebas de comportamiento. Estos enfoques de prueba están asociados con instalaciones de aparatos experimentales elaborados, requisitos especiales de software o lenguajes informáticos profesionales. Para las larvas, medir la distancia total recorrida a través del número de líneas de borde de cuadrícula por unidad de tiempo¹⁸, o contar las contracciones de la pared corporal para individuos manualmente¹⁹, son los métodos predominantes para evaluar su capacidad locomotora. Debido a la falta de precisión en equipos o dispositivos y métodos de análisis, alguna locomoción conductual de las larvas podría escapar a la detección, lo que dificulta la evaluación precisa del movimiento conductual, especialmente el movimiento fino¹⁵.

El presente método desarrollado utiliza la interfaz de programación de aplicaciones (API) AnimalTracker , compatible con el programa de procesamiento de imágenes Fiji (ImageJ), para evaluar sistemáticamente la actividad locomotora de moscas adultas y larvales mediante el análisis de su comportamiento de seguimiento a partir de videos de alta definición (HD). Fiji es una distribución de software de código abierto ImageJ que puede combinar bibliotecas de software robustas con numerosos lenguajes de scripting, lo que resulta en la creación rápida de prototipos de algoritmos de procesamiento de imágenes, lo que la hace popular entre los biólogos por sus capacidades de análisis de imágenes²⁰. En el enfoque actual, la integración de Fiji en la API AnimalTracker se explota para desarrollar un ensayo de comportamiento único de Drosophila con inserción de algoritmo personalizado, y proporciona un paso útil para documentación detallada y tutoriales para respaldar capacidades analíticas sólidas del comportamiento locomotor (Figura 1). Para evitar la complicación de las identificaciones objetivas en las imágenes causadas por la colisión o superposición de moscas, cada arena está restringida a albergar solo una mosca. Al evaluar la precisión de seguimiento del enfoque, se implementó para rastrear y cuantificar los movimientos locomotores de Drosophila que fueron administrados con el fármaco tóxico rotenona, que generalmente se utiliza para modelos animales de la enfermedad de Parkinson, descubriendo finalmente el deterioro de la locomoción en el tratamiento farmacológico²¹. Esta metodología, que emplea software libre y de código abierto, no necesita instrumentación de alto costo y puede analizar de manera precisa y reproducible la locomoción conductual de Drosophila .

Protocolo

W¹¹¹⁸ moscas adultas y larvas del tercer estadio se utilizaron para el presente estudio.

1. Preparación experimental

NOTA: Una arena de campo abierto para el seguimiento de locomoción de Drosophila está hecha con un gel de sílice incoloro e inodoro.

1. Mezcle el reactivo A y el reactivo B en una proporción de 1:10, de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el kit de sílice (consulte la Tabla de materiales). Asegúrese de que se agregue bicarbonato de sodio a la mezcla revolviendo hasta que el color cambie a blanco. Transfiera la mezcla a una placa de Petri limpia y colóquela en un horno a 40 °C para secar durante 48 h.
2. Coloque la cámara HD (consulte Tabla de materiales) en un trípode, ajustándola para que la lente de la cámara sea perpendicular a la superficie de la arena de sílice. Ajustando la distancia focal y las aperturas de la cámara, asegúrese de que la cámara esté enfocada en la superficie de la sílice y que la pantalla esté adecuadamente iluminada. La configuración experimental se ilustra en la figura 1.
3. Transfiera una mosca a la arena de campo abierto para grabar un video continuo de al menos 61 s.
   NOTA: Teniendo en cuenta la naturaleza lenta de las larvas, se recomienda un tiempo de grabación de video de más de 10 minutos.
   1. Abra el video con Fiji, arrastre la barra de progreso al fotograma inicial y apruebe tácitamente. Elija todo el cuerpo de la mosca utilizando la herramienta "selección a mano alzada" (Figura 2B, C).
   2. Haga clic en la imagen > ajustar > brillo y contraste para ajustar el balance de blancos hasta que el valor de gris del área seleccionada se acerque al fondo amplio (Figura 2D-F).
      NOTA: La homogeneización del fondo del primer fotograma permite al software distinguir el fondo sin ningún objeto y crear un contraste cuando hay una mosca presente, lo que permite que el software la rastree.
4. Realice todo el experimento en un entorno de prueba establecido a 25 ° C y 60% de humedad relativa, en un área tranquila y sin exposición a la luz brillante.

2. Grabación y preprocesamiento de video

1. Después de un corto período de anestesia con 95% de dióxido de carbono (CO₂), transfiera una mosca a la arena abierta y presione el botón de grabación en la aplicación de la cámara para iniciar la grabación de video.
   NOTA: Para minimizar el efecto de la anestesia en la locomoción, permita que las moscas se recuperen durante 10 minutos antes de iniciar la grabación de video. También se recomienda anestesiar en frío por enfriamiento.
   1. Una vez que las moscas se recuperen de la anestesia, coloque el plato de arena que contiene la mosca debajo de la cámara y agite el plato rápidamente de lado a lado para asegurarse de que la mosca esté en movimiento cuando comience la grabación.
2. Al finalizar la grabación, presione el botón de parada para finalizar la grabación de video.
   NOTA: Asegúrese de que el tiempo de grabación de vídeo supere ligeramente el tiempo de seguimiento de destino por un pequeño margen. Además, para mejorar la eficiencia experimental, es posible rastrear múltiples moscas espontáneamente. Esto depende de la resolución de la cámara para permitir un recorte de video de alta calidad.
3. Convierta los videos grabados en formato AVI con codificación MJPEG, para que puedan abrirse y analizarse usando Fiji. Mientras tanto, establezca la velocidad de fotogramas por segundo (fps) del video en 15 fps para moscas adultas y 12 fps para larvas.

3. Análisis de vídeo

1. Abra el video que se ha transformado con "use virtual stack" y "convert to grayscale", dos opciones en la ventana emergente al abrir el video con Fiji (Figura 2A).
2. Haga un primer fotograma en blanco, como se mencionó anteriormente.
3. Obtenga una ventana de procesamiento utilizando la herramienta "establecer imagen activa" del complemento AnimalTracker y cree un área de seguimiento que rodee la arena en la ventana de video original usando la herramienta "ovalada" (Figura 3A).
4. Establezca los filtros (Figura 3A,3) y los parámetros de los dos filtros (Figura 4A-G) para el primer fotograma en blanco de la ventana de procesamiento. A continuación, seleccione el siguiente fotograma en la ventana de vídeo original y elija la superficie filtrada de la ventana de procesamiento (Figura 5A-C).
   NOTA: El paso de filtrado sirve para disminuir el ruido de la imagen y/o eliminar el fondo, lo que facilita la separación del primer plano del fondo en la binarización de los fotogramas.
5. Una vez seleccionada una ventana de procesamiento filtrada, gire la mosca rastreada con un perfil rojo cubierto en la ventana de procesamiento utilizando la herramienta "establecer umbral" (Figura 3A,4, Figura 5D-E y Figura 6A).
6. Use el "set blob-detector" para permitir que la computadora reconozca la mosca con un perfil rojo cubierto en la ventana de procesamiento (Figura 3A,5 y Figura 6B).
7. Establezca el fotograma 901 como el último fotograma para la mosca adulta, calculado por la duración de grabación del video y los fps (Figura 3A,6, Figura 6C).
   NOTA: El siguiente experimento con larvas se ha rastreado durante 10 minutos, por lo que el fotograma 7200 se establece como el último fotograma.
8. Utilice la herramienta "mostrar blobs" para presentar un rectángulo de seguimiento en la ventana de vídeo original (Figura 3A,7 y Figura 6D,E). Luego, inicie el seguimiento y exporte el archivo de seguimiento después de que se complete el monitoreo (Figura 3A,8,9 y Figura 7A,B).

4. Análisis de archivos de seguimiento

1. Cargue los archivos de seguimiento y zona utilizando el complemento Animal tracker > Tracking analyzer (Figura 8A).
2. Seleccione el índice deseado utilizando la configuración de zona y modifique la configuración de los parámetros (Figura 8). Calcule el tiempo del intervalo de fotogramas utilizando la velocidad de fotogramas.
   NOTA: En esta condición, la velocidad de fotogramas es de 15 fps y el intervalo de fotogramas es de aproximadamente 0,067 s, que es la configuración predeterminada (Figura 8D).
3. Produzca los gráficos de análisis cuantitativo utilizando el software de hoja de cálculo y GraphPad Prism después de ser analizados en el analizador de seguimiento (Figura 9).

5. Análisis por fotograma

1. Realice análisis de velocidad por intervalo de fotogramas. Analice el archivo de seguimiento sin Fiji si se necesita una investigación más detallada.
   1. Abra el archivo de pista, copie todas las coordenadas en Microsoft Office Excel y divida las celdas con la tecla de espacio.
      NOTA: Por ejemplo, una vez que el archivo se ha dividido en columnas "C" y "D", la velocidad de Drosophila por intervalo de fotogramas se calcula mediante la fórmula SQRT((C5-C4)^2+(D5-D4)^2), que se muestra en la columna "E" (Figura 10A). Los datos de la columna "E" indican el número de píxeles que la mosca movió entre dos fotogramas, sin tener en cuenta el primer fotograma. Seleccione todos los resultados calculados e inserte un gráfico de líneas para mostrar una velocidad de movimiento de vuelo intuitiva por intervalo de cuadro, con un pico en el gráfico de líneas (Figura 10B).
2. Calcule el tiempo de inmovilidad por intervalo de fotogramas. Después de dividir el archivo en columnas "C" y "D", calcule el estado de inmovilidad de Drosophila por intervalo de fotogramas utilizando la fórmula IF(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), que se muestra en la columna "E". (Figura 10C).
   NOTA: A diferencia del análisis de velocidad, se definieron los resultados del primer fotograma. Las moscas que se movían menos de 20 píxeles se consideraban inmóviles y se registraban como "0" en la columna "E".
   1. Seleccione todos los resultados calculados e inserte un gráfico de columnas para mostrar visualmente el tiempo de inmovilidad por el margen de todo el gráfico de columnas (Figura 10D).
3. Asegúrese de que el ángulo de dirección cambia.
   NOTA: El análisis de cambio de ángulo de dirección representa la elección de dirección de las moscas. Una vez que el archivo se ha dividido en columnas "C" y "D", el ángulo de cambio de dirección se calcula mediante la fórmula ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2)))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*( SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))))*180/PI(), que se presenta en la columna "E" (Figura 10E). Los resultados calculados indican el ángulo entre tres coordenadas.
   1. Seleccione todos los resultados calculados e inserte un diagrama de dispersión para ilustrar el ángulo de cambio de dirección del movimiento de las moscas (Figura 10F).

Resultados

En el presente estudio, se examinaron los déficits locomotores en moscas adultas y larvas de tercer estadio tratadas con rotenona y se compararon en su actividad motora con la de una mosca control alimentada con el disolvente dimetilsulfóxido (DMSO). Se ha demostrado que el tratamiento con rotenona en Drosophila causa pérdida de neuronas dopaminérgicas en el cerebro²² y conduce a déficits locomotores significativos²³. Como se muestra en la Figura

Discusión

Hemos diseñado un método, basado en el material de código abierto AnimalTracker API compatible con el programa de procesamiento de imágenes de Fiji, que puede permitir a los investigadores evaluar sistemáticamente la actividad locomotora mediante el seguimiento de larvas adultas e individuales. AnimalTracke es una herramienta escrita en Java que puede integrarse fácilmente en bases de datos existentes u otras herramientas para facilitar el análisis del comportamiento de seguimiento de animales di...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal tracker	Hungarian Brain Research Program	version: 1.7	pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads
Camera software	Microsoft	version: 2021.105.10.0	built-in windows 10 system
Computer	DELL	Vostro-14-5480	a comupter running win 10 system is available
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation	Wu han Yihong technology	#YHDFPCO2-018	official website: http://www.yhkjwh.com/
Fiji software	Fiji team	version: 1.53v	official website: https://fiji.sc/
Format factory software	Pcfreetime	version: X64 5.4.5	official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html
Graph pad prism	GraphPad Software	version: 8.0.2	official website: https://www.graphpad-prism.cn
Hight definition camera	TTQ	Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm)	official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35
Office software	Microsoft	version: office 2019	official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office
Petri dish	Bkman	110301003	size: 60 mm
Silica gel	DOW	SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Mix well according to the instructions
Sodium bicarbonate	Macklin	#144-55-8	Mix well with silica gel