Drosophila'da Lokomotor Aktiviteyi Test Etmek İçin Basit Bir Teknik

Özet

Mevcut protokol, Drosophila'nın lokomotor aktivitesini, hız, mesafe vb. parametreleri hesaplamak için yüksek tanımlı video kaydına dayalı olarak her karenin piksellerini segmentlere ayırmak için eklentilerle uyumlu açık kaynaklı yazılım Fiji'yi kullanarak el yapımı bir arenada sineklerin hareketini izleyerek ve analiz ederek değerlendirir.

Özet

Drosophila melanogaster , gelişmiş genetik manipülasyon tekniklerinin bolluğu ve çeşitli davranışsal özellikleri nedeniyle çeşitli hastalıkları incelemek için ideal bir model organizmadır. Hayvan modellerinde davranışsal eksikliğin belirlenmesi, örneğin hastaların sıklıkla motor fonksiyonlarında bozulmalar yaşadığı nörodejeneratif hastalıklarda, hastalık şiddetinin çok önemli bir ölçüsüdür. Bununla birlikte, ilaçla tedavi edilen veya transgenik bireyler gibi sinek modellerinde motor açıklarını izlemek ve değerlendirmek için çeşitli sistemlerin mevcudiyeti ile, birden fazla açıdan hassas değerlendirme için ekonomik ve kullanıcı dostu bir sistem hala eksiktir. Burada, hem yetişkin hem de larva bireylerinin hareket aktivitelerini kayıtlı videodan sistematik olarak değerlendirmek ve böylece izleme davranışlarının analizine izin vermek için Fiji görüntü işleme programı ile uyumlu olan AnimalTracker uygulama programlama arayüzüne (API) dayanan bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntem, davranışı kaydetmek ve analiz etmek için yalnızca yüksek çözünürlüklü bir kamera ve bir bilgisayar çevre birimi donanım entegrasyonu gerektirir, bu da onu transgenik veya çevresel davranış eksiklikleri olan sinek modellerini taramak için uygun fiyatlı ve etkili bir yaklaşım haline getirir. Farmakolojik olarak tedavi edilen sinekleri kullanan davranış testlerine örnekler, tekniklerin hem yetişkin sineklerde hem de larvalarda davranış değişikliklerini oldukça tekrarlanabilir bir şekilde nasıl tespit edebileceğini göstermek için verilmiştir.

Giriş

Drosophila melanogaster, gen modifikasyonu¹, ilaç tedavisi² ve yaşlanma³ tarafından oluşturulan nöronal hastalık modellerinde hücresel ve moleküler fonksiyonları araştırmak için mükemmel bir model organizma sağlar. İnsanlar ve Drosophila arasındaki biyolojik yolakların, fiziksel özelliklerin ve hastalıkla ilişkili homolog genlerin yüksek korunumu, meyve sineğini molekülden davranışsal seviye^4'e ideal bir taklit haline getirir. Birçok hastalık modelinde, davranış eksikliği çeşitli insan nöropatileri için yararlı bir model sağlayan önemli bir indekstir ^5,6. Drosophila şimdi çoklu insan hastalıklarını, nörogelişimi ve Parkinson hastalığı ve amiyotrofik lateral skleroz ^7,8 gibi nörodejeneratif hastalıkları incelemek için kullanılmaktadır. Hastalık modellerinin motor yeteneğini saptamak, patojenik ilerlemeyi anlamak için çok önemlidir ve hastalık sürecinin altında yatan moleküler mekanizmalarla fenotipik bir korelasyon sağlayabilir.

Son zamanlarda, Drosophila lokomotor algılama stratejileri için, gruplandırılmış^sineklerde yüksek verim testi 9,10 ve gerçek zamanlı ^11,12'de hareket ölçümü gibi ticari olarak temin edilebilen yazılım araçları ve uygun maliyetli programlar geliştirilmiştir. Böyle bir geleneksel yaklaşım, aynı cinsiyet ve yaşa sahip büyük bir sinek popülasyonunun kapsanmasına izin veren ve ^9,13 veri toplarken çeşitliliği azaltan birden fazla kanal içeren tırmanma testi olarak da adlandırılan hızlı etkileşimli negatif jeotaksistir (RING). Lokomotor davranışı analiz etmek için bir başka ön test yöntemi, ince bir cam tüp¹⁴ içindeki sinek aktivitesi hareketini tespit etmek için birden fazla ışın kullanan bir cihaz olan TriKinetics Drosophila aktivite monitörüdür (DAM). Cihaz, daha uzun bir süre boyunca sineklerin aktivitesini ve sirkadiyen ritmini incelemek için ışın geçişlerini hesaplayarak otomatik hareketi temsil eden konumu sürekli olarak kaydeder¹⁵. Bu yöntemler, davranışsal hareketteki değişiklikleri belirlemek için meyve sineklerindeki davranışsal kusurların analizinde yaygın olarak kullanılmasına rağmen, her zaman özel test ekipmanı veya karmaşık analiz süreçleri gerektirir ve bazı modellerde uygulamalarını sınırlı, basit bir cihazla kısıtlar. FlyGrAM¹¹ ve Drosophila adası tahlil¹⁰ gibi yetişkin Drosophila'yı test etmek için hayvan izleme grubu tabanlı stratejiler, önceden tanımlanmış bir alanda sosyal işe alım ve bireysel izleme uygular. Bununla birlikte, meydan okunan alanlardaki sosyal bireysel kısıtlama, sineklerin çarpışması veya üst üste binmesinden kaynaklanan görüntülerdeki tanımlamalar üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olabilir. TRex¹⁶, MARGO¹² ve FlyPi¹⁷ gibi bazı açık kaynaklı materyal tabanlı yöntemlerin acil bir durumu olsa da, davranış testlerinde esnek kullanımla sinekleri hızlı bir şekilde izleyebilirler. Bu test yaklaşımları, ayrıntılı deneysel cihaz kurulumları, özel yazılım gereksinimleri veya profesyonel bilgisayar dilleri ile ilişkilidir. Larvalar için, birim^{zaman 18} başına ızgara sınır çizgilerinin sayısı boyunca kat edilen toplam mesafeyi ölçmek veya bireyler için vücut duvarı kasılmalarını manuel olarak¹⁹ olarak kabaca saymak, lokomotor yeteneklerini değerlendirmek için baskın yöntemlerdir. Ekipman veya cihazlarda ve analiz yöntemlerinde hassasiyet eksikliği nedeniyle, larvaların bazı davranışsal hareketleri tespit edilmekten kaçabilir ve davranışsal hareketin, özellikle de ince hareketin doğru bir şekilde değerlendirilmesini zorlaştırabilir¹⁵.

Mevcut geliştirilen yöntem, Fiji (ImageJ) görüntü işleme programı ile uyumlu AnimalTracker uygulama programlama arayüzünü (API) kullanarak, hem yetişkin hem de larva sineklerinin lokomotor aktivitesini, yüksek çözünürlüklü (HD) videolardan izleme davranışlarını analiz ederek sistematik olarak değerlendirmek için kullanmaktadır. Fiji, sağlam yazılım kütüphanelerini çok sayıda komut dosyası dili ile birleştirebilen, görüntü işleme algoritmalarının hızlı prototiplenmesiyle sonuçlanan ve görüntü analiz yetenekleri²⁰ için biyologlar arasında popüler hale getiren açık kaynaklı bir yazılım ImageJ dağıtımıdır. Mevcut yaklaşımda, Fiji'nin AnimalTracker API'sine entegrasyonu, kişiselleştirilmiş algoritma ekleme ile benzersiz bir Drosophila davranış testi geliştirmek için kullanılmaktadır ve lokomotor davranışın sağlam analitik yeteneklerini desteklemek için ayrıntılı dokümantasyon ve öğreticiler için yararlı bir adım sağlar (Şekil 1). Sineklerin çarpışması veya üst üste binmesinin neden olduğu görüntülerdeki nesnel tanımlamaların karmaşıklığını atlatmak için, her arena yalnızca bir sineğe ev sahipliği yapmakla sınırlıdır. Yaklaşımın izleme hassasiyetini değerlendirdikten sonra, genellikle Parkinson hastalığının hayvan modelleri için kullanılan toksik ilaç rotenon ile uygulanan Drosophila'nın lokomotor hareketlerini izlemek ve ölçmek için uygulandı ve sonuçta ilaç tedavisinde hareket bozukluğu keşfetti²¹. Açık kaynaklı ve özgür yazılım kullanan bu metodoloji, yüksek maliyetli enstrümantasyon gerektirmez ve Drosophila davranışsal hareketini hassas ve tekrarlanabilir bir şekilde analiz edebilir.

Protokol

Bu çalışmada W¹¹¹⁸ yetişkin sinek ve üçüncü instar larvaları kullanılmıştır.

1. Deneysel hazırlık

NOT: Drosophila hareket takibi için açık alan arenası, renksiz ve kokusuz silika jel ile yapılır.

1. Reaktif A ve reaktif B'yi, üreticinin silika kiti için talimatlarına göre 1:10 oranında karıştırın ( bkz. Renk beyaza dönene kadar karıştırarak karışıma sodyum bikarbonat eklendiğinden emin olun. Karışımı temiz bir Petri kabına aktarın ve 48 saat kuruması için 40 ° C'de bir fırına koyun.
2. HD kamerayı (bkz. Malzeme Tablosu) bir tripod üzerine yerleştirin ve kamera lensi silika arenanın yüzeyine dik olacak şekilde ayarlayın. Odak uzaklığını ve kameranın diyafram açıklıklarını ayarlayarak, kameranın silika yüzeyine odaklandığından ve ekranın yeterince aydınlatıldığından emin olun. Deney düzeneği Şekil 1'de gösterilmiştir.
3. En az 61 saniyelik sürekli bir video kaydetmek için açık alan arenasına bir sinek aktarın.
   NOT: Larvaların halsiz doğası göz önüne alındığında, 10 dakikadan fazla bir video kayıt süresi önerilir.
   1. Videoyu Fiji ile açın, ilerleme çubuğunu ilk kareye sürükleyin ve zımnen onaylayın. "Serbest el seçimi" aracını kullanarak sineğin tüm vücudunu seçin (Şekil 2B, C).
   2. Seçilen alanın gri değeri geniş arka plana yaklaşana kadar beyaz dengesini ayarlamak için parlaklığı ve kontrast>ı ayarlamak > görüntüyü tıklatın (Şekil 2D-F).
      NOT: İlk karenin arka plan homojenizasyonu, yazılımın arka planı herhangi bir nesne olmadan ayırt etmesini ve bir sinek olduğunda bir kontrast oluşturmasını sağlar, böylece yazılımın onu izlemesine izin verir.
4. Tüm deneyi 25 °C ve %60 bağıl nem olarak ayarlanmış bir test ortamında, sessiz ve parlak ışığa maruz kalmayan bir alanda gerçekleştirin.

2. Video kaydı ve ön işleme

1. % 95 karbondioksit (CO₂) kullanarak kısa bir anestezi süresinden sonra, açık dosyalanmış arenaya bir sinek aktarın ve video kaydını başlatmak için kamera uygulamasındaki kayıt düğmesine basın.
   NOT: Anestezinin hareket üzerindeki etkisini en aza indirmek için, video kaydına başlamadan önce sineklerin 10 dakika boyunca iyileşmesine izin verin. Soğutma yoluyla serin anestezi yapılması da önerilir.
   1. Sinekler anesteziden kurtulduktan sonra, sineği içeren arena tabağını kameranın altına koyun ve kayıt başladığında sineğin hareket halinde olduğundan emin olmak için plakayı bir yandan diğer yana hızlıca sallayın.
2. Kaydın tamamlanmasının ardından, video kaydını sonlandırmak için durdur düğmesine basın.
   NOT: Video kayıt süresinin hedef izleme süresini küçük bir farkla biraz aştığından emin olun. Ek olarak, deneysel verimliliği artırmak için, birden fazla sineği kendiliğinden izlemek mümkündür. Bu, yüksek kaliteli bir video kırpma sağlamak için kameranın çözünürlüğüne bağlıdır.
3. Kaydedilen videoları MJPEG kodlama ile AVI formatına dönüştürün, böylece Fiji kullanılarak açılabilir ve analiz edilebilirler. Bu arada, videonun saniyedeki kare sayısı (fps) hızını yetişkin sinekler için 15 fps ve larvalar için 12 fps olarak ayarlayın.

3. Video analizi

1. Videoyu Fiji ile açarken açılır pencerede iki seçenek olan "sanal yığın kullan" ve "gri tonlamaya dönüştür" ile dönüştürülen videoyu açın (Şekil 2A).
2. Yukarıda belirtildiği gibi boş bir ilk kare yapın.
3. AnimalTracker eklentisinin "etkin görüntüyü ayarla" aracını kullanarak bir işleme penceresi edinin ve "oval" aracını kullanarak orijinal video penceresindeki arenayı çevreleyen bir izleme alanı oluşturun (Şekil 3A).
4. İşleme penceresindeki ilk boş çerçeve için filtreleri (Şekil 3A,3) ve iki filtrenin parametrelerini (Şekil 4A-G) ayarlayın. Ardından, orijinal video penceresinde bir sonraki kareyi seçin ve işleme penceresinin filtrelenmiş yüzeyini seçin (Şekil 5A-C).
   NOT: Filtreleme adımı, görüntü gürültüsünü azaltmaya ve/veya arka planı kaldırmaya yarar, böylece çerçevelerin ikilileştirilmesinde ön planın arka plandan ayrılmasını kolaylaştırır.
5. Filtrelenmiş bir işleme penceresi seçildikten sonra, "eşik ayarla" aracını kullanarak izlenen sineği işleme penceresinde kaplı kırmızı bir profille çevirin (Şekil 3A,4, Şekil 5D-E ve Şekil 6A).
6. Bilgisayarın işleme penceresinde kırmızı bir profille sineği tanımasını sağlamak için "blob algılayıcısını ayarla" yı kullanın (Şekil 3A,5 ve Şekil 6B).
7. 901 karesini, videonun kayıt süresi ve fps ile hesaplanan yetişkin sineği için son kare olarak ayarlayın (Şekil 3A,6, Şekil 6C).
   NOT: Larvalarla yapılan aşağıdaki deney 10 dakika boyunca izlenmiştir, bu nedenle 7200 karesi son kare olarak ayarlanmıştır.
8. Orijinal video penceresinde bir izleme dikdörtgeni sunmak için "blobları göster" aracını kullanın (Şekil 3A,7 ve Şekil 6D,E). Ardından, izlemeyi başlatın ve izleme tamamlandıktan sonra izleme dosyasını dışa aktarın (Şekil 3A,8,9 ve Şekil 7A,B).

4. İzleme dosyası analizi

1. Hayvan izleyici > İzleme analizörü eklentisini kullanarak parça ve bölge dosyalarını yükleyin (Şekil 8A).
2. Bölge ayarlarını kullanarak istediğiniz dizini seçin ve parametre ayarlarını değiştirin (Şekil 8). Kare hızını kullanarak kare aralığının süresini hesaplayın.
   NOT: Bu durumda, kare hızı 15 fps'dir ve kare aralığı varsayılan ayar olan yaklaşık 0,067 sn'dir (Şekil 8D).
3. İzleme analizöründe analiz edildikten sonra elektronik tablo yazılımını ve GraphPad Prizma'yı kullanarak nicel analiz çizelgeleri oluşturun (Şekil 9).

5. Kare başına analiz

1. Kare aralığı başına hız analizi gerçekleştirin. Daha ayrıntılı araştırmaya ihtiyaç duyulursa, Fiji olmadan parça dosyasını analiz edin.
   1. İzleme dosyasını açın, tüm koordinatları Microsoft Office Excel'e kopyalayın ve boşluk tuşunu kullanarak hücreleri bölün.
      NOT: Örneğin, dosya "C" ve "D" sütunlarına bölündükten sonra, Drosophila'nın kare aralığı başına hızı, "E" sütununda gösterilen SQRT(( C5-C4)^2+(D5-D4)^2) formülüyle hesaplanır (Şekil 10A). "E" sütunundaki veriler, sineğin iki kare arasında hareket ettiği piksel sayısını gösterir ve ilk kare dikkate alınmaz. Hesaplanan tüm sonuçları seçin ve kare aralığı başına sezgisel bir sinek hareketi hızı sergilemek için çizgi grafikte bir tepe noktası olacak şekilde bir çizgi grafik ekleyin (Şekil 10B).
2. Kare aralığı başına hareketsizlik süresini hesaplayın. Dosya "C" ve "D" sütunlarına bölündükten sonra, "E" sütununda gösterilen IF(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1) formülünü kullanarak Drosophila'nın kare aralığı başına hareketsizlik durumunu hesaplayın. (Şekil 10C).
   NOT: Hız analizinden farklı olarak, ilk karenin sonuçları tanımlanmıştır. 20 pikselden daha az hareket eden sinekler hareketsiz olarak kabul edildi ve "E" sütununa "0" olarak kaydedildi.
   1. Hesaplanan tüm sonuçları seçin ve hareketsizlik süresini tüm sütun grafiğinin kenar boşluğuna göre görsel olarak görüntülemek için bir sütun grafiği ekleyin (Şekil 10D).
3. Yön açısının değiştiğinden emin olun.
   NOT: Yön değişim açısı analizi, sineklerin yön seçimini temsil eder. Dosya "C" ve "D" sütunlarına bölündükten sonra, yön değişikliği açısı ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*(SQRT((C7-C6)^ 2+(D7-D6)^2)))*180/PI())*180/PI())*180/PI()), "E" sütununda (Şekil 10E) sunulan formülle hesaplanır. Hesaplanan sonuçlar üç koordinat arasındaki açıyı gösterir.
   1. Hesaplanan tüm sonuçları seçin ve sineklerin hareketinin yön değişim açısını göstermek için bir dağılım diyagramı ekleyin (Şekil 10F).

Sonuçlar

Bu çalışmada, yetişkin sineklerde ve rotenon ile tedavi edilen üçüncü instar larvalarında lokomotor eksiklikler incelenmiş ve motor aktivitelerinde ilaç çözücü dimetil sülfoksit (DMSO) ile beslenen bir kontrol sineğininkiyle karşılaştırılmıştır. Drosophila'da rotenon ile tedavinin beyinde dopaminerjik nöron kaybına neden olduğu gösterilmiştir²² ve önemli lokomotor defisitlere yol açmaktadır²³. Şekil 11...

Tartışmalar

Fiji görüntü işleme programı ile uyumlu açık kaynaklı materyal AnimalTracker API'sine dayanarak, araştırmacıların hem yetişkin hem de bireysel larva sineklerini izleyerek lokomotor aktivitesini sistematik olarak değerlendirmelerini sağlayabilecek bir yöntem tasarladık. AnimalTracke , uygulama tarafından tasarlanan hayvan izleme davranışının analizini kolaylaştırmak için mevcut veritabanlarına veya diğer araçlara kolayca entegre edilebilen Java ile yazılmış bir araçtır

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal tracker	Hungarian Brain Research Program	version: 1.7	pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads
Camera software	Microsoft	version: 2021.105.10.0	built-in windows 10 system
Computer	DELL	Vostro-14-5480	a comupter running win 10 system is available
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation	Wu han Yihong technology	#YHDFPCO2-018	official website: http://www.yhkjwh.com/
Fiji software	Fiji team	version: 1.53v	official website: https://fiji.sc/
Format factory software	Pcfreetime	version: X64 5.4.5	official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html
Graph pad prism	GraphPad Software	version: 8.0.2	official website: https://www.graphpad-prism.cn
Hight definition camera	TTQ	Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm)	official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35
Office software	Microsoft	version: office 2019	official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office
Petri dish	Bkman	110301003	size: 60 mm
Silica gel	DOW	SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Mix well according to the instructions
Sodium bicarbonate	Macklin	#144-55-8	Mix well with silica gel